維吾爾藥材睡蓮花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

趙榮梅 艾買提江·阿衣甫別克 徐鴻 于新蘭 馬國明

【摘要】目的：建立維吾爾藥材睡蓮花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用顯微鑒別、TLC法鑒別;對水分、灰分、酸不溶性灰分、浸出物進(jìn)行檢查;采用HPLC法測定睡蓮花中山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量。色譜柱為C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫;檢測波長為350nm。結(jié)果：對睡蓮花藥材的性狀、顯微特征進(jìn)行了描述、TLC色譜斑點清晰，水分、灰分、酸不溶灰分的含量分別不得超過12.0%，12.0%，2.0%，浸出物不得少于30.0%，山柰酚-3-O-蕓香糖苷在5.11～51.07μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999），平均回收率為98.0%，RSD為1.1%（n=9）。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確、簡便、靈敏度高，能有效控制睡蓮花藥材的質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】睡蓮花;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);山柰酚-3-O-蕓香糖苷;薄層色譜法;高效液相色譜法

【中圖分類號】R284【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號】1007-8517（2022）11-0027-05

StudyonQualityStandardofUygurMedicineNymphaeaCandida

ZHAORongmeiAmatjan·Ayupbek*XUHongYUXinlanMAGuoming

XinJiangUygurAutonomousRegionInstituteforDrugControl，NMPAKeyLaboratoryfor

QualityControlofTraditionalChineseMedicine，UyghurMedicine，Urumqi830054，China

Abstract：ObjectiveToestablishthequalitystandardofUygurMedicineNymphaeaCandida.MethodsTheNymphaeaCandidawasidentifiedwiththemethodofMicroscopicidentificationandthin-layerchromatography（TLC），Thecontentofmoisture，totalash，acid-insolubleashandextractweredetermined.andtheHPLCmethodwasusedtodeterminethecontentsofkaempferol-3-O-rutinosideinNymphaeaCandidawithC18column（250mm×4.6mm，5μm）.ThemobilephaseAwasacetonitrile，ThemobilephaseBwas0.1%phosphoricacid.gradientelutionandthedetectionwavelengthwas350nm.ResultsThecharacterandmicroscopiccharacteristicsofCymbopogoncaesiusweredescribed.TLCidentificationmethodwasestablishedandthespotswereclearandwell-separated.Thecontentofmoisturecouldnotmorethan12.0%，totalashcouldnotbemorethan12.0%，acid-insolubleashcouldnotbemorethan2.0%，andextractcouldnotbelessthan30.0%，Thecalibrationcurveofkaempferol-3-O-rutinosideshowedagoodlinearintherangeof5.11～51.07μg/mL（r=0.9999）andtheaveragerecoverywas98.0%，RSDwas1.1%（n=9）.ConclusionThemethodwasaccurate，simple，andsensitive，whichcouldbeusedforthequalitycontroloftheNymphaeaCandida.

Keywords：NymphaeaCandida;QualityStandard;Kaempferol-3-O-rutinoside;TLC;HPLC

睡蓮花是睡蓮科睡蓮屬植物雪白睡蓮（Nymphaeacandida）的干燥花蕾，該植物生在池沼中，分布廣泛，主產(chǎn)于新疆伊犁、阿勒泰和博湖地區(qū)，西伯利亞、中亞、歐洲也有分布[1]。維吾爾醫(yī)認(rèn)為睡蓮花性質(zhì)二級濕寒，具有降熱止渴、益心護(hù)腦、祛乃孜來等功效，用于感冒發(fā)熱、頭痛咳嗽、心悸不安、咽痛解毒等[2-3]。文獻(xiàn)[4-10]報道，睡蓮花含有黃芪苷、煙花苷、紫云英苷、槲皮素3-O-木糖苷、槲皮素、槲皮素3′-O-β-D-吡喃木糖苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、蘆丁等化學(xué)成分。

睡蓮花作為維吾爾醫(yī)的常用藥材，在祖卡木顆粒、炎消迪娜兒糖漿、降熱比那甫西糖漿等成藥的處方中均有使用?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》維吾爾藥分冊中[3]，內(nèi)容只有性狀、粉末顯微鑒別等項目。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善導(dǎo)致企業(yè)無法全面控制藥材質(zhì)量。本研究的目的在于對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)研究，保證用藥安全。

1儀器與材料

1.1儀器BX-51型生物顯微照相系統(tǒng)（OLYMPUS）;CAMAGTLCVisualizer型薄層色譜成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪）;KUDOSSK7210LHC型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）;CAMAGAUTOMATICTLCSAMPLER4全自動點樣儀;高效液相色譜儀（Agilent1260型，DAD檢測器;島津LC-2010型，VWD檢測器;ThermoUlltimate3000型;紫外檢測器）;MS204S型電子天平（Mettlertoledo）;XT-1000A型高速多功能粉碎機（浙江永康市紅太陽機電有限公司）。

