彭黎明, 蔣顯鋒

(大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院, 云南 大理 671003)

【研究意義】杜鵑花屬植物廣泛分布于中國各省市，具有較高的園藝觀賞價值。中國橫斷山區(qū)域是杜鵑花屬植物的現(xiàn)代分布中心和起源分化中心，全世界有約900種杜鵑花屬植物，其中橫斷山地區(qū)就擁有將近500種。中國雖然是杜鵑花屬植物的分布中心，擁有豐富的杜鵑花資源，但是對杜鵑花屬植物資源的整理、搜集和利用與西方國家相比仍然處于起步階段。目前，在中國花卉市場上的杜鵑花產(chǎn)品，大部分仍然是以歐洲或日本培育的品種為主。植物根系真菌能夠顯著的影響植物的養(yǎng)分利用效率，繼而影響植物的生長狀態(tài)[1-2]。菌根是指土壤中某些真菌與植物根的共生體，許多植物都具有自己特有的共生菌根(如蘭科、杜鵑花科、松科等)。如叢枝菌根(Arbuscular mycorrhiza，AM)、外生菌根(Ectomycorrhiza，ECM)、內(nèi)外生菌根(Ectendomycorrhiza，EEM)、蘭科植物菌根(Orchid mycorrhiza，OM)、歐石南類菌根或杜鵑花類菌根(Ericoid mycorrhiza，ERM)、漿果鵑類菌根(Arbutoid mycorrhiza，ARM)和水晶蘭類菌根(Monotropoid mycorrhiza，MM)[3]?！厩叭搜芯窟M展】植物根系真菌在許多杜鵑花屬植物中都曾有過報道[4]。唐燕等[5]從轎子雪山腋花杜鵑中分離出菌根真菌Cryptosporiopsisericae,Drescehlera,Periconia等。Gorzelak等[6]在加拿大落基山脈的越橘屬(Vaccinium)植物菌根中檢測出Phialocephalafortinii，Oidiodendronmaius，Neonectriaradicicola等內(nèi)生真菌。熊丹等[7]從黔中馬尾松林下的杜鵑花(Rhododendronsimsii)中通過高通量測序檢測出子囊菌門、接合菌門和擔(dān)子菌門等6門19綱103科154屬的根系真菌。根系真菌能提高杜鵑花科植物對于養(yǎng)分的利用效率，提高植物對于環(huán)境的適應(yīng)能力[8-9]。最近的研究表明杜鵑花類菌根真菌能增強杜鵑花科植物的耐鹽性[10]，并能使其適應(yīng)長時間的重度干旱脅迫環(huán)境[11]?！颈狙芯壳腥朦c】紅棕杜鵑(Rhododendronrubiginosum)是杜鵑花屬杜鵑組亮鱗杜鵑亞組的多年生常綠灌木，產(chǎn)于四川西南部、云南西北部至東北部、西藏東南，常成群落中的優(yōu)勢種。根系真菌會顯著影響杜鵑花灌叢的生存狀態(tài)，同時也是杜鵑花屬植物成功引種繁育的重要影響因素[12-13]。然而，紅棕杜鵑的根系真菌的多樣性與群落組成尚缺少研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究將基于大理馬耳山的紅棕杜鵑群落,并利用高通量測序技術(shù)，對紅棕杜鵑根系真菌多樣性開展研究，為該物種的成功引種馴化提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

馬耳山位于云南大理鶴慶縣與洱源縣交界(26°36′2633″N，100°10′1775″E)，海拔最高處3550 m。2019年8月采集馬耳山紅棕杜鵑群落30 m × 30 m樣方內(nèi)10株成年植株的須根，采集到的樣品帶回實驗室，用流水沖洗干凈去除表面泥沙，用乙醇和次氯酸鈉進行消毒后，將樣品用無菌水振蕩洗滌多次，清洗后的根系樣品置于無菌EP管中，每個樣品約2 g，并置于-80℃保存。

