抵當(dāng)芪桂湯對(duì)2型糖尿病大鼠血糖和肝組織IRS-1、GSK-3β的影響*

韓思榮 屈杰 楊景鋒 楊軍 譚穎穎 李小會(huì) 陳麗名

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)是胰島素分泌不足和(或)胰島素作用缺陷導(dǎo)致的一種以持續(xù)高血糖為主要臨床表現(xiàn)的慢性代謝性疾病[1]。近年來(lái)，隨著生活方式的改變和老齡化進(jìn)程的加速，糖尿病患病人數(shù)迅速增長(zhǎng)，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的非傳染類疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：2019年全球的糖尿病患者人數(shù)已達(dá)4.63億，中國(guó)約為1.298億，躍居世界第一[2]。目前，T2DM的治療手段包括口服降糖藥物、注射胰島素、控制飲食種類和數(shù)量及運(yùn)動(dòng)等，但T2DM及其并發(fā)癥的控制效果不是非常理想[3]。

中醫(yī)藥在防治T2DM方面具有多靶點(diǎn)、多途徑、個(gè)體化等不可替代的優(yōu)勢(shì)，它能夠減緩西藥不良反應(yīng)，顯著緩解臨床癥狀，延緩并逆轉(zhuǎn)并發(fā)癥的發(fā)展進(jìn)程[4]。通過(guò)大量的臨床觀察，導(dǎo)師楊景鋒教授指出“氣陰兩虛，瘀血阻絡(luò)”是T2DM的關(guān)鍵病機(jī)，并以益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)作為T2DM的基本治療法則，運(yùn)用經(jīng)方抵當(dāng)湯和黃芪桂枝五物湯化裁組成抵當(dāng)芪桂湯治療T2DM，作用顯著[5]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，抵當(dāng)芪桂湯能夠降低血糖，調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂，保護(hù)胰島細(xì)胞[6]。本課題在其基礎(chǔ)上研究抵當(dāng)芪桂湯對(duì)2型糖尿病大鼠血糖及肝組織IRS-1、GSK-3β表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其降糖機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1主要儀器 悅好Ⅲ型魚躍血糖儀及配套血糖試紙(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)；R136切片機(jī)(德國(guó)Leica)；CX21正置電子光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.2試藥 抵當(dāng)芪桂湯(由生黃芪30 g、桂枝10 g、酒大黃10 g、炒白芍15 g、水蛭6 g、鬼箭羽20 g組成)，中藥材由陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院提供，品質(zhì)合格。煎藥取液，并濃縮成含生藥0.948 g·mL-1和1.896 g·mL-1兩種濃度，存儲(chǔ)于4 ℃冰箱；鹽酸二甲雙胍(格華止)，中美上海施貴寶制藥有限公司；鏈脲佐菌素(Streptozotocin)STZ，美國(guó)Sigma公司；HE染液，Servicebio；PAS染液，武漢谷歌生物科技有限公司；IRS-1、GSK-3β抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(陜)2007-001。

2 方法

2.1動(dòng)物模型制備 80只SPF級(jí)雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)抽取10只作為空白對(duì)照組，給予普通飼料。剩下70只作為T2DM造模組，給予高糖高脂飼料，喂養(yǎng)6 w。第7 w，所有大鼠禁食12 h，對(duì)照組大鼠予按照35 mg·kg-1枸櫞酸緩沖液進(jìn)行腹腔注射，造模組大鼠按照35 mg·mL-1一次性腹腔注射STZ溶液(將STZ溶于0.1 mol·L-1、pH4.2的枸櫞酸緩沖液，配制為1%濃度)。STZ注射72 h后，造模組大鼠尾靜脈采血，測(cè)FBG≥16.9 mmol·L-1為造模成功。

2.2分組與給藥 于STZ注射后的第8 d，將造模成功的60只大鼠按照隨機(jī)數(shù)表分組(見表1)。藥物干預(yù)6 w后，處死大鼠，留取血清、胰腺和肝組織。