1.2材料山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品（批號：112007-201602，含量：90.8%，中國食品藥品檢定研究院），硅膠G薄層預(yù)制板（批號：20200430，煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所）;甲醇、乙腈為色譜級（ThermoFisher），其他試劑均為分析純。

睡蓮花藥材購自于新疆不同地區(qū)民族藥材市場和民族醫(yī)院，共19批次（產(chǎn)地為新疆的樣品批號為：yfb1712004、yfb1712005、yfb1712006、Y1711021、H30134102、SLH-YP-170830、20170903;產(chǎn)地為巴基斯坦的樣品批號為：20170905、1706018、170422;產(chǎn)地為河北白洋淀的樣品批號為：yfb1712001、yfb1712002、yfb1712003、yfb1712007、yfb1712008、yfb1712009、Y1709009;產(chǎn)地為云南的樣品批號為：201608;產(chǎn)地為成都的樣品批號為：20170904）。由新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗研究院蘇來曼·哈力克教授鑒定為睡蓮科睡蓮屬雪白睡蓮Nymphaeacandida。

2方法與結(jié)果

2.1性狀本品呈圓錐形或長圓形，多皺縮破碎?；ɡ匍L2.5～4.5cm，直徑約2cm，花托略呈方形。殘留花梗，有縱棱，表面被短絨毛?；ㄝ?，革質(zhì)，近離生，長卵狀披針形，無毛，表面綠色或黃棕色。剝?nèi)セㄝ嗫梢姲咨螯S白色花瓣。雄蕊多數(shù)，花藥線形，花絲扁平，幾與花藥等長。子房球形或橢圓形，無花柱或極短，柱頭密排成輪狀，中部有凹陷。氣微，味淡。如圖1所示。

2.2顯微鑒別分別取藥材細(xì)粉適量，置載玻片上，加水合氯醛溶液透化后，置顯微鏡下觀察，拍照記錄。如圖2所示。結(jié)果可見：腺毛頭部類圓形，由1～3細(xì)胞組成。非腺毛海星狀，或碎斷，基部細(xì)胞類方形，表面附有大量草酸鈣方晶?；ǚ哿ｎ悎A形，直徑30～60μm。薄壁細(xì)胞中可見大量草酸鈣結(jié)晶（砂晶、方晶或簇晶）。

2.3TLC鑒別取本品粉末1g，加甲醇10mL，超聲處理20min，濾過，作為供試品溶液。另取山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品適量，加甲醇制成1mL含0.2mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗，吸取上述兩種溶液3μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點。如圖3所示。

2.4水分測定按照《中國藥典》2020年版四部通則“0832第二法”測定水分。見表1。

2.5總灰分和酸不溶性灰分測定按照《中國藥典》2020年版四部通則“2302灰分測定法”測定。見表1。

2.6浸出物測定按照《中國藥典》2020年版四部通則“2201浸出物測定法”測定，以水和不同濃度的乙醇為溶劑，采用熱浸法和冷浸法分別測定浸出物含量，確定提取方式為以70%乙醇溶液為溶劑，采用熱浸法測定醇溶性浸出物含量。見表1。

2.7含量測定方法的建立

2.7.1色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，按表2中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;檢測波長為350nm，流速為1.0mL/min;進(jìn)樣量為20μL。理論板數(shù)按山柰酚-3-O-蕓香糖苷峰計算應(yīng)不低于4000。

2.7.2對照品溶液的制備取山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇分別制成每1mL含24μg的溶液，即可。

2.7.3供試品溶液的制備取樣品粉末（過三號篩）約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.7.4系統(tǒng)適用性試驗

2.7.4.1線性關(guān)系的考察精密量取山柰酚-3-O-蕓香糖苷對照品溶液（51.07μg/mL）1、2、3、4、6、8、10mL，分別置于10mL量瓶中，加70%乙醇稀釋制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.7.1”色譜條件測定，以對照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=16.936×C+1.7465（r=0.9999）。結(jié)果表明，山柰酚-3-O-蕓香糖苷濃度在5.11～51.07μg/mL范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.7.4.2重復(fù)性試驗取同一批號供試品（批號：SLH-YP-170830），按照“2.7.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.7.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，測定山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量。以6次測定結(jié)果計算RSD值，結(jié)果山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量的RSD值為1.76%（n=6），表明本方法的重復(fù)性良好。

