陳爽，張翅鵬，黃臣臣，張凱璇，楊澤延，羅江蘭

（1.貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴陽550025；2.喀斯特地質(zhì)資源與環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽550025；3.貴州喀斯特環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)教育部野外科學(xué)觀測研究站，貴陽550025）

類金屬砷（As）廣泛存在于土壤、水、巖石中，我國土壤中As平均含量為10 mg·kg。但礦物不合理開采、農(nóng)藥使用、金屬冶煉等人為活動(dòng)，導(dǎo)致As 釋放到周圍環(huán)境中，As 進(jìn)入農(nóng)田后，不僅影響水稻安全生產(chǎn)，還可通過食物鏈對(duì)人類健康造成嚴(yán)重的危害。土壤膠體具有帶電性、比表面積大、吸附能力強(qiáng)等特點(diǎn)，對(duì)土壤中As 的遷移轉(zhuǎn)化有著重要作用，其性質(zhì)隨土壤環(huán)境條件的變化而發(fā)生改變，從而也會(huì)影響到As的生物環(huán)境地球化學(xué)行為。

本研究在前人研究微生物異化還原鐵氧化物的基礎(chǔ)上，通過提取土壤菌懸液在不同pH 條件下作用于載As土壤膠體，開展厭氧培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，著重分析了微生物在含As 土壤膠體釋放As 過程中的作用，同時(shí)討論了培養(yǎng)過程中pH 變化對(duì)微生物的影響，進(jìn)而探討其對(duì)膠體Fe 還原及As 釋放過程的作用，以揭示在微生物驅(qū)動(dòng)下土壤膠體中As 還原釋放的地球化學(xué)特征，為土壤As污染防治提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 載As土壤膠體的制備

供試土壤采自貴州省黔西南州興仁市交樂村石頭寨水庫下游水稻田。選擇水庫下游河流周邊3 個(gè)農(nóng)田土壤理化性質(zhì)基本一致的水稻土進(jìn)行采樣，使用便攜式不擾動(dòng)土壤采樣器采集0～20 cm 表層土，均勻混合后利用沉淀虹吸分離法提取土壤膠體，反復(fù)提取土壤懸液中膠體顆粒，直至溶液上層澄清。提取完畢后離心濃縮，冷凍干燥后保存?zhèn)溆?，其基本理化性質(zhì)如表1所示。

表1 土壤膠體基本性質(zhì)Table 1 Basic characteristics of soil colloid

稱取25 g 土壤膠體，加入500 mL 1 000 mg·L的As（Ⅴ）溶液，放置于溫度為25 ℃、振蕩條件為180 r·min的恒溫振蕩器中振蕩24 h，隨后以6 000 r·min的轉(zhuǎn)速離心10 min，再用超純水洗滌5 次后冷凍干燥，研磨過200目篩后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 土壤微生物分布及菌懸液的提取

將混合均勻的新鮮土壤樣品送至上海生工生物科技有限公司進(jìn)行微生物種群的測定，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后借助Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)分析。如表2所示，豐度較高的菌屬包括酸桿菌門（、、、、、、）、、厭氧黏細(xì)菌（）、芽單胞菌屬（）、鞘氨醇單胞菌屬（），其分別占比為23.53%、2.63%、3.23%、3.14%、3.16%。水稻土中含有豐富的鐵還原菌，共檢測出11種，占微生物總數(shù)的4.90%。其中豐度較高的菌屬是地桿菌（，1.35%）和厭氧黏細(xì)菌（3.23%）。有研究表明地桿菌和厭氧黏細(xì)菌及酸桿菌均具有異化還原鐵的能力。稱取10 g 新鮮土壤放置于250 mL 三角燒瓶中，加入0.10%焦磷酸鈉溶液，在180 r·min的恒溫振蕩器中振蕩30 min后靜置30 min，上清液為土壤菌懸液。

表2 水稻土微生物菌屬的分布（%）Table 2 Distribution of paddy soil microbial genera（%）

1.1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（Minimal salt medium，MSM）的配制：KHPO0.14 g·L，NHCl 0.25 g·L，KCl 0.5 g·L，NaCl 1.0 g·L，CaCl·2HO 0.13 g·L，MgCl·HO 0.62 g·L，（NH）SO0.5 g·L，乙酸鈉2 mol·L。用1 mol·L的NaOH 調(diào)節(jié)pH為7，配制完成后放置在溫度為121 ℃、壓力為0.105 MPa 的高溫滅菌鍋中滅菌20 min。

