基于主成分分析的硝普鈉處理對采后荔枝活性氧代謝的影響

謝 晶，覃子倚，潘家麗，李 靜，董新紅

（桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541004）

荔枝（Litchi chinensisSonn.）是中國南方亞熱帶地區(qū)的特產(chǎn)水果之一[1]，廣泛種植于廣東和福建南部。荔枝成熟于高溫季節(jié)，果實含水量高，采后荔枝生理代謝活動十分旺盛，極易發(fā)生褐變，影響其商業(yè)價值[2-3]。因此，大力發(fā)展荔枝貯運保鮮技術(shù)，控制采后荔枝的衰老褐變，保持其良好的生理品質(zhì)具有重要意義。

荔枝的保鮮手段目前常見的有冷藏保溫、藥物處理[4]、氣調(diào)處理[5]等，均能在一定程度上維持荔枝的貯藏品質(zhì)。其中，冷藏保溫可以有效抑制荔枝色澤的暗淡，延緩硬度的下降，但沒有對低溫的適應(yīng)環(huán)節(jié)，也會造成荔枝發(fā)生冷害，使其生理品質(zhì)急速下降[6]。氣調(diào)保鮮雖具有健康、環(huán)保的優(yōu)點[7]，但其貯運期間很難保持氣調(diào)保鮮所需的恒定溫度[5]，且成本十分的高昂。藥物保鮮雖然可以大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)，但有些藥物保鮮劑含有低毒，會對荔枝產(chǎn)生影響，所以，尋找一種無毒、環(huán)保的保鮮劑對荔枝的保鮮有重要意義。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是植物中廣泛存在的信號分子，不僅參與調(diào)節(jié)了生物體內(nèi)眾多的生理生化反應(yīng)[8]，而且可以減輕活性氧對機體的損傷[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)，NO可能是一種可延緩果蔬衰老的植物生長調(diào)節(jié)劑，已應(yīng)用于多種果蔬保鮮研究[10]。Han Shuai等[11]研究發(fā)現(xiàn)使用10 μmol/L NO氣體熏蒸處理后，桃果實中蔗糖的含量增加，而葡萄糖和果糖的含量下降。楊睿等[12]研究表明NO處理能夠延緩果蔬VC的流失以及可溶性固形物含量和硬度的下降，降低水分的流失，抑制葉綠素的降解。但是NO直接處理果蔬極有可能造成果蔬缺氧，從而激發(fā)無氧呼吸，使果蔬的營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生乙醇等產(chǎn)物，最終導(dǎo)致果蔬腐爛變質(zhì)，而硝普鈉充當(dāng)NO的供體不僅可以避免這個危害，而且更利于推廣[13]。目前硝普鈉已應(yīng)用于枇杷[14]、番茄[15]、茄子[16]等保鮮，且有研究表明硝普鈉處理能有效延緩果實褐變，有效降低果實細胞膜透性，保持果實原有硬度和減緩果實中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量增加[17]。

本實驗以當(dāng)季采摘‘妃子笑’荔枝果實為原材料，在4 ℃條件下，以不同濃度的硝普鈉處理荔枝，定期測定荔枝果實的褐變指數(shù)、質(zhì)量損失率、細胞膜透性、過氧化氫（H2O2）含量、超氧陰離子自由基（O2－·）產(chǎn)生速率、MDA含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力等生理指標(biāo)變化，以期為硝普鈉用于采后保鮮提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘妃子笑’荔枝 桂林市五里店果蔬批發(fā)市場；硝普鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠；所有實驗用的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；3K3冷凍離心機 德國Sartorious公司；722PC可見光分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；TU-50紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；50P電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；PHS-3E電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LRH-25-Z恒溫培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；NR6CP色差儀 深圳市三恩時科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

樣品處理方法參考文獻[13]并稍作修改。選用八至九成熟度，大小均勻，表皮無破損，無病害的‘妃子笑’荔枝，清洗干凈后，分別用濃度為10、50、100 μmol/L的硝普鈉浸泡2 h，以清水處理為對照組（CK），晾干后用厚度為0.11 mm的PE保鮮袋裝好，4 ℃條件下貯藏，每3 d取樣一次（即0、3、6、9、12 d），取樣當(dāng)天測定褐變指數(shù)、質(zhì)量損失率、細胞膜通透性，剩余荔枝果皮經(jīng)液氮速凍研磨打碎后于－80 ℃冷凍貯藏備用。每次實驗進行3 次重復(fù)，每次重復(fù)使用20 顆荔枝。