2.7.4.3穩(wěn)定性試驗取同一批號供試品溶液（批號：SLH-YP-170830），分別于0、2、4、6、8、12、14、18、24和32h進(jìn)樣分析，測定山柰酚-3-O-蕓香糖苷的峰面積。以10次測定的峰面積值計算RSD值，結(jié)果山柰酚-3-O-蕓香糖苷峰面積的RSD值為0.32%。表明供試品溶液在室溫放置32h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.4.4精密度試驗取同一批號供試品溶液（批號：SLH-YP-170830），按照“2.7.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以6次峰面積值計算RSD值。結(jié)果山柰酚-3-O-蕓香糖苷峰面積的RSD值為0.28%，表明本方法精密度良好。

2.7.4.5回收率試驗精密稱取已知含量的供試品（批號：SLH-YP-170830）0.1g，9份，分別置于置具塞錐形瓶中，精密加入對照品溶液適量，按照“2.7.3”項下方法制備得到高、中、低濃度的加標(biāo)溶液。按照“2.7.1”色譜條件進(jìn)樣分析，計算山柰酚-3-O-蕓香糖苷回收率。結(jié)果見表3。

2.7.4.6靈敏度當(dāng)S/N為3時，溶液濃度為檢出限，即為0.145μg/mL，RSD為1.9%;當(dāng)S/N為10時，溶液濃度為定量限，即為1.146μg/mL，RSD為1.8%。

2.7.5供試品的測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按照“2.7.1”色譜條件測定，即得，按干燥品以外標(biāo)法計算含量。如圖4所示及表4。

3討論

3.1含量測定方法的考察在考察樣品前處理方法時，采用50%、70%、100%的甲醇和乙醇溶液作為提取溶劑，以1∶100、1∶125、1∶250、1∶500作為料理比，超聲時間分別為15、20、25和30min提取，對同一批次睡蓮花樣品中的山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量進(jìn)行測定，選擇含量最高的提取方式為70%乙醇溶液為溶劑，超聲功率為250W，超聲時間為30min。在考察方法耐用性時，分別考察了不同品牌高效液相色譜儀、不同品牌及批號的同類型色譜柱、儀器流速、儀器柱溫對含量測定結(jié)果的影響。實驗結(jié)果表明，這些影響因素均未對測定結(jié)果有明顯的影響。

3.2檢驗項目限度的初步探索本研究收集的樣品具有代表性，水分含量為8.12%～10.39%，平均值為9.35%;總灰分含量為8.22%～11.76%，平均值為9.83%;酸不溶性灰分為0.11%～2.30%，平均值為1.18%;浸出物含量為31.47%～40.79%，平均含量為35.63%。與藥材生長環(huán)境、產(chǎn)地的大陸性氣候、炮制等相結(jié)合，擬定藥材水分限度為不得過12.0%;總灰分限度為不得過12.0%;酸不溶性灰分限度為不得過2.0%;浸出物含量限度為不得低于30.0%。山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量（%）為0.22%±0.035%（n=19），按照國家藥典委員會中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求，按其平均值的±20%作為限度的制定幅度，以干燥品來計算含量，擬定含量限度為不得少于0.17%，并列入該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案正文內(nèi)容。

《中國植物志》中記載標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的雪白睡蓮在國內(nèi)產(chǎn)于新疆，本課題組在收集樣品時發(fā)現(xiàn)我國云南、成都、河北等地也生長雪白睡蓮。因此，本課題組將這些產(chǎn)地的雪白睡蓮也納入研究范圍，通過數(shù)據(jù)分析得知，河北白洋淀產(chǎn)的水分、總灰分和酸不溶性灰分含量最高，新疆和巴基斯坦進(jìn)口的次之，成都和云南產(chǎn)的最低;但成都和云南產(chǎn)的浸出物和煙花苷含量最高，新疆和巴基斯坦進(jìn)口的次之，河北白洋淀產(chǎn)的最低。此次對睡蓮花藥材進(jìn)行了系統(tǒng)研究，修訂了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)較全面反應(yīng)睡蓮花藥材的質(zhì)量。通過此次對雪白睡蓮花的初步探索，對藥材流通和質(zhì)量監(jiān)管方面具有一定的意義。

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（收稿日期：2021-10-12編輯：陶希睿）

作者簡介：趙榮梅（1981-），女，漢族，碩士，副高級實驗師，研究方向為中藥、民族藥標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量評價。E-mail：409083921@qq.com

通信作者：艾買提江·阿衣甫別克（1973-），男，柯爾克孜族，博士，副主任藥師，研究方向為中藥、民族藥標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量評價。E-mail：1009235058@qq.com