1.2 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

稱取載As（V）水稻土膠體0.20 g 于50 mL 具塞厭氧瓶中，用高壓滅菌鍋在溫度為121 ℃、壓力為0.105 MPa下滅菌21 min?？瞻滋幚斫M（KB）：加入25 mL 2×MSM+25 mL 滅菌去離子水；菌懸液處理（JX）：加入25 mL 2×MSM+土壤菌懸液25 mL。采樣地區(qū)水稻土pH 范圍為3～7，因此分別調(diào)節(jié)初始pH 為3（KB-3、JX-3）和7（KB-7、JX-7）。置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，在第1、3、7、14、21、28 天利用WTW（Multi 3430）水質(zhì)參數(shù)儀測定系統(tǒng)中的pH 和Eh。以上操作均在厭氧操作箱中進(jìn)行。

1.3 化學(xué)分析

Fe含量按照FREDRICKSON 等的鹽酸酸洗法測定：取5 mL搖勻后的水土混合液，加入5 mL 1 mol·L的HCl，密閉，在30 ℃、170 r·min搖床中溶解1 h后離心分離，取上清液，加入鄰菲啰啉和緩沖液顯色10 min，用紫外分光光度計(jì)測定，檢測波長為510 nm。

液相中總As 含量采用《水質(zhì) 汞、砷、硒、鉍和銻的測定 原子熒光法》（HJ 694—2014）中的方法測定，使用氫化物原子熒光光譜儀（AFS-9700）測定，先用國家As 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制1 000 mg·L的As 標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過稀釋得到不同含量As 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以含量為橫坐標(biāo)，熒光峰高為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。As（Ⅲ）采取許珺輝等的方法測定，土壤膠體懸液用0.22μm濾膜過濾，使用高效液相色譜原子熒光聯(lián)用儀（北京科創(chuàng)海光儀器有限公司，HPLC-AFS 9700）測定液相中As（Ⅲ）的含量，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液（稱取磷酸氫二鈉1.790 8 g和磷酸二氫鉀6.052 g，置于容量瓶中用超純水稀釋至1 L，用0.22μm 濾膜進(jìn)行抽濾，超聲15 min 脫氣后使用）；載氣流量400 mL·min；屏蔽氣流量600 mL·min；蠕動(dòng)泵速80 mL·min。As（Ⅴ）含量由液相中總As含量減去As（Ⅲ）含量得到。

1.4 數(shù)據(jù)處理

為得到As 釋放最大速率及其所需時(shí)間，采用描述微生物生長動(dòng)力學(xué)的Logistic 方程對(duì)不同處理As累積含量和時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行擬合。Logistic方程為：

式中：為不同時(shí)刻As 的含量，mg·L；為反應(yīng)時(shí)間，d；為As 釋放的最大潛勢，mg·L；為反應(yīng)速率常數(shù)；為模型參數(shù)。0.25為As 最大釋放速率（），mg·L·d；ln/為最大釋放速率對(duì)應(yīng)的時(shí)間（T），d。

使用SPSS 21.0 對(duì)總As 和Fe（Ⅱ）含量變化分別與培養(yǎng)時(shí)間和有無細(xì)菌進(jìn)行雙因素方差分析。利用Microsoft Excel 2010和Origin 2018等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析及圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 含As水稻土膠體懸液pH和Eh的變化

KB 與JX 處理的膠體懸液pH 隨厭氧培養(yǎng)時(shí)間增加均呈上升的趨勢（圖1），至第28天，初始pH=3體系pH 分別增加0.22、0.18，初始pH=7 體系分別增加0.67、1.12。對(duì)比兩體系KB 與JX 處理組pH 變化發(fā)現(xiàn)，JX-3 處理組pH 低于KB-3，而JX-7 處理組pH 高于KB-7，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)較KB-7處理組高0.45。各處理組Eh 隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行呈下降現(xiàn)象。KB-3 與JX-3 處理膠體懸液初始Eh 分別為239 mV 和240 mV，培養(yǎng)至28 d 時(shí)分別下降了10、9 mV，總體上Eh 變化較??；KB-7 與JX-7 處理膠體懸液初始Eh 分別為1 mV 和5 mV，3 d 后均為負(fù)值，呈還原狀態(tài)，直至28 d 時(shí)分別降低了30 mV和60 mV（圖1）。Nernst方程體系中pH每增加1 個(gè)單位，氧化還原電位降低59 mV，因此初始pH 越低、Eh 越高，越不利于形成還原環(huán)境?？傊c無菌組相比，在中性條件下微生物活動(dòng)有助于土壤膠體懸液中pH 升高、Eh 降低，這會(huì)對(duì)膠體中Fe 和As 的生物地球化學(xué)循環(huán)有潛在影響。

