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      人參皂苷Re對(duì)東莨菪堿致小鼠神經(jīng)炎癥和認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用研究

      2022-05-30 00:08:59劉昌福鄧鋼歐陽(yáng)敏吳劍華
      健康之家 2022年7期
      關(guān)鍵詞:炎癥

      劉昌福 鄧鋼 歐陽(yáng)敏 吳劍華

      摘要:目的 探究人參皂苷Re對(duì)東莨菪堿誘發(fā)的C57BL/6J小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及其作用機(jī)制。方法 36只雄性C57BL/6J小鼠經(jīng)訓(xùn)練合格隨機(jī)分為6組,即正常組、模型組、陽(yáng)性組,以及人參皂苷Re低、中、高劑量組。正常組注射等體積生理鹽水,其他組腹腔注射2 mg/kg東莨菪堿溶液。同時(shí),陽(yáng)性組給予10 mg/kg多奈哌齊溶液,人參皂苷Re低、中、高劑量組分別給予10.02 mg/kg、20.1 mg/kg、40.2 mg/kg人參皂苷Re溶液,其他組灌胃等體積生理鹽水。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的記憶能力。取腦組織,HE染色和試劑盒方法測(cè)定腦組織中AChE、ChAT、TNF-α、MDA、GSH、IL-6水平。結(jié)果 與正常組相比,模型組小鼠上臺(tái)潛伏期顯著增加,TNF-α、MDA、IL-6水平顯著升高,AChE、ChAT、GSH含量和海馬神經(jīng)細(xì)胞明顯減少;相比模型組,5 mg/kg多奈哌齊和10.02 mg/kg、20.1 mg/kg、40.2 mg/kg人參皂苷Re給藥后上臺(tái)潛伏期顯著降低,腦內(nèi)AChE、ChAT、GSH顯著升高,而TNF-α、MDA、IL-6水平顯著降低,改善神經(jīng)細(xì)胞損傷。結(jié)論 人參皂苷Re可以通過(guò)下調(diào)大腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及修復(fù)海馬的損傷來(lái)改善C57BL/6J小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

      關(guān)鍵詞:人參皂苷Re;記憶障礙;炎癥

      阿爾茨海默?。ˋD)是老年人中常見(jiàn)的進(jìn)行性癡呆癥之一,影響患者記憶、思維、語(yǔ)言,對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生不利影響[1]。研究發(fā)現(xiàn),AD的可能病因包括膽堿能和β-淀粉樣蛋白(Aβ)水平、腦血流量、神經(jīng)遞質(zhì)波動(dòng)、神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激的發(fā)展[2]。在AD中,海馬和新皮質(zhì)等大腦區(qū)域處理記憶、行為、學(xué)習(xí)和情緒反應(yīng),患者的膽堿能功能受損,乙酰膽堿(ACh)水平降低。乙酰膽堿酯酶(AChE)負(fù)責(zé)乙酰膽堿的水解[3]。因此,抑制乙酰膽堿酯酶是治療AD的關(guān)鍵[4]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在AD的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用,其特征是自由基生成速率與身體抗氧化防御系統(tǒng)之間的不平衡[5]。有研究表明,人參皂苷Re作為人參中微量的有效成分,有助于預(yù)防健康問(wèn)題,緩解腦缺血損傷[6],提高大鼠大腦中抗凋亡介質(zhì)的水平[7],以及改善老年癡呆的線粒體病理[8]。

      因此,本研究將依據(jù)東莨菪堿造模的常規(guī)途徑,研究人參皂苷Re對(duì)C57BL/6J小鼠記憶障礙的氧化還原、炎癥應(yīng)激等作用,為人參皂苷Re整體入藥改善學(xué)習(xí)記憶作用的科學(xué)機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

      1 材料和方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)材料

      取適量人參皂苷Re(大連美侖生物公司,貨號(hào):MB6952)溶于生理鹽水中,超聲至澄清,配置成4 mg/mL人參皂苷Re溶液備用。取50片多奈哌齊片(大連美侖生物有限公司,批號(hào):20213102E3217,規(guī)格:5 mg /片,)研磨后溶于50 mL生理鹽水中,攪拌至澄清,配置成10 mg/mL溶液備用。精密稱量60.07 mg東莨菪堿,加入300 mL生理鹽水中,超聲至澄清,即得0.2 mg/mL的東莨菪堿溶液,以上溶液均4 ℃保存。

