“脾主肌肉”與“線粒體質(zhì)量控制”相關(guān)性研究*

文穎娟 陳茉 趙歡 陳麗娟 王江

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

重癥肌無力(Myasthenia gravis，MG)主要是由抗體介導(dǎo)的獲得性神經(jīng)-肌肉接頭傳遞障礙的自身免疫性疾病，以眼肌或全身肌無力為主要臨床表現(xiàn)，研究表明，乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AchR)抗體是MG發(fā)病的關(guān)鍵[1]，據(jù)統(tǒng)計，MG全球患病率為(150～250)/百萬[2]，我國MG發(fā)病率為0.68/10萬，各個年齡段均可發(fā)病，兒童及青少年MG患病高達50%[3]。臨床主要采取膽堿酯酶抑制劑、免疫抑制劑、補體抑制劑、生物制劑等藥物治療手段[4]，雖在一定程度上緩解患者臨床癥狀，但長期服藥患者易出現(xiàn)股骨頭壞死、肝腎功能損害、內(nèi)分泌系統(tǒng)失衡以及精神障礙等一系列不良反應(yīng)，且部分患者會誘發(fā)MG危象，危及生命。

MG以全身肌肉病變?yōu)橹?，屬于中醫(yī)“痿證”范疇?；凇捌⒅骷∪狻?，痿證雖有痰濁、水濕、瘀血等濁邪堆積，卻以脾虛為發(fā)病之本；線粒體是機體的動力工廠，MG雖以過量AchR抗體堆積以病理表現(xiàn)，而其深層次機制可能以線粒體功能失常為主。故統(tǒng)一于“痿證”與MG 的“脾-肌肉-線粒體”密切相關(guān)，而線粒體功能失常，可能取決于線粒體質(zhì)量控制(Mitochondrial quality control，MQC)，既有其形成的源頭如骨骼肌干細胞異常，又有其自身的融合與裂解、自噬與修復(fù)等的復(fù)雜因素影響。故線粒體質(zhì)量控制的多樣性決定了中醫(yī)學(xué)“痿證”的發(fā)病圍繞脾虛可能有豐富的內(nèi)涵，故圍繞“脾-肌肉-線粒體質(zhì)量控制”的研究指導(dǎo)MG臨床可能更有針對性。

1 基于“脾主肌肉”的前期研究為“脾-肌肉-線粒體質(zhì)量控制”奠定了堅實基礎(chǔ)

1.1文獻研究顯示葛根具有輸肌以散邪與升精以濡養(yǎng)機體之功 脾胃為人體氣血生化之源。“脾主肌肉”，是指全身肌肉的運動變化均與脾的臟腑功能變化密切相關(guān)，肌肉運動來源于脾所化生的精微物質(zhì)，故肌肉運動失?？赏ㄟ^調(diào)理脾胃功能而得以緩解甚至治愈。中醫(yī)歸經(jīng)理論指出，某種藥物對某些臟腑經(jīng)絡(luò)的病變起主要或特殊作用，而對其他臟腑經(jīng)絡(luò)則作用較少，故中醫(yī)臨床常以歸脾胃經(jīng)藥物來調(diào)理脾胃功能。我們前期文獻研究表明：歸脾胃經(jīng)藥物葛根，具有祛邪(如解肌、生津、退熱、透疹等)和扶助正氣(升精、止渴)的雙重功效[5-6]。

基于“脾主肌肉”理論，葛根祛邪(和扶正)功能發(fā)揮的靶點可能在肌肉，而本草書籍對于葛根解肌升津之功效早有記載，如《藥類法象》載：“葛根，治脾胃虛而渴，善解酒毒，通行足陽明脈經(jīng)之藥”；《本草乘雅半偈》載：“葛根，作用部位在肌分；解廣義之痹，諸痹、諸毒、陰氣不起皆為痹?！蓖瑫r肌肉遍布全身，葛根通過輸肌以散邪(即促進肌肉的運動以祛除濁邪)，亦可升發(fā)脾氣、布散精津，為全身肌肉提供能量，而其配伍不同可能作用不同，且作用于平滑肌、心肌等不同肌肉部位[5-7]。

