陸應(yīng)彩 彭霞 李清 卯明霞 仁紹坤
【摘要】目的:建立紅花臭牡丹根飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法:觀察紅花臭牡丹根性狀和顯微鑒別特征;參照《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2005年版第三冊·傣族藥)及《中國藥典》(2015年版四部)建立薄層鑒別方法;照《中國藥典》(2015年版四部)測定水分、總灰分、酸不溶性灰分、砷鹽、重金屬、有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量、浸出物;采用分光光度法通過線性關(guān)系、準(zhǔn)確度、精密度、不同產(chǎn)地以及試驗(yàn)條件的考察來建立紅花臭牡丹根中總黃酮的含量測定方法,檢測波長為357nm。結(jié)果:性狀及鑒別方法專屬性好,3個(gè)不同產(chǎn)地10批紅花臭牡丹根飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物及總黃酮的含量的平均值分別為5.93%、2.24%、0.12%、13.57%、5.47%。砷鹽均符合規(guī)定、重金屬均小于百萬分之十、有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量均未檢出。結(jié)論:所建立方法可應(yīng)用于紅花臭牡丹根飲片的質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】紅花臭牡丹根飲片;紫外分光光度法;蘆丁;薄層色譜法;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
【中圖分類號】R282.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號】1007-8517(2022)11-0036-05
StudyonQualityStandardofClerodendrumjaponicum(Thunb.)SweewithDaimedicine
LUYingcaiPENGXia*LIQingMAOMingxiaRENShaokun
XishuangbannaInstituteForFoodandDrugControl,Jinhong666100,China
Abstract:ObjectiveTosetupqualitystandardsofClerodendrumjaponicum(Thunb.)Swee.MethodsToobservetherootcharacterandmicroscopicidentificationcharacteristicsofpeonyroseus;establishthinlayeridentificationmethodaccordingtoYunnanTraditionalChinesemedicinestandard(Volume3of2005editionDaimedicine)andfourpartsofChinesePharmacopoeia2015;determinewater,totalash,acidinsolubleash,arsenicsalt,heavymetal,organochlorinepesticideresidueandextractaccordingtofourpartsofChinesePharmacopoeia2015edition;collectThedeterminationmethodoftotalflavonoidsintherootofpeonyodoratumwasestablishedbySpectrophotometrywithlinearrelation,accuracy,precision,differentproductionareaandtestconditions.Thedetectionwavelengthwas357nm.ResultsThecharactersandidentificationmethodswerespecific.Theaveragecontentsofwater,totalash,acidinsolubleash,extractandtotalflavonoidsin10batchesofrootofPaeoniasuffruticosafromthreedifferentproducingareaswere5.93%、2.24%、0.12%、13.57%、5.47%.Theresultsshowedthatarsenicsaltmettherequirements,heavymetalswerelessthan10partspermillion,andorganochlorinepesticideresidueswerenotdetected.ConclusionTheestablishedmethodcanbeappliedtothequalitycontrolofClerodendrumjaponicum(Thunb.)Swee.
Keywords:TheRootofClerodendrumjaponicum(Thunb.)Swee;UVSpectrophotometry;Rutin;ThinLayerChromatography;QualityStandard
紅花臭牡丹根飲片為馬鞭草科植物赪桐Clerodendrumjaponicum(Thunb.)Sweet的干燥根的加工炮制品。紅花臭牡丹根的藥材標(biāo)準(zhǔn)收載于《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》2005年版第三冊[1],西雙版納地區(qū)傣醫(yī)將紅花臭牡丹根稱為“哈賓亮”,意譯為“療效顯著,名貴價(jià)高”[2-5],傣醫(yī)是四大民族醫(yī)藥之一,紅花臭牡丹根、葉均作藥用,為傣醫(yī)常用藥,具有清火解毒、活血止血、調(diào)經(jīng)通乳、除風(fēng)止痛、補(bǔ)土健胃的功效,用于治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、赤白帶下、產(chǎn)后缺乳;六淋證出現(xiàn)的小便熱澀疼痛、尿黃、尿血;睪丸腫痛;脘腹脹痛,不思飲食,四肢乏力;風(fēng)濕病關(guān)節(jié)肌肉腫痛[2-5]。預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]表明,紅花臭牡丹根主要含有鞣質(zhì)、酚酸類、黃酮類及揮發(fā)油等成分。近代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有神經(jīng)保護(hù)、抗心肌缺血、抗胃潰瘍、抗炎、抗腫瘤以及降糖等藥理作用[8-11]。而目前尚無紅花臭牡丹根飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[1-2]。故本文建立紅花臭牡丹根飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[12],且參照《赪桐根中總黃酮的提取工藝》[7]及《腎茶總黃酮的含量測定》[13]采用蘆丁為對照品,NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色后,用紫外分光光度法對紅花臭牡丹根飲片中總黃酮的含量進(jìn)行研究以有效控制其質(zhì)量并為其應(yīng)用提供保障。紅花臭牡丹植物圖如圖1。
1儀器與材料