1.2 樣品建庫測序

樣品送北京擎科生物科技公司做進一步建庫測序。具體流程如下：提取樣品總DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序。高通量測序(Illumina HiSeq測序平臺)得到原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列，結(jié)果以FASTQ文件格式存儲，其中包含測序序列(Reads)的序列信息以及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 OTU劃分與真菌種類鑒定 使用Usearch軟件對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)，并基于UNITE(真菌)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學(xué)注釋。將OTU的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫進行比對可得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，進而在各分類水平統(tǒng)計各樣品群落組成。

1.3.2 樣品內(nèi)真菌多樣性分析 采用Alpha多樣性對樣品真菌多樣性進行描述。使用軟件Mothur(version v.1.30)，對樣品Alpha多樣性指數(shù)進行評估。

1.3.3 真菌生態(tài)功能分析 按照營養(yǎng)方式將真菌分為三大類：病理營養(yǎng)型(Pathotroph)，共生營養(yǎng)型(Symbiotroph)，腐生營養(yǎng)型(Saprotroph)。將三大類進一步又分為12類，成為Guilds。軟件FUNGuild(Fungi Functional Guild)是可用于解析真菌OTU的工具，基于該軟件對樣品進行生態(tài)功能分析。

1.3.4 真菌關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析 進行斯皮爾曼(Spearman)秩相關(guān)分析并篩選相關(guān)性大于0.1且P值小于0.05的數(shù)據(jù)構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，并基于Python繪制根系真菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棕杜鵑根系真菌的種類科屬分布

通過對10個紅棕杜鵑植株根系樣品的高通量測序，獲得了有效序列共587 644條，聚合后得到132個OTU，分屬于3門、11綱、22目、37科、42屬。通過物種分析，主要屬于子囊菌門(73.71%)、擔(dān)子菌門(17.81%)和球囊菌門(0.119%)。主要的綱有錘舌菌綱(60.52%)、傘菌綱(17.77%)、座囊菌綱(5.87%)、子囊菌綱(3.63%)、傘囊菌綱(1.52%)。主要的目有柔膜菌目(58.02%)、傘菌目(13.94%)、煤炱目(5.79%)、肉座菌目(3.44%)、糙孢孔目(1.96%)和刺盾炱目(1.49%)；主要的科有水盤菌科(27.95%)、晶杯菌科(16.18%)、口蘑科(9.96%)、粘毛囊菌科(6.56%)、叢赤殼科(3.27%)、暗色孢科(2.58%)和球蓋菇科(2.50%)；占比較高的屬有瓶頭霉屬(27.95%)、小杯傘屬(9.96%)、樹粉孢屬(6.56%)、土赤殼屬(3.27%)、粒毛盤菌屬(2.59%)、無柄盤屬(2.58%)和盔孢傘屬(2.50%)。

2.2 紅棕杜鵑根系真菌多樣性分析

Chao1和ACE指數(shù)用于衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性。相同物種豐度的情況下，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明樣品的物種多樣性越高。樣方內(nèi)10各植株的Alpha多樣性指數(shù)值統(tǒng)計如表1所示，植株2號、植株7號的香濃多樣性指數(shù)(Shannon diversity index)在樣品中最高，表明2個樣品具有相對較高的物種多樣性。各植株樣品的OTU數(shù)目在24～62，植株間共享OTU數(shù)目僅為2個，7號植株具有最多的特有OTU(13個)，3號、5號、9號、10號植株沒有特有OTU。

表1 馬耳山紅棕杜鵑根系共生真菌群落Alpha多樣性指數(shù)

2.3 紅棕杜鵑根系真菌的生態(tài)功能多樣性

根據(jù)FUNGuild分析可知，紅棕杜鵑根系真菌包括植物內(nèi)生菌，排泄物腐生菌，木質(zhì)腐生菌，蘭科根菌真菌等多種生態(tài)類型。在檢測到的結(jié)果中，糞殼菌綱和傘菌綱是主要的腐生型真菌，錘舌菌綱是主要的共生型真菌。本研究中的OTU1，OTU35，OTU73均屬于典型的植物內(nèi)生菌，OTU25和OTU69屬于蘭科菌根真菌。紅棕杜鵑根系真菌樣品中，杜鵑花類菌根真菌(ERM)在真菌群落的組成中占較少一部分，多數(shù)為各種類型的腐生菌和多種營養(yǎng)型的真菌(表2)。