1.2實驗研究顯示葛根隨配伍不同，作用于不同的肌層 鑒此，課題組立足“脾主肌肉”，結(jié)合對“線粒體”研究，分別探討了葛根與黃芩、黃連等配伍對結(jié)腸平滑肌的作用，葛根與瓜蔞、薤白、丹參等配伍對心肌作用的實驗研究，研究結(jié)果顯示：葛根能夠促進胃腸平滑肌運動，治療潰瘍性結(jié)腸炎效果明顯[8-9]；葛根及其配伍可通過調(diào)節(jié)心肌線粒體功能，改善心肌纖維化，治療糖尿病心肌病[10-13]。

1.3基于“脾-肌肉-線粒體”，葛根及其配伍可作用于重癥肌無力骨骼肌線粒體 葛根是否作用于骨骼??？重癥肌無力是以骨骼肌的運動失常為主，中藥葛根既能夠升發(fā)脾氣以輸布津液，又可輸散以調(diào)節(jié)肌肉的運動變化，是否能夠作為重癥肌無力治療的主藥?現(xiàn)代名老中醫(yī)周仲瑛[14]、裘昌林[15]、李聲岳[16]等均以葛根為主配伍治療重癥肌無力，均為開展以葛根為主治療重癥肌無力研究提供有力佐證。

故此，課題組以MG為切入點，針對MG病機以脾氣不足，生化乏源，無法濡養(yǎng)肌肉，導(dǎo)致肌肉運動無力的虛證為主；又兼見脾胃升清降濁失常，引起濕熱、瘀血等濁邪壅滯(如MG中AchR-Ab的過度增加)之實證，以既有升發(fā)脾氣布散津液之功，又可輸肌以促進肌肉運動的葛根，作為重癥肌無力治療的主藥；并針對脾氣虛以及瘀血濕熱阻滯的病機，則分別與益氣健脾的代表藥物黃芪、活血化瘀的代表藥物丹參以及治療痿證的四妙散配伍，發(fā)揮益氣升陽，發(fā)揮利濕活血或益氣輸肌，利濕活血之功效。

實驗結(jié)果顯示[17-23]，脾為肌肉提供氣血，線粒體為肌肉提供能量，脾與線粒體密切相關(guān)，即“脾-肌肉-線粒體”相關(guān)，而基于“脾主肌肉”理論，歸脾胃經(jīng)藥物葛根實質(zhì)作用于肌肉線粒體發(fā)揮作用，葛根及其配伍通過減少骨骼肌乙酰膽堿受體抗體的堆積和增強骨骼肌線粒體功能而發(fā)揮其治療作用，其對線粒體的作用是通過調(diào)控骨骼肌成纖維細胞生長因子(FGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、胰島素樣生長因子(IGFs)，進而改善EAMG大鼠骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)與功能。而線粒體作用的增強，也會緩解甚至降低乙酰膽堿受體抗體的堆積，促進神經(jīng)肌肉接頭部位傳導(dǎo)正常，緩解MG,故線粒體作用失常是MG 發(fā)病的關(guān)鍵。

1.4基于“脾-肌肉-線粒體質(zhì)量控制”，葛根及其配伍治療重癥肌無力的深層次機制可能為保證線粒體的源頭與活力 痿證病本在于脾氣虛，難以化生氣血濡養(yǎng)肌肉；運化無力，產(chǎn)生痰濁、水濕、瘀血等濁邪堆積，進一步阻滯氣血輸布，肌肉運行所需氣血乏源，影響肌肉運動?；贛G與痿證，脾氣虛是其病機之本，骨骼肌線粒體作用失常是MG發(fā)病的關(guān)鍵，而線粒體作用失常的調(diào)控是基于線粒體質(zhì)量控制，包括如何形成優(yōu)質(zhì)的線粒體，以及如何保證優(yōu)質(zhì)線粒體充滿活力。故結(jié)合腎為后天之本，腎主骨，可針對MG骨骼肌無力以填精益髓，在前期葛根及其配伍基礎(chǔ)上，增加熟地填精益髓，與黃芪配伍，發(fā)揮其升發(fā)脾陽、滋養(yǎng)肌肉的作用，而其配伍也體現(xiàn)了調(diào)動脾腎之先后天之本，使氣血生化有源，也使優(yōu)質(zhì)線粒體生成有源，并保持優(yōu)質(zhì)線粒體持續(xù)活力。以此，葛根及其配伍對重癥肌無力的深層次機制可能是以保障線粒體質(zhì)量控制為主(見圖1)，而線粒體質(zhì)量控制的具體內(nèi)涵分析也是研究的前提。