2.3指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1大鼠空腹血糖(FBG)的測(cè)定 測(cè)定FBG前禁食12 h，于大鼠尾靜脈采血，用魚躍血糖儀及配套血糖試紙檢測(cè)。

2.3.2大鼠糖化血紅蛋白(HbA1c)的測(cè)定 由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定HbA1c含量。

2.3.3HE染色觀察胰腺組織學(xué)變化 制作組織切片→脫蠟至水→蘇木素染色→伊紅染色→脫水封片→中性樹膠封片。

2.3.4PAS染色觀察糖原合成 制作組織切片→脫蠟至水→高碘酸染色→雪弗染色→蘇木素染色→脫水封片。

2.3.5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝臟組織IRS-1、GSK-3β的表達(dá) 制作組織切片脫蠟至水→抗原修復(fù)→阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶→血清封閉→加一抗、二抗→DAB顯色→復(fù)染細(xì)胞核→脫水封片，顯微鏡下觀察IRS-1、GSK-3β的表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1抵當(dāng)芪桂湯對(duì)大鼠體重的影響 Control組大鼠體重呈現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定增長(zhǎng)。藥物干預(yù)6 w后，與Model組比較，干預(yù)各組間大鼠體重的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Met組大鼠的體重相比，抵當(dāng)芪桂湯各干預(yù)組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2和圖1。

圖1 各組大鼠體重柱狀圖

表2 各組大鼠體重變化表

3.2抵當(dāng)芪桂湯對(duì)大鼠空腹血糖(FBG)和糖化血紅蛋白(HbA1c)的影響 與Control組相比，Model組大鼠的FBG、HbA1c均升高(P<0.01)；與Model組相比，Met組、DQZ組和DQZX組的FBG、HbA1c水平均呈現(xiàn)不同程度降低(P<0.05或P<0.01)，與Met組相比，DQZ組的FBG、HbA1c水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DQZX組與藥物干預(yù)各組相比，其HbA1c降低最為顯著。見表3和圖2。

表3 各組大鼠FBG、HbA1c水平

圖2 各組大鼠FBG、HbA1c水平柱形圖

3.3抵當(dāng)芪桂湯對(duì)T2DM大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響 Control組：胰島細(xì)胞多呈圓形或橢圓形細(xì)胞團(tuán)，數(shù)量較多，結(jié)構(gòu)完整清晰。Model組：胰島細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，邊界不清，數(shù)目明顯減少，部分胰島細(xì)胞腫脹、變形。與Model組比較，干預(yù)各組的胰島組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)與數(shù)目均有不同程度好轉(zhuǎn)，其中DQZX組：胰島細(xì)胞形狀較規(guī)則，細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞核分布均勻；DQZ組、Met組：胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，細(xì)胞分布均勻；DQG組：胰島細(xì)胞界限不清，分布不均，部分細(xì)胞核變形或消失，見圖3。

圖3 各組大鼠胰腺HE染色(10×40，Bar=100 μm)

3.4抵當(dāng)芪桂湯對(duì)T2DM大鼠肝糖原合成的影響 Control組：糖原顆粒含量豐富，分布均勻。Model組：糖原顆粒明顯減少，分布不均。與Model組相比，各藥物干預(yù)組的糖原顆粒均呈現(xiàn)不同程度增加，分布相對(duì)均勻，其中DQZX組糖原顆粒數(shù)量最多，見圖4。

圖4 各組大鼠肝臟PAS染色(10×40,Bar=100 μm)

3.5抵當(dāng)芪桂湯對(duì)T2DM大鼠肝組織IRS-1、GSK-3β蛋白表達(dá)的影響 IRS-1：與Model組比較，Met組、抵當(dāng)芪桂湯各組的表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；與Met組相比，DQG組較低，DQZX組較高(P<0.01)。