表2 馬耳山紅棕杜鵑根系真菌生態(tài)功能分析

2.4 紅棕杜鵑根系真菌網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

圖1顯示，每個屬在平均豐度上都具有一個或多個與其存在關(guān)聯(lián)的屬。大多數(shù)屬之間呈正相關(guān)(如Dasyscyphella，Cordyceps和Entoloma)，只有少數(shù)幾個屬間呈負相關(guān)(Meliniomyces與Serendipita，Pezicula與Cephalotheca，Chactospacria與Phialocephala，Phialocephala與Solicoccozyma，Chactospacria與Cystofilobasidium)。該關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)具有39個節(jié)點，89個連接，具有較高的模塊度(0.531)和嵌套性(0.395)。

圓圈代表物種，圓圈大小代表物種平均豐度大小；線條代表兩物種間相關(guān)，線的粗細代表相關(guān)性的強弱。橙色代表正相關(guān)，綠色代表負相關(guān)

3 討 論

3.1 群落組成多樣性

根部真菌會顯著影響共生植物的養(yǎng)分利用效率，進而決定了植物適應(yīng)外部環(huán)境的能力，并可能影響植物的多樣性、群落結(jié)構(gòu)與生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性[14]。本研究通過對10個紅棕杜鵑個體的高通量測序，獲得了滇西北優(yōu)勢杜鵑物種的根系真菌序列共587 644條，聚合后得到132個OTU，分屬于3門、11綱、22目、37科、42屬。與相同區(qū)域的其他杜鵑花屬植物相比，大理馬耳山紅棕杜鵑根系的真菌群落表現(xiàn)出較為豐富的多樣性，但相比起亞熱帶地區(qū)杜鵑群落的根系真菌多樣性明顯較低。

典型的杜鵑花類菌根真菌(ERM)有瓶頭霉屬(27.95%)和樹粉孢屬(6.38%)。此外,柔膜菌目的Rhizodermea屬和無柄盤屬都曾被國內(nèi)外學(xué)者從杜鵑花科植物菌根上分離出來，且被證實為杜鵑花類根菌。有研究表明Rhizodermea屬的成員能夠與針葉樹和杜鵑花科植物形成菌根[15-16]，并有助于形成用于植物根系之間的養(yǎng)分交換的菌絲網(wǎng)絡(luò)[17-18]。國內(nèi)外關(guān)于杜鵑花菌根真菌的研究中，徐勝男等[19]在貴州百里的馬纓杜鵑根菌中，黃彩微等[20]在涼山州龍肘山銹紅杜鵑與薄葉馬銀花根部中，以及在阿根廷巴塔哥尼亞的白珠樹屬(Gaultheria)的植物菌根中[21]均檢測到樹粉孢屬的真菌，可見樹粉孢屬是一種廣泛存在于世界各地杜鵑花科植物中的ERM真菌。劉振華等[22]在大理的灰背杜鵑根菌中分離出了Phialocephalafortinii，此外還分離出了Cryptosporiopsisericae。Cryptosporiopsis類真菌也是一種常見的ERM類型真菌，多次被國內(nèi)研究者從各種杜鵑花科植物根菌中分離出來。如劉亞等[23]在浙江大盤山映山紅菌根中，唐燕等[5]在云南轎子山腋花杜鵑(Rhododendronracemosum)菌根中，劉仁陽等[24]從貴州梵凈山雷山杜鵑菌根中均分離出此類真菌。而此次在大理馬耳山紅棕杜鵑根部真菌中并未發(fā)現(xiàn)Cryptosporiopsis類真菌，推測可能是由于該類真菌具有一定的寄主專一性。