1.3.2 褐變指數(shù)

參考文獻[18]采用分級法根據(jù)荔枝果皮的褐變面積將荔枝分為5 級，每次選30 個果實進行測定，每3 d測定1 次，按式（1）計算褐變指數(shù)。

1.3.3 質(zhì)量損失率測定

參照文獻[19]測定荔枝的質(zhì)量損失率。貯藏開始時的荔枝質(zhì)量記為m1/g，貯藏一段時間（3、6、9、12 d）后的荔枝質(zhì)量記為m2/g，按式（2）計算質(zhì)量損失率。

1.3.4 細胞膜透性測定

參照文獻[20]并加以改進，對照組和處理組分別取5 個荔枝的果皮，分別均勻地在每個果皮上切取3 片直徑6 mm、厚度一致的荔枝果皮圓片，再放入50 mL的離心管中用去離子水清洗3 次，并向果皮圓片中加入20 mL的蒸餾水，于25 ℃在搖床上振蕩1 h后，用電導(dǎo)儀測定浸出液體的電導(dǎo)率A0，然后將測定過A0的圓片及溶液進行煮沸30 min，降至室溫后測定其電導(dǎo)率A1，重復(fù)3 次。按式（3）計算相對電導(dǎo)率，以表征細胞膜透性。

1.3.5 過氧化氫含量測定

參考文獻[21]測定H2O2含量。稱取2 g荔枝果皮，加入5 mL、pH 6.5的磷酸緩沖液，于12 000 r/min、4 ℃離心20 min，用－20 ℃預(yù)冷丙酮將離心得到的沉淀物洗滌3 次，直到除去色素。再向洗滌后的沉淀中加入3 mL 2 mol/L的硫酸，待完全溶解后吸取1 mL樣品提取液進行比色。H2O2含量單位為μmol/g。

1.3.6 超氧陰離子自由基的產(chǎn)生速率測定

稱取2 g果皮，參考文獻[22]中的羥胺氧化反應(yīng)方法測定O2－·產(chǎn)生速率。

1.3.7 丙二醛含量測定

稱取果皮2 g，參考文獻[22]用硫代巴比妥酸顯色法測定MDA含量，單位為μmol/g。

1.3.8 超氧化物歧化酶活力測定

稱取2 g荔枝果皮，參考文獻[23]采用氮藍四唑光還原法測定SOD活力，以每克果蔬樣品每分鐘對氮藍四唑光化反應(yīng)抑制率為50%為1 個酶活力單位（U），單位為U/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理，并采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析、主成分分析。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度硝普鈉處理對荔枝果實褐變指數(shù)的影響

不同濃度的硝普鈉處理對荔枝褐變指數(shù)的影響如圖1所示，荔枝的褐變程度均隨貯藏時間的延長而提高，在貯藏末期（12 d）時，10、50、100 μmol/L硝普鈉處理組的褐變指數(shù)分別比CK組低20.89%、13.38%、16.20%，且不同濃度硝普鈉處理組的褐變指數(shù)明顯低于CK組，說明硝普鈉處理能有效抑制荔枝的采后褐變，其中濃度為10 μmol/L硝普鈉處理對荔枝褐變的抑制效果最佳。

圖1 硝普鈉處理對荔枝褐變指數(shù)的影響Fig. 1 Effect of sodium nitroprusside treatment on browning index of litchi