圖1 葛根及其復(fù)方配伍對線粒體調(diào)節(jié)示意圖

2 恢復(fù)骨骼肌干細胞再生修復(fù)功能是形成優(yōu)質(zhì)線粒體的基礎(chǔ)

MG是以骨骼肌功能失常為主，骨骼肌由大量的肌纖維束組成，其功能的維持取決于肌纖維再生能力。肌纖維再生則有賴于(Muscle stem cells，MSCs)的自我更新、高度增殖與肌源性分化[24]。有研究表明，當新生肌肉組織出現(xiàn)異常，將導(dǎo)致肌肉干細胞在數(shù)量和功能上存在明顯缺陷，出現(xiàn)進展型肌退化或肌萎縮現(xiàn)象[25]。

因此，骨骼肌干細胞再生修復(fù)是MG治療的關(guān)鍵，而MSCs的生長發(fā)育受多種因素調(diào)控，多種信號因子和生長因子參與其中(見圖2)。以恢復(fù)骨骼肌干細胞再生修復(fù)功能為前提，重建受損骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能，實現(xiàn)恢復(fù)骨骼肌線粒體質(zhì)量的目標。

圖2 骨骼肌衛(wèi)星細胞再生修復(fù)過程

2.1Myod和Pax7動態(tài)變化保護正常MSCs增殖，保障骨骼肌再生修復(fù) 肌肉轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(myoblastdetermining，Myod)是反應(yīng)肌肉細胞再生的主要指標[26]，實驗研究證實，當肌肉出現(xiàn)損傷后，MSCs啟動Myod基因，肌衛(wèi)星細胞進入增殖狀態(tài)；上調(diào)Myod蛋白表達，能夠促進肌衛(wèi)星細胞增殖，發(fā)揮保護骨骼肌正常功能的作用[27]。

Pax7作為一種成肌性誘導(dǎo)物，隨著Pax7的表達下降，骨骼肌干細胞逐漸失去干性，進而轉(zhuǎn)變?yōu)槌杉〖毎鸞28]，這對于骨骼肌的發(fā)育、再生和修復(fù)具有至關(guān)重要的意義。同時，Pax7能夠通過促進Myod降解，降低Myod的表達，保護正常MSCs增殖、保障骨骼肌再生修復(fù)[29]。但對其影響機制尚未完全明確。

2.2P38MAPK、AMPK信號通路相互調(diào)節(jié)MSCs再生修復(fù) 作為調(diào)控骨骼肌線粒體的重要通路之一，P38MAPK信號通路通過參與成肌細胞分化，實驗研究發(fā)現(xiàn)，廢用性肌萎縮的大鼠骨骼肌中P38MAPK的蛋白表達顯著低于正常組，調(diào)節(jié)P38MAPK信號通路，有效調(diào)控大鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞，保障線粒體正常功能，增加肌肉總量[30]。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作為調(diào)節(jié)細胞能量代謝的開關(guān)，研究證實，其不僅能夠有效刺激線粒體自噬發(fā)生，清除受損線粒體，保障線粒體能量供給，改善MG癥狀，同時通過調(diào)控自噬-溶酶體途徑發(fā)揮維持骨骼肌質(zhì)量，緩解肌萎縮的重要作用[31]。

3 動態(tài)調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量控制是保障優(yōu)質(zhì)線粒體功能的核心

近幾年來，隨著對線粒體認識的不斷深入，發(fā)現(xiàn)線粒體作為動態(tài)細胞器，在人體生長、運動、饑餓、炎癥、缺氧等刺激作用下，能夠通過線粒體融合/分裂，線粒體自噬、線粒體生物合成的協(xié)同調(diào)控，形成一個高度動態(tài)的可塑性網(wǎng)絡(luò)，限制和延緩功能受損線粒體的積累，維持線粒體數(shù)量、形態(tài)和功能的動態(tài)平衡[32]，實現(xiàn)線粒體質(zhì)量控制。

線粒體質(zhì)量控制，存在正向和逆向兩個對立統(tǒng)一方面，是發(fā)揮線粒體正常生理功能的核心，是維持細胞內(nèi)線粒體穩(wěn)態(tài)的重要機制[33]。不僅包含線粒體的新生，同時包含對損傷或衰老線粒體的清除，主要包括線粒體生物合成、線粒體動力學(xué)、線粒體自噬、細胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)四個方面[34-36](見圖3)。