3.2 生態(tài)功能多樣性

不同生態(tài)類型的真菌采取不同的生存策略且具備不同的營養(yǎng)型，對宿主和環(huán)境都會產(chǎn)生不同的影響[3]。本研究中的OTU1，OTU35，OTU73均屬于典型的植物內(nèi)生菌，該類真菌廣泛地寄生于各種水生及陸生植物。感染內(nèi)生菌的植株往往比未感染內(nèi)生菌的植株更具生存競爭力，并表現(xiàn)出生長快速，抗病害，抗動物危害等生存優(yōu)勢[25]。最近的研究表明，根部內(nèi)生真菌還會影響植物對金屬脅迫的耐受性，改善植物的生長和生理[26]。OTU25和OTU69屬于蘭科菌根真菌，該類真菌除了廣泛地寄生蘭科植物外，也會選擇杜鵑花科植物作為宿主。蘭科菌根真菌有著促進蘭科植物種子萌發(fā)，苗的形態(tài)建成，增強植物生態(tài)競爭力和抗逆性，幫助植物克服不良生境等生態(tài)功能[27-28]。另一種常見的真菌生態(tài)類型為腐生營養(yǎng)型(Saprotroph)，腐生營養(yǎng)型又可細分為排泄物腐生菌(OTU74)，葉腐生菌(OTU66)，土壤腐生菌(OTU85)，木質(zhì)腐生菌(OTU154)等。還有大量未定義腐生菌(Undefined Saprotroph)，主要屬于子囊菌門和擔(dān)子菌門。研究發(fā)現(xiàn)紅棕杜鵑大量內(nèi)生真菌表現(xiàn)為多種營養(yǎng)型的組合而并非某種單一的生態(tài)類型。如OTU142的Phoma表現(xiàn)為植物內(nèi)生菌—排泄物腐生菌—地衣寄生菌—凋落物腐生菌—植物病原菌—土壤腐生菌—木質(zhì)腐生菌多種生態(tài)類型。其原因可能是由于真菌為適應(yīng)復(fù)雜多變的生存條件而選擇了與之對應(yīng)的生存策略。在馬耳山紅棕杜鵑的根部也檢測出了例如傘菌目的外生菌根真菌(ECM)。此外，動物病原菌也在多個OTU中被檢測出來，它們與各種腐生菌和寄生菌組成了多功能的營養(yǎng)型。

總的來看，杜鵑花類菌根真菌(ERM)在真菌群落的組成中只占很少一部分，而大多數(shù)為各種類型的腐生菌和擁有多種營養(yǎng)型的真菌。盡管多種不同生態(tài)類型的真菌可以共存于同一植物根系中，但也有研究表明，ECM、ERM、病原菌或其他生態(tài)類型的不同真菌物種在植物根系中可能存在競爭[29]。這也為文中的少數(shù)幾個屬在平均豐度上呈負相關(guān)提供了可能的解釋。植物根系的內(nèi)生真菌與其宿主間形成了一種動態(tài)平衡的關(guān)系，真菌群落在植物生長不同階段也表現(xiàn)出不同的功能[30]。此外，豐富的真菌生態(tài)功能多樣性也對生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定起到積極的作用[31]，并提高地上植物的生產(chǎn)力[32]。

4 結(jié) 論

本研究共檢測出紅棕杜鵑根系真菌群落包括杜鵑花類菌根真菌、蘭科植物菌根真菌、腐生真菌、病原真菌、寄生真菌等多種生態(tài)類型的真菌，表明該杜鵑屬植物具有較豐富的根系真菌生態(tài)類型。由于較高的真菌豐富度同時也意味著在該杜鵑引種栽培的過程中必須要考慮根系真菌的影響。由于采樣海拔較高，因此紅棕杜鵑根系真菌多樣性明顯低于低海拔地區(qū)。本試驗為紅棕杜鵑物種保育、生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定和引種栽培提供了一定的科學(xué)借鑒價值。