圖1 不同初始pH條件下膠體懸液中pH與Eh的變化Figure 1 Changes of pH and Eh in colloidal suspension under different initial pH conditions

2.2 水稻土膠體中鐵氧化物的還原

微生物活動(dòng)是影響土壤礦物轉(zhuǎn)化的主要因素之一，鐵氧化物作為電子受體，可被還原溶解，產(chǎn)生菱鐵礦、藍(lán)鐵礦、磁鐵礦和綠銹等各種含F(xiàn)e的礦物。在不同初始pH 條件下，KB 與JX 處理的Fe含量均隨厭氧培養(yǎng)時(shí)間的增加呈逐漸增大趨勢（圖2），不同體系下Fe含量的離散程度均較高，尤其是JX-7處理。在微生物作用下，JX-3處理組土壤膠體懸液中Fe含量高于KB-3 處理，第28 天時(shí)高出1.68 mg·L，約為KB-3的1.13倍；同時(shí)JX-7處理組微生物作用更加明顯，第28 天時(shí)比KB-7 處理組高出13.59 mg·L，是其2.80 倍。雙因素方差分析主體間效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果也顯示，不同初始pH 下KB 與JX 處理Fe 還原均呈現(xiàn)顯著差異（＜0.05）；時(shí)間的變化對(duì)強(qiáng)酸條件下Fe 還原有顯著影響（＜0.01），但對(duì)中性條件下Fe 還原無顯著影響（表3），表明微生物的作用有利于Fe還原。厭氧培養(yǎng)前3 d，JX-7 處理組Fe增加量與JX-3 處理組相比較低，培養(yǎng)至第7 天時(shí)，JX-7 處理組Fe含量為15.45 mg·L，比JX-3 處理組高8.34 mg·L，在第21～28 d，pH=7 體系中Fe還原量出現(xiàn)減緩現(xiàn)象（圖2）。分析認(rèn)為在較低pH 條件下，鐵氧化物還原轉(zhuǎn)化過程中物理化學(xué)轉(zhuǎn)化起主要作用，而在較高pH 條件下生物轉(zhuǎn)化作用顯著。因此，在厭氧環(huán)境中，微生物作用有助于土壤膠體中鐵氧化物的還原轉(zhuǎn)化，在近中性條件下作用更加明顯。

圖2 不同初始pH條件下膠體懸液中Fe2+含量變化Figure 2 Change of Fe2+content in colloidal suspension under different initial pH conditions

表3 時(shí)間變化與有無細(xì)菌處理對(duì)鐵還原影響的雙因素方差分析Table 3 A two-factor ANOVA of time variation and presence or absence of bacterial treatments on iron reduction

2.3 水稻土膠體中As的釋放

不同初始pH 條件下含As 膠體懸液中As 含量變化趨勢如圖3 所示。初始pH=3 時(shí)，厭氧培養(yǎng)1 d 后，KB、JX 處理組總As含量急劇增加，由原始溶液0 mg·L分別增至2.26、2.62 mg·L，之后隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，總As 含量變化趨于平緩，直至第28 天時(shí)出現(xiàn)下降現(xiàn)象。初始pH=7 時(shí)，KB、JX 處理組總As 含量隨厭氧培養(yǎng)時(shí)間推移呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，至第28 天，KB-7 與JX-7 處理組總As 釋放量分別是初始pH=3的1.5、1.6 倍。表明在強(qiáng)酸環(huán)境中水溶態(tài)As 可在短時(shí)間內(nèi)被迅速淋溶釋放，而在中性環(huán)境中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，懸液的pH 升高和Eh 降低有利于Fe還原，進(jìn)而促進(jìn)As 的釋放。雙因素方差分析結(jié)果顯示，兩個(gè)體系中不僅KB 與JX 處理組總As 含量均呈現(xiàn)顯著差異（＜0.05），而且在初始pH=7體系中，不同時(shí)間的總As 含量也呈現(xiàn)顯著差異（=0.02）（表4）。對(duì)懸液中總As累積含量隨培養(yǎng)時(shí)間變化進(jìn)行Logistic擬合，兩處理組間差異達(dá)到顯著水平（＜0.05）；初始pH=3處理體系中，第0天時(shí)As釋放速率達(dá)到最大，尤其是JX-3 組As 的達(dá)到0.26 mg·L·d，隨著初始pH 的提高，As 達(dá)到的培養(yǎng)時(shí)間延長至第2 天，值與JX-3 相比也有所降低（表5）。擬合結(jié)果中不同處理的值在2.78～5.30 mg·L之間，占厭氧培養(yǎng)過程中As最大釋放量的95.5%～102.5%?？梢姴煌绞教幚砭苁鼓z體中As 釋放，但膠體懸液中As 釋放速率及其所需要的時(shí)間有所差異。因此，含As 水稻土中As的遷移與pH變化和微生物活動(dòng)密切相關(guān)。