      1.2 動(dòng)物分組與給藥

      雄性C57BL/6J小鼠,重量36~41 g(湖南斯萊克動(dòng)物公司提供),所有程序均符合《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)程》,合格證號(hào):SCXK(贛)2022-0015。環(huán)境溫度控制在25±2 ℃,適應(yīng)性飼養(yǎng)7天之后開始實(shí)驗(yàn)。

      分組實(shí)驗(yàn)前,對(duì)C57BL/6J雄性小鼠進(jìn)行3天的Morris水迷宮(上海移數(shù)有限公司,MWM-M)游泳訓(xùn)練,剔除平臺(tái)潛伏期大于1 min的小鼠。將合格的36只小鼠隨機(jī)分為6組,每組6只,分別為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(多奈哌齊,10 mg/kg)、人參皂苷Re低(10.02 mg/kg)、人參皂苷Re中(20.1 mg/kg)、人參皂苷Re高(40.2 mg/kg)劑量組。其中,正常組和模型組給予0.9%生理鹽水,灌胃體積為0.4 ml/20 g小鼠體重。每天上午9點(diǎn)稱重后,模型對(duì)照組與給藥組均腹腔注射東莨菪堿注射液,空白組腹腔注射等體積生理鹽水,每天1次,共給藥兩周。每天下午3點(diǎn),正常組灌胃等體積0.9%生理鹽水,其他組灌胃給藥30 min后,灌胃2 mg/kg東莨菪堿溶液。

      1.3 試劑

      AChE、ChAT、TNF-α、MDA、GSH、IL-6檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。

      1.4 儀器

      Morris水迷宮(上海移數(shù)有限公司,MWM -M);MGO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(賽默飛中國(guó)分公司)。

      1.5 方法

      1.5.1 行為學(xué)測(cè)定

      在試驗(yàn)開始前的兩天內(nèi),允許所有動(dòng)物每天在沒(méi)有平臺(tái)的泳池中游泳60 s,以評(píng)估它們的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)和對(duì)周圍環(huán)境條件的適應(yīng)能力。隨后5 d,放置平臺(tái)后小鼠被允許在迷宮中探索60 s,如果小鼠無(wú)法自己找到平臺(tái),小鼠會(huì)被輕輕地引導(dǎo)到平臺(tái)上。無(wú)論是否找到平臺(tái),都將其在平臺(tái)上停留15 s,每天進(jìn)行兩次試驗(yàn)。最后1 d,在同一個(gè)象限中放置小鼠,測(cè)量小鼠上臺(tái)時(shí)間。

      1.5.2 大腦生化指標(biāo)測(cè)定

      行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,二氧化碳安樂(lè)死。每組半數(shù)迅速取出小鼠腦海馬組織,稱重后,置于液氮中保存。勻漿后用試劑盒法測(cè)定海馬組織腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、白介素-6(IL-6)、谷胱甘肽(GSH)。

      1.5.3 病理染色

      每組剩余小鼠取腦組織用水合氯醛處理、脫水、透明和封固等步驟后,切片(20-30μm厚),做HE染色,并在尼康倒置顯微鏡下觀察并拍攝染色圖片,通過(guò)Image-Pro Plus 5.0對(duì)切片中神經(jīng)元椎體細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

      1.6 統(tǒng)計(jì)分析

      數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,計(jì)量資料以(±s)表示,采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料用比率表示,采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2結(jié)果

      2.1 人參皂苷Re對(duì)東莨菪堿致癡呆小鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響

      模型組小鼠上臺(tái)時(shí)間(45.28±4.49) s明顯高于對(duì)照組(23.56±5.71) s,P<0.01。多奈哌齊組、人參皂苷Re低、中、高劑量組小鼠上臺(tái)時(shí)間(41.28±6.82) s、(34.67±5.12) s、(29.86±3.63) s、

      (26.32±6.67)s,明顯低于模型組,P<0.01。

      2.2 人參皂苷Re對(duì)小鼠腦中相關(guān)生化因子的影響

      模型組小鼠腦內(nèi)海馬的MDA、IL-6、TNF-α含量(187.45±10.37)ng/ml、(168.13±9.16)ng/ml、

      (123.51±8.19) ng/ml,高于對(duì)照組(130.37±12.86) ng/ml、(118.62±7.39)ng/ml、(98.79±10.63)ng/ml,P<0.01;而AChE、ChAT、GSH(187.45±10.37) ng/ml、(167.13±9.16)ng/ml、(183.51±8.19)ng/ml,