2.2 不同濃度硝普鈉處理對荔枝果實質(zhì)量損失率的影響

荔枝自身水分多，其采后呼吸作用旺盛，其果皮質(zhì)量損失率上升主要由果皮失水引起[24]。荔枝對照組和處理組的質(zhì)量損失率均隨著貯藏時間的延長而提高（圖2），這可能是荔枝采后果皮細胞膜逐漸破裂失去水分導(dǎo)致的[25]。在貯藏前期，荔枝CK組和3種不同濃度硝普鈉處理組的荔枝質(zhì)量損失率無明顯差異，貯藏中后期（6 d后），硝普鈉處理組荔枝質(zhì)量損失率明顯低于CK組，在貯藏12 d時，10、50、100 μmol/L硝普鈉處理組的質(zhì)量損失率分別比對照組降低14.69%、17.19%、26.37%，且均明顯低于對照組，其中100 μmol/L硝普鈉處理組荔枝質(zhì)量損失率最低。有研究表明NO是一種生物活性分子，對果蔬采后品質(zhì)的保持有一定作用，且NO處理過的臍橙質(zhì)量損失率的上升被顯著的抑制，有效地減緩了水分的擴散[26]。并且，失水狀況的改善有利于延緩荔枝褐變的進程[27]。所以貯藏中后期，硝普鈉處理組質(zhì)量損失率明顯低于對照組，表明硝普鈉可以一定程度抑制荔枝水分的散失，延長荔枝采后的貯藏期限。

圖2 硝普鈉處理對荔枝質(zhì)量損失率的影響Fig. 2 Effect of sodium nitroprusside treatment on mass loss rate of litchi

2.3 不同濃度硝普鈉處理對荔枝果實細胞膜透性的影響

果實在貯藏過程中，隨著膜脂過氧化的進行，細胞膜的完整性會逐漸被破壞，細胞膜透性會逐漸增大[28]，細胞膜透性可通過相對電導(dǎo)率表示。由圖3可知，在貯藏前期（0～9 d），所有處理組的相對電導(dǎo)率均快速上升，而在貯藏后期，對照組的相對電導(dǎo)率一直上升，硝普鈉處理組的電導(dǎo)率呈現(xiàn)穩(wěn)定或下降趨勢。在貯藏第12天，10、50、100 μmol/L硝普鈉處理組的相對電導(dǎo)率分別比CK組降低16.25%、11.25%和7.5%，且各處理組和CK組在貯藏末期均呈明顯差異，而10 μmol/L硝普鈉處理組在整個貯藏期均與CK組差異明顯，表明硝普鈉處理能有效減輕荔枝細胞膜的損傷，降低荔枝細胞膜透性，從而降低果皮組織的相對電導(dǎo)率。

圖3 硝普鈉處理對荔枝細胞膜透性的影響Fig. 3 Effect of sodium nitroprusside treatment on membrane permeability of litchi

2.4 不同濃度硝普鈉處理對荔枝活性氧產(chǎn)生及膜脂過氧化作用的影響

在果實采后衰老過程中，活性氧清除系統(tǒng)功能下降，造成果實中H2O2含量增加、產(chǎn)生速率提高，而過多的自由基易導(dǎo)致荔枝細胞膜脂發(fā)生過氧化，破壞細胞膜，MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物[29]，可以反映果蔬細胞膜的完整性。

H2O2是評價采后果蔬活性氧代謝的重要指標(biāo)，H2O2含量越高，表明活性氧代謝越旺盛。荔枝CK組和硝普鈉處理組的H2O2含量，均先急速上升（0～3 d）后下降，再（6 d后）緩慢上升（圖4）。在貯藏末期（12 d），10、50、100 μmol/L硝普鈉處理組的H2O2含量分別比CK組的H2O2含量降低了11.69%、17.84%、8.67%，且均明顯低于CK組。說明硝普鈉處理能有效抑制H2O2活性氧的代謝，從而更好地保持荔枝的品質(zhì)，延長其貯藏期，以50 μmol/L的硝普鈉處理對H2O2的抑制效果最好。

圖4 硝普鈉處理對荔枝H2O2含量的影響Fig. 4 Effect of sodium nitroprusside treatment on the content of H2O2 in litchi

不同處理對荔枝MDA含量的影響如圖6所示。CK組和硝普鈉處理組的MDA含量均呈先上升后下降的趨勢，在6 d時達到峰值，此時對照組和10、50、100 μmol/L硝普鈉處理組的MDA含量分別為12.78、9.28、6.04、9.98 μmol/g，在6 d后緩慢下降，這可能是由于貯藏后期荔枝代謝減弱，自由基產(chǎn)生速度減慢，膜脂氧化程度有所降低。不同濃度硝普鈉處理的荔枝MDA含量明顯低于CK組MDA的含量，且濃度為50 μmol/L的硝普鈉處理組荔枝MDA含量明顯低于其他處理組。表明硝普鈉處理能明顯抑制MDA的產(chǎn)生，降低膜脂過氧化程度，從而保持荔枝的貯藏品質(zhì)。周慧等[30]研究也表明，NO處理可以有效降低鮮切桃膜脂過氧化程度。MDA含量變化趨勢與圖5和圖6所示的H2O2含量和產(chǎn)生速率的變化趨勢相似，說明活性氧積累與膜脂過氧化之間具有一定相關(guān)性。