表4 時(shí)間變化與有無細(xì)菌處理對(duì)As釋放影響的雙因素方差分析Table 4 A two-factor ANOVA of time variation and presence or absence of bacterial treatment on arsenic release

表5 不同初始pH條件下膠體懸液中總As釋放Logistic擬合結(jié)果（n=6）Table 5 Logistic fitting results of total As release in colloidal suspension under different initial pH conditions（n=6）

在厭氧培養(yǎng)過程中，As 以三價(jià)和五價(jià)兩種形態(tài)在液相中存在（圖3）。初始pH=3 時(shí)前期為As（Ⅴ），隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行有As（Ⅲ）出現(xiàn)，但含量較低，KB-3和JX-3 處理組中As（Ⅲ）含量均低于0.50 mg·L，至第28天，As（Ⅲ）分別約占總As釋放量的11.63%和9.43%；初始pH=7 時(shí)，KB-7 和JX-7 處理組中As（Ⅲ）含量明顯增大，在實(shí)驗(yàn)過程中其含量分別介于0.21～3.54、1.18～4.09 mg·L之間，其中JX 處理組在培養(yǎng)過程中As（Ⅲ）釋放量均大于KB組，培養(yǎng)至第28天時(shí)As（Ⅲ）濃度相對(duì)KB 組增加0.55 mg·L。總之，在酸性條件下As 主要以As（Ⅴ）存在于膠體懸液中，而在中性條件下釋放的As（Ⅴ）大部分被還原為As（Ⅲ）。

圖3 不同初始pH條件下膠體懸液中As含量變化Figure 3 Changes in the concentration of arsenic species in colloidal suspension under different initial pH conditions

3 討論

3.1 水稻土膠體懸液pH、Eh的變化

厭氧培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過程中，還原環(huán)境下的鐵礦物與有機(jī)質(zhì)氧化分解產(chǎn)生的還原性物質(zhì)強(qiáng)烈作用，將會(huì)消耗H，使不同初始pH 處理土壤膠體懸液的pH 均上升。反應(yīng)式為：

在初始pH=3 體系中，后期有菌組pH 低于無菌組，而在中性條件下異化還原鐵氧化物過程中會(huì)消耗更多的質(zhì)子，pH 上升幅度較大，因此，中性膠體懸液更適合微生物的生長。兩個(gè)體系Eh變化也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。在強(qiáng)酸性條件下，微生物群落活動(dòng)相對(duì)較弱，JX 處理膠體懸液Eh 變化與KB 處理差異較小，而在中性條件下微生物活性較強(qiáng)，呼吸作用使Eh 明顯降低。所以，水稻土膠體懸液中pH 與Eh的變化主要是由微生物活動(dòng)引起的。