      低于對(duì)照組(236.47±15.88)ng/ml、(221.50±23.18) ng/ml、(237.85±16.73)ng/ml,P<0.01。另外,多奈哌齊組、人參皂苷Re低、中、高劑量組腦中MDA含量分別為(141.30±9.52) ng/ml、(160.48±9.37) ng/ml、(153.45±11.56)ng/ml、(149.20±13.75) ng/ml,IL-6含量分別為(123.11±12.80)ng/ml、(145.72±10.74)ng/ml、(139.72±9.42)ng/ml、

      (134±14.83)ng/ml,TNF-α含量分別為(102.49± 8.53)ng/ml、(110.36±10.68)ng/ml、(108.45±7.68)ng/ml、(106.76±9.55)ng/ml,均低于模型組;P<0.01,且高劑量組的降低作用最為顯著。而多奈哌齊組、人參皂苷Re低、中、高劑量組腦海馬中AChE的含量分別為(229.42±14.68)ng/ml、(203.15±16.85)ng/ml、(211.92±13.78)ng/ml、(224.73±17.94)ng/ml,ChAT的含量分別為(199.11±8.75)ng/ml、(187.42±10.63)ng/ml、(191.75±11.53)ng/ml、(202.15±10.86)ng/ml,GSH的含量分別為(228.16±8.92) ng/ml、(198.14±13.76) ng/ml、(210.75±11.93)ng/ml、(231.59±16.82) ng/ml,高于模型組,P<0.01,且高劑量組的增加作用最為顯著。

      2.3 人參皂苷Re對(duì)東莨菪堿致癡呆小鼠神經(jīng)組織元的影響

      模型組HE染色切片中神經(jīng)錐體細(xì)胞數(shù)量(403±27)個(gè)明顯少于對(duì)照組(576±34)個(gè),P<0.01。多奈哌齊組、人參皂苷Re低、中、高劑量組HE染色切片中神經(jīng)錐體細(xì)胞數(shù)量(520.67±43)個(gè)、(470±25)個(gè)、(503±28)個(gè)、(545±30)個(gè),明顯高于模型組,P<0.01。

      3討論

      東莨菪堿會(huì)導(dǎo)致野生型小鼠膽堿能下降、炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)、腦組織病理學(xué)變化[7],口服人參皂苷Re小鼠上臺(tái)時(shí)間明顯降低,說(shuō)明人參皂苷Re能改善東莨菪堿導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。大腦中AChE、ChAT、GSH水平的降低是導(dǎo)致AD患者認(rèn)知發(fā)生障礙的原因之一,同樣MDA是氧化應(yīng)激反應(yīng)的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物,它能加劇神經(jīng)元的損傷[8]??诜藚⒃碥誖e使小鼠腦內(nèi)AChE、ChAT、GSH升高,MDA降低。因此,人參皂苷Re的記憶改善作用可能與增強(qiáng)膽堿能、抗氧化功能有關(guān)。

      東莨菪堿導(dǎo)致C57BL/6J小鼠大腦中皮層出現(xiàn)高水平的IL-6和TNF-α。IL-6和TNF-α作為神經(jīng)細(xì)胞釋放的炎癥因子,會(huì)引起神經(jīng)炎癥反應(yīng),引發(fā)癡呆。本研究中,給予人參皂苷Re能夠顯著抑制小鼠腦內(nèi)IL-6和TNF-α水平,進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

      綜上,人參皂苷Re具有改善C57BL/6J小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙作用,該作用可能與增加AChE、ChAT含量改善膽堿能系統(tǒng),增加GSH含量的抗氧化作用,及抑制MDA、IL-6,TNF-α的抗炎作用有關(guān),為人參皂苷Re的臨床應(yīng)用提供重要理論基礎(chǔ)。

      參考文獻(xiàn)

      [1] M L Calio,A C Mosini,D S Marinho, et al.Leptin enhances adult neurogenesis and reduces pathological features in a transgenic mouse model of Alzheimers disease, Neurobiology of disease 148 (2021), 105219.

      [2] A Kumar,A Singh.A review on Alzheimers disease pathophysiology and its management:an update,Pharmacol.Rep.67(2)(2015)195–203.

      [3] I O Ishola,M O Osele,M C Chijioke,et al.Isorhamnetin enhanced cortico-hippocampal learning and memory capability in mice with scopolamineinduced amnesia:role of antioxidant defense, cholinergic and BDNF signaling,Brain Res.1712(2019)188–196.

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      [8] Wang Y,Li Y,Yang W,et al.Ginsenoside Rb1 inhibit apoptosis in rat model of Alzheimers disease induced by Aβ1-40.Am.J.Transl.Res.2018,10,796–805.

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