圖3 線粒體質(zhì)量控制調(diào)節(jié)示意圖

3.1PGC-1α和NRF的協(xié)同表達促進線粒體生物合成 線粒體生物合成是增加細胞中線粒體質(zhì)量的過程，通過維持線粒體正常功能保障線粒體質(zhì)量控制[37]。需要包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1，PGC-1α)和核呼吸因子(nuclear respira-tory factor，NRF) 在內(nèi)的多種因子協(xié)同表達[38]。

PGC-1α作為調(diào)節(jié)骨骼肌線粒體生物發(fā)生的主控基因，能夠引發(fā)胞漿中鈣離子濃度升高，并通過激活鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶(CaMK)和鈣神經(jīng)素響應(yīng)基因，參與線粒體生物合成等多種生物過程[39]。

NRF-1作為線粒體基因特異性轉(zhuǎn)錄因子，在細胞核與線粒體通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用[40]，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NRF-1與共激活劑PGC-1α相互作用，將有助于細胞核和線粒體呼吸基因的表達[41]，改善骨骼肌線粒體生物發(fā)生，維持骨骼肌線粒體正常功能，保障線粒體質(zhì)量控制。

3.2通過相關(guān)蛋白對線粒體分裂與融合的調(diào)節(jié)促進線粒體動力學(xué)正常表達 線粒體正常情況下，能夠通過快速和可逆的分裂融合過程，完成從小圓形細胞器到巨大管狀結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，這一動態(tài)過程稱為線粒體動力學(xué)[42]。它與細胞代謝、增殖、凋亡等各種生物學(xué)功能密切相關(guān)。若線粒體動力學(xué)失調(diào)將導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。骨骼肌高度依賴線粒體動力學(xué)維持正常功能[43]，線粒體融合與分裂是對骨骼肌能量代謝的一種適應(yīng)性快速應(yīng)答。實驗研究發(fā)現(xiàn)，MG患者外周血單個核細胞存在分裂過度化，出現(xiàn)線粒體形態(tài)縮短，線粒體動力學(xué)異?，F(xiàn)象[44]。

3.2.1Drp1與Fis1相互作用促進線粒體分裂 動力相關(guān)蛋白1(dynamin-relatedprotein 1，Drp1)驅(qū)動線粒體分裂，實驗研究表明[45-47]，抑制Drp1的活性不僅抑制線粒體分裂，同時阻礙細胞色素C(cytochrome C，CytC) 和細胞凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF) 依賴的線粒體凋亡途徑。

在哺乳動物細胞中線粒體分裂蛋白1(Mitochondrial fission protein 1，F(xiàn)is1)和 Drp1 相互作用，在維持線粒體完整性方面發(fā)揮重要作用[48]。Romanello等[49]通過實驗研究證實，過表達Drp1或Fis1 將導(dǎo)致肌肉萎縮，而通過抑制骨骼肌線粒體分裂在一定程度上能夠降低肌萎縮現(xiàn)象。

3.2.2Mfn1、Mfn2與Opa1共同參與調(diào)節(jié)線粒體融合 線粒體融合主要受線粒體融合蛋白1/2(mitofusion 1 /2，Mfn1/2)、視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic dominant atrophy 1，Opa1)調(diào)控。Opa1作為線粒體內(nèi)膜重構(gòu)決定性因子之一，與Mfn1共同參與線粒體內(nèi)膜融合并維持嵴形態(tài)。實驗研究發(fā)現(xiàn)，在后肢廢用模型中線粒體融合基因Mfn1/2、Opa1基因表達顯著降低，小鼠骨骼肌橫疊面積下降[50]，證實線粒體融合與分裂在調(diào)控骨骼肌和肌肉質(zhì)量中發(fā)揮十分重要的作用。缺失Mfn1/2、Opa1將干擾線粒體的融合過程，導(dǎo)致正常線粒體功能受阻，影響線粒體的質(zhì)量。綜上，線粒體分裂可控制線粒體數(shù)目、調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑、介導(dǎo)細胞自噬，防止損傷線粒體的過度堆積；而線粒體融合則能夠在保障線粒體內(nèi)容物、調(diào)節(jié)線粒體嵴形態(tài)等方面發(fā)揮保障線粒體正常功能的作用，兩者相互影響，雙向調(diào)節(jié)，起到保障線粒體質(zhì)量控制的作用。因此，在線粒體質(zhì)量控制中起主導(dǎo)作用。