3.2 pH變化對(duì)膠體中Fe還原的影響

有機(jī)質(zhì)分解及微生物活動(dòng)使水稻土膠體懸液pH發(fā)生變化，這將會(huì)影響Fe 的還原溶解。本研究中水稻土膠體含有豐富的Fe，含量高達(dá)37.90 g·kg（表1），低pH 有利于溶解膠體中的鐵氧化物并釋放Fe，而O/HO 的氧化還原電位（820 mV）和Fe/Fe（770 mV）相接近，這有利于微生物利用溶解釋放的Fe進(jìn)行呼吸獲能，從而發(fā)生異化還原。因此，初始pH=3體系培養(yǎng)前期Fe 還原能力較強(qiáng)。同時(shí)不同初始pH體系中Fe 異化還原能力也可間接反映懸液中微生物群落及活性的變化。本研究供試水稻土含有豐富的鐵還原菌，其中地桿菌、厭氧黏細(xì)菌分別占比為1.35%、3.23%。這兩類細(xì)菌在pH 介于4～9 之間均可發(fā)生Fe 的異化還原，pH 為7 時(shí)還原量達(dá)到最大，但過低的pH 會(huì)抑制這兩類細(xì)菌的生長。也有研究表明鐵還原菌在中性環(huán)境中的數(shù)量遠(yuǎn)高于酸性條件下。因此，結(jié)合本文JX-7 與JX-3 處理組Fe濃度變化，推測認(rèn)為在中性溶液中鐵還原菌對(duì)Fe 異化還原起主導(dǎo)作用，低pH 條件下，微生物還原Fe 的能力受到抑制，不利于Fe 的異化還原。但JX-7 處理后期Fe 還原速率趨于平緩，這是由于細(xì)菌細(xì)胞表面在中性環(huán)境中一般帶負(fù)電荷，隨著初始pH=7 體系中Fe含量增多，F(xiàn)e可在細(xì)菌與鐵礦物表面發(fā)生靜電吸附，減少電子穿梭體與鐵氧化物和微生物的接觸位點(diǎn)，不利于異化反應(yīng)的進(jìn)行，從而減弱Fe 的還原轉(zhuǎn)化。

3.3 膠體中As的釋放與pH及Fe還原的關(guān)系

鐵氧化物的還原溶解及pH的改變對(duì)膠體中負(fù)載As 的釋放有著顯著影響。相關(guān)性分析顯示，在兩種初始pH 條件下pH 的變化均與Fe濃度呈顯著正相關(guān)（表6），表明體系pH 的變化與鐵氧化物的還原轉(zhuǎn)化有著密切關(guān)系。同時(shí)還原產(chǎn)生的Fe量與釋放的總As 量也呈顯著正相關(guān)，表明釋放的As 主要來自膠體中鐵氧化物中負(fù)載的As。WANG等的研究表明，水稻土中鐵還原菌的豐度與Fe和As 釋放量緊密相關(guān)。也有研究提出，微生物能夠還原溶解結(jié)晶度低的鐵氧化物，并將其轉(zhuǎn)化為表面積更小的次生礦物，從而使提供的吸附位點(diǎn)減少，導(dǎo)致As 的釋放。因此，自然環(huán)境中Fe 的循環(huán)轉(zhuǎn)化可影響As 的遷移轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響As的生物可利用性。在初始pH=7條件下，JX-7 處理組受微生物轉(zhuǎn)化作用Fe產(chǎn)生量較大，對(duì)pH 和總As影響更加顯著，兩參數(shù)間也具有顯著正相關(guān)關(guān)系；且在該初始條件下，釋放的As以還原態(tài)為主，As（Ⅲ）的濃度與pH 和Fe濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明膠體中鐵氧化物還原轉(zhuǎn)化對(duì)懸液酸堿性的改變也會(huì)對(duì)釋放的As形態(tài)有一定影響。

表6 不同初始pH條件下膠體懸液中不同參數(shù)間的相關(guān)性Table 6 Correlation among different parameters in colloidal suspension under different initial pH conditions

4 結(jié)論

（1）初始pH 的設(shè)定對(duì)含As 土壤膠體中鐵氧化物還原及As釋放均有顯著影響。在pH 為3 和7 的條件下，膠體懸液的pH、Eh 在微生物的介導(dǎo)下均發(fā)生變化，初始pH=3 時(shí)不利于微生物的生長，pH 與Eh 變化不明顯，懸液中釋放的As 主要為As（Ⅴ）；但在pH=7條件下，微生物活動(dòng)增強(qiáng)并形成強(qiáng)還原環(huán)境，pH 上升，促進(jìn)鐵還原，造成吸附態(tài)As 向溶解態(tài)轉(zhuǎn)化，從而釋放As（Ⅲ）。

（2）Fe與As存在耦合釋放關(guān)系，初始pH 與膠體懸液中Fe、總As 呈顯著正相關(guān)關(guān)系，F(xiàn)e與總As 也呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，且在中性環(huán)境中鐵還原與As 釋放效果更好。

（3）在中性環(huán)境條件下含As 土壤膠體中As 的釋放受微生物對(duì)鐵氧化物異化還原過程影響較大。