GSK-3β：與Model組比較，Met組、抵當(dāng)芪桂湯干預(yù)各組表達(dá)均降低(P<0.05或P<0.01)；與Met組相比，DQG組較高，DQZX組較低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見圖5、6、7。

圖5 各組大鼠肝組織IRS-1蛋白表達(dá)圖

圖6 各組大鼠肝組織GSK-3β蛋白表達(dá)圖

圖7 干預(yù)6周后各組大鼠IRS-1、GSK-3β的表達(dá)柱狀圖

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，陰虛燥熱是消渴的主要病因病機(jī)，治療多以養(yǎng)陰清熱生津?yàn)橹?。但是楊景鋒教授基于經(jīng)典理論和多年臨床經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)T2DM多見于中老年患者，多伴有肥胖、高血壓、心腦血管病等基礎(chǔ)疾病，久病多虛、多瘀，氣虛血瘀情況較為多見，提出T2DM的主要病因病機(jī)為“氣陰兩虛，瘀血阻絡(luò)”，以益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)作為其基本治則治法，將經(jīng)方抵當(dāng)湯與黃芪桂枝五物湯加減組成抵當(dāng)芪桂湯用于T2DM及其并發(fā)癥的治療，臨床療效顯著。抵當(dāng)芪桂湯以黃芪、炒白芍為君藥，益氣養(yǎng)陰生津；桂枝溫通經(jīng)絡(luò)，水蛭、酒大黃活血化瘀，共為臣藥；并以鬼箭羽為佐，破血祛瘀。諸藥合用，補(bǔ)益而不郁滯，祛瘀而不傷正，共奏益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之效。藥理研究表明抵當(dāng)芪桂湯中的藥物能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂，保護(hù)胰島細(xì)胞，刺激胰島素分泌，增強(qiáng)葡萄糖的攝取和利用，降低血糖水平[7-13]。

肝糖原的合成與分解是人體調(diào)控血糖水平的重要環(huán)節(jié)，其合成減少或者分解增加均會(huì)使血糖居高不下[14]。正常生理狀態(tài)中，肝糖原的合成與分解受胰島素的調(diào)控，處于平衡狀態(tài)[15]。當(dāng)胰島素分泌減少或其敏感性下降，肝糖原合成會(huì)減少，糖代謝紊亂，導(dǎo)致血糖升高。而胰島素受體底物1(IRS-1)是胰島素信號(hào)傳遞的首要蛋白分子，主要參與肝臟調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、胰島素分泌及其信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程，其表達(dá)下降，胰島素敏感性隨之降低，胰島素信號(hào)傳遞受到阻滯，影響其信號(hào)傳導(dǎo)的強(qiáng)度，從而會(huì)影響肝臟利用葡萄糖的能力，導(dǎo)致T2DM的發(fā)生[17-18]。糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)是調(diào)控糖原合成的關(guān)鍵酶，有兩種異構(gòu)體GSK-3α和GSK-3β，GSK-3β效應(yīng)居多[19]。當(dāng)胰島素作用于PI3K/Akt通路，GSK-3β與活化后的Akt結(jié)合，GSK-3β活性受到抑制，其底物糖原合成酶(GS)則升高，促進(jìn)糖原合成，從而降低血糖。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高糖高脂飼料聯(lián)合腹腔注射小劑量的STZ建立T2DM大鼠模型[20-21]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抵當(dāng)芪桂湯能夠有效降低T2DM大鼠的血糖水平，保護(hù)其胰島細(xì)胞，并上調(diào)IRS-1表達(dá)，下調(diào)GSK-3β的水平。提示抵當(dāng)芪桂湯可能通過(guò)調(diào)控IRS-1和GSK-3β的水平，增強(qiáng)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)肝糖原合成，保護(hù)胰島細(xì)胞，從而發(fā)揮降糖作用。且當(dāng)二甲雙胍與抵當(dāng)芪桂湯聯(lián)合治療T2DM時(shí)，可增強(qiáng)其降糖療效。