3.3PINK1/Parkin通路與線粒體外膜蛋白 FUNDC1協(xié)同介導(dǎo)線粒體自噬 從分子機制上來講，線粒體質(zhì)量控制不但涉及分子水平上單個蛋白質(zhì)的降解、合成和基因轉(zhuǎn)錄，同時包含在整個細胞器上線粒體的降解與新生[51]。而線粒體自噬(Mieap-inducedvacuole，MIV)作為一種選擇性自噬，能夠在應(yīng)激條件下通過選擇性清除受損或功能障礙的線粒體，完成識別去極化損傷線粒體，保障細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，是線粒體質(zhì)量控制的核心[52]。

PINK1/Parkin信號通路，作為介導(dǎo)骨骼肌線粒體自噬的主要途徑，在修復(fù)或清除損傷線粒體方面發(fā)揮重要價值[53]。線粒體外膜蛋白FUN14結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白1(FUN14 domain-containing protein 1,FUNDC1)在調(diào)節(jié)骨骼肌線粒體質(zhì)量以及機體代謝穩(wěn)態(tài)維持中同樣起著至關(guān)重要的作用。當敲除小鼠骨骼肌特異性線粒體外膜蛋白FUNDC1，可以導(dǎo)致 LC3介導(dǎo)的線粒體自噬受阻，影響線粒體 ATP 能量生成，導(dǎo)致骨骼肌脂肪酸利用率下降[54]。

因此，通過調(diào)節(jié)線粒體自噬清除損傷線粒體，防止異常線粒體的過度堆積，從而保障線粒體質(zhì)量控制，對于恢復(fù)MG骨骼肌線粒體具有重要意義。

另外，Mieap(Mitochondria-eatingprotein)作為一種新型分子，能夠通過介導(dǎo)線粒體自噬，即細胞自噬選擇性地清除受損線粒體[55]。若 Mieap 對線粒體的修復(fù)或清除受損，則可能導(dǎo)致大量異常線粒體堆積。

3.4調(diào)控細胞內(nèi)鈣離子濃度以維持線粒體跨膜電位正常 線粒體除產(chǎn)生ATP外，也是細胞鈣(Ca2+)的主要儲存中心。通過調(diào)控細胞內(nèi)鈣離子濃度，能夠防止炎性因子過度表達，維持線粒體跨膜電位正常，提高ATP活性，恢復(fù)細胞線粒體正常功能，是線粒體質(zhì)量控制的有效保障之一。實驗研究發(fā)現(xiàn)，脾氣虛MG患者外周血淋巴細胞線粒體膜電位水平明顯降低(P<0.01)[56]。細胞內(nèi)離子濃度無法保持平衡，影響細胞能量代謝受損。為從亞細胞分子水平上治療MG提供了強有力的理論基礎(chǔ)[57]。

綜上，本研究在前期“脾-肌肉-線粒體”研究基礎(chǔ)上，從MG病理以線粒體功能失常為關(guān)鍵點，基于“脾主肌肉”，結(jié)合中醫(yī)學(xué)“痿證”以脾虛為本、虛實夾雜的病機特點，延伸研究“脾-肌肉-線粒體質(zhì)量控制”，而線粒體質(zhì)量控制源于骨骼肌干細胞，受制于線粒體自身動態(tài)調(diào)節(jié)，故探討葛根及其配伍可能通過兩個層次調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量，治療重癥肌無力：

其一，在形成更多優(yōu)質(zhì)線粒體層面，從骨骼肌干細胞為切入，通過Myod與Pax7動態(tài)調(diào)節(jié)以及P38 MAPK、AMPK信號通路激活，保護正常MSCs增殖，保障骨骼肌再生修復(fù)，使優(yōu)質(zhì)線粒體生成有源；其二，在線粒體自身動態(tài)調(diào)節(jié)層面，以線粒體生物合成、融合與分裂、自噬以及細胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)為主，形成線粒體活力的高度動態(tài)的可塑性網(wǎng)絡(luò)，保證優(yōu)質(zhì)線粒體充滿生機。