圖6 硝普鈉處理對荔枝MDA含量的影響Fig. 6 Effect of sodium nitroprusside treatment on MDA content of litchi

2.5 不同濃度硝普鈉處理對荔枝果皮超氧化物歧化酶活力的影響

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，被認為是清除活性氧的第一道防線[31]，是衡量果蔬生理品質(zhì)的一個重要指標(biāo)。由圖7可知，荔枝SOD活力在貯藏0～3 d時急劇升高，CK組和硝普鈉處理組在3 d時達到峰值（100 μmol/L在6 d時達到峰值），且硝普鈉處理組的SOD活力始終高于對照組，說明硝普鈉處理對SOD活力具有一定的提升作用。貯藏6 d以后，硝普鈉處理組的SOD活力均明顯高于對照組，而100 μmol/L和50 μmol/L硝普鈉處理組的SOD活力一直明顯高于處理組，說明較高濃度的硝普鈉處理對荔枝SOD活力具有更好的促進作用。

圖7 硝普鈉處理對荔枝SOD活力的影響Fig. 7 Effect of sodium nitroprusside treatment on SOD activity of litchi

2.6 荔枝貯藏過程中各生理指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果

對荔枝保鮮的各生理指標(biāo)進行相關(guān)性分析，結(jié)果如表1所示。荔枝貯藏時間和褐變指數(shù)、質(zhì)量損失率、細胞膜透性、H2O2含量、丙二醛含量呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r分別為0.899、0.968、0.842、0.806、0.691，P＜0.01），與產(chǎn)生速率呈顯著負相關(guān)（r＝－0.340，P＜0.05），說明在貯藏期間，褐變指數(shù)、質(zhì)量損失率、細胞膜透性、H2O2含量、丙二醛含量和產(chǎn)生速率均能反映貯藏期荔枝的品質(zhì)，且SOD與MDA呈極顯著負相關(guān)（r＝－0.140，P＜0.01），表明SOD活力越高，自由基清除速率越快，膜脂過氧化程度越低，荔枝各生理指標(biāo)間相關(guān)性明顯。

表1 各生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between various physiological indicators

2.7 荔枝貯藏過程中各生理指標(biāo)主成分分析結(jié)果

對荔枝生理指標(biāo)進行主成分分析，將荔枝貯藏期間的7 項指標(biāo)轉(zhuǎn)化為2 個主成分（表2）。結(jié)果表明，前2 個主成分的貢獻率分別為63.855%、21.275%，累計貢獻率為85.130%，且前2 個主成分特征值均大于1，所以前2 個主成分可以代表各成分大部分的信息[32]。因此，選取前2 個主成分作為荔枝采后貯藏品質(zhì)的重要主成分。

表2 主成分特征值及方差貢獻率Table 2 Eigenvalues of principal components and their contribution to total variance

由表3和圖8可知，褐變指數(shù)、質(zhì)量損失率、細胞膜透性、H2O2含量和MDA含量在第1主成分正坐標(biāo)軸處具有較高載荷，說明第1主成分主要反映了這5 個指標(biāo)的信息；產(chǎn)生速率在第2主成分正坐標(biāo)軸處有較高載荷，SOD活力在負坐標(biāo)軸處有較高載荷，說明第2主成分主要代表產(chǎn)生速率和SOD活力這2 個指標(biāo)，且第二主成分與產(chǎn)生速率呈正相關(guān)，與SOD活力呈負相關(guān)。根據(jù)載荷絕對值的大小可知，在第1主成分中貢獻率大小為褐變指數(shù)＞細胞膜透性＞質(zhì)量損失率＞MDA含量＞H2O2含量；而第2主成分中貢獻率比較結(jié)果為SOD活力＞產(chǎn)生速率。

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Principal component loading matrix

圖8 荔枝貯藏過程中各生理指標(biāo)主成分分析因子載荷圖Fig. 8 Principal component analysis factor load diagram of physiological indexes during storage of litchi

由因子載荷圖（圖8）可知，荔枝褐變指數(shù)、質(zhì)量損失率、細胞膜透性、H2O2含量、MDA含量在第一主成分（63.855%）的正軸，且距離Y軸較遠，即褐變指數(shù)、質(zhì)量損失率、細胞膜透性、H2O2含量、MDA含量對第一主成分貢獻大；而產(chǎn)生速率和SOD活力離X軸較遠，表明產(chǎn)生速率和SOD對第2主成分的貢獻較大。結(jié)合載荷矩陣（表3）與因子載荷圖（圖8）可知，荔枝品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)是褐變指數(shù)、質(zhì)量損失率、細胞膜透性和SOD活力。

2.8 荔枝品質(zhì)綜合評價

由表4可知，可用PC1、PC2代替原來的7 個指標(biāo)，得出各主成分特征向量PCA1＝0.207Z1＋0.219Z2＋0.217Z3＋0.204Z4－0.044Z5＋0.196Z6－0.093Z7；PCA2＝0.122Z1－0.098Z2－0.067Z3－0.088Z4－0.531Z5＋0.077Z6＋0.585Z7；Zi代表標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)。

表4 主成分得分系數(shù)矩陣Table 4 Principal component score matrix

以選取的第1、第2主成分的方差貢獻率α1（63.855%）、α2（21.275%）作為權(quán)數(shù)構(gòu)建綜合評價模型F＝α1Y1＋α2Y2，即F＝0.638 55hY1＋0.212 75hY2。F值代表荔枝貯藏品質(zhì)的綜合得分。

荔枝綜合得分見圖9，荔枝對照組硝普鈉與處理組的綜合得分先上升后下降。在貯藏末期（12 d），10、50、100 μmol/L硝普鈉處理組的綜合得分分別比對照組高0.91、0.54、2.34，且不同濃度硝普鈉處理組的綜合得分均明顯高于對照組，因此硝普鈉處理對荔枝品質(zhì)具有明顯維持的作用，且在貯藏后期（6 d后）100 μmol/L硝普鈉處理組的綜合得分始終高于其他硝普鈉處理組和對照組，表明100 μmol/L硝普鈉處理在貯藏后期更能有效保持荔枝品質(zhì)，保鮮效果更佳。

圖9 荔枝各處理組的綜合得分Fig. 9 Comprehensive score of litchi fruit in each treatment group

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，不同濃度硝普鈉處理可以延緩荔枝的褐變，維持荔枝表皮的水分，阻止其快速流失，保護荔枝細胞膜結(jié)構(gòu)、抑制H2O2和產(chǎn)生速率以及MDA的產(chǎn)生和積累，提高SOD活力，從而一定程度上維持荔枝采后的生理品質(zhì)。其中，濃度為10 μmol/L的硝普鈉處理在抑制果皮褐變及降低細胞膜透性方面效果最為顯著；50 μmol/L的硝普鈉處理在抑制H2O2、和MDA的產(chǎn)生和積累方面效果明顯；100 μmol/L的硝普鈉處理則能在貯藏6 d后，有效減緩荔枝失水和提高SOD的活性。

主成分分析的目的是簡化評價指標(biāo)[31]，本實驗將7 個荔枝生理指標(biāo)簡化為2 個主成分，其總貢獻率為85.13%，能代表荔枝的絕大部分信息，在第1主成分中貢獻率大小依次為褐變指數(shù)＞細胞膜透性＞質(zhì)量損失率＞MDA含量＞H2O2含量；而第2主成分中貢獻率大小依次為SOD活力＞產(chǎn)生速率。所以，荔枝品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)是褐變指數(shù)、細胞膜透性、質(zhì)量損失率和SOD活力，不同濃度的硝普鈉處理對荔枝活性氧代謝及采后褐變調(diào)控方面均有積極的效果。且根據(jù)構(gòu)建的荔枝品質(zhì)評價模型可知，100 μmol/L的硝普鈉處理組在貯藏后期（6 d后）的綜合得分更高，即其貯藏品質(zhì)最佳，能有效延長荔枝的貯藏期。

綜上，在4 ℃的貯藏條件下，硝普鈉處理能有效地抑制采后荔枝的活性氧代謝和褐變衰老，維持果實良好的生理品質(zhì)，延長其貨架期，100 μmol/L的硝普鈉處理對荔枝保鮮效果最好，能更好地保持果實的采后品質(zhì)。