1.1儀器UV-2600紫外分光光度計(jì)(島津);BGZ-76電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);SX2-4-10箱式電阻爐;TLCVisualizer2薄層色譜成像儀(瑞士卡瑪);OLYMPUSBX41生物顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司);BL310天平(德國賽多利斯集團(tuán));AE200電子天平[梅特勒-托里多儀器(上海)有限公司,型號:MS205DU];LC-300B數(shù)控超聲波清洗器(濟(jì)南市中區(qū)魯超儀器廠);UPH-IV-20T超出水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司);DFT-100A高速萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司);DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司);CAMAGLinomat5半自動薄層點(diǎn)樣儀(瑞士卡瑪);TLCVisualizer2薄層色譜成像儀(瑞士卡瑪);RE-20000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SPS-04L氣相色譜儀(安捷倫科技)。
1.2試藥不同產(chǎn)地的10批藥材分別采自云南景洪市、云南勐??h、云南勐臘縣。由西雙版納州食品藥品檢驗(yàn)所彭霞主任藥師鑒定為馬鞭草科植物臭茉莉ClerodendrumphilippinumSchau.var.simplexC.Y.WuetR.C.Fang。蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:100080-201610,含量UV法測定,以92.6%計(jì))。無水乙醇(分析純)、氫氧化鈉(優(yōu)級純)、亞硝酸鈉(分析純)、硝酸鋁(分析純)、石油醚(分析純)、丙酮(分析純)、鹽酸(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)、硫酸(分析純)、二氯化鉀、水合氯醛等均為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn),水為蒸餾水。
2方法與結(jié)果
2.1性狀本品為大小不一的類圓形及不規(guī)則塊片,厚0.2~1.0cm。外表面灰棕色至黃棕色,具不規(guī)則細(xì)皺紋,有少數(shù)凸起的支根痕。質(zhì)硬,切面皮部較薄,木部寬廣,黃白色,有橫向裂紋,有的莖木髓部中空。氣微,味淡。如圖2所示。
2.2顯微特征粉末淡黃色。木栓細(xì)胞黃棕色,類長方形或類多角形,壁不甚厚;韌皮纖維多單個(gè)散在,長梭形,壁厚,孔溝明顯,直徑約為17~19μm;木纖維成束,孔溝不明顯,直徑約為16~17μm。導(dǎo)管為具緣紋孔,紋孔排列緊密,直徑約為43~59μm;石細(xì)胞眾多,呈類方形、類長方形或類三角形,單個(gè)散在或集聚成群,壁厚,孔溝明顯,胞腔內(nèi)大多含草酸鈣方晶,直徑25~50μm。淀粉粒眾多,大小不一,多單粒,呈類圓形或類橢圓形,臍點(diǎn)十字形、裂縫狀、點(diǎn)狀,直徑4~12μm;復(fù)粒多由2~4分粒組成。草酸鈣方晶直徑11~22μm?!对颇鲜≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]收載“紅花臭牡丹根”項(xiàng)下,未入標(biāo)準(zhǔn)。如圖3所示。
2.3薄層色譜鑒別取本品粉末1g,加乙醇15mL,超聲處理20min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)右掖?mL使溶解,作為供試品溶液。另取紅花臭牡丹根對照藥材1g,同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》四部通則0502)[14]試驗(yàn),吸取上述兩種溶液各10μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(60~90℃)-丙酮(8∶2)為展開劑,展開,取出,晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。
《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]收載“紅花臭牡丹根”項(xiàng)下有薄層色譜鑒別一項(xiàng)。已納入標(biāo)準(zhǔn)。按照藥材薄層色譜條件,檢測三個(gè)不同產(chǎn)地10批紅花臭牡丹根飲片,薄層色譜圖均一致,重現(xiàn)性好,符合規(guī)定,納入標(biāo)準(zhǔn)。如圖4所示。
2.4檢查項(xiàng)與浸出物參照《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]收載“紅花臭牡丹根藥材”項(xiàng)下的規(guī)定及《中國藥典》(2015版四部通則)[14]測定三個(gè)不同產(chǎn)地10批紅花臭牡丹根飲片樣品的水分(通則0832第二法)、總灰分(通則2302)、酸不溶性灰分(通則2302)、砷鹽(通則0822第一法),重金屬(通則0821第二法)、有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量(通則2341,測定9種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量)總六六六(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC之和)、總滴滴涕(p,p'-DDE、p,p'-DDD、o,p'-DDT、p,p'-DDT之和)、五氯硝基苯;浸出物(通則2201用水作溶劑照水溶性浸出物測定法項(xiàng)下的熱浸法)。各項(xiàng)測定結(jié)果均符合規(guī)定,結(jié)果均見表1。
2.5總黃酮的的含量測定
2.5.1對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品適量,置100mL量瓶中,加乙醇適量,超聲處理使溶解,放冷,加乙醇至刻度,搖勻。精密量取20mL,置50mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,即得(每1mL中含蘆丁0.3mg)。
2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對照品溶液0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、5、6mL,分別置于25mL量瓶中,各加水至6mL,加5%亞硝酸鈉溶液1mL,搖勻,放置6min,加10%硝酸鋁溶液1mL,搖勻,放置6min,加氫氧化鈉試液10mL,再加水至刻度,搖勻,放置15min,以相應(yīng)試劑為空白,按照紫外-可見分光光度法(通則0401)[14],在357nm波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.5.3測定法取本品粉末約0.25g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入80%乙醇溶液100mL,稱定重量,置85℃水浴上回流1h,放至室溫,稱定重量,用80%乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液10mL,置25mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,精密量取5mL,置25mL量瓶中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法,自“加水至6mL”起依法測定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量。按干燥品計(jì)算,含總黃酮以蘆?。–27H30O16)計(jì)算。
2.5.4吸收光譜的測定、光譜一致性檢測精密吸取蘆丁對照品溶液、供試品溶液各5mL,分別置于25mL量瓶中,照分光光度法,在200~800nm波長范圍內(nèi)測定吸收光譜,結(jié)果蘆丁對照品與供試品光譜吸收圖譜基本一致,在357nm處有最大吸收。參照赪桐根中總黃酮的提取工藝優(yōu)選[7]及腎茶中總黃酮的含量測定方法[2],選取357nm為檢測波長。
2.5.5線性關(guān)系考察精密量取蘆丁對照品溶液0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、5、6mL(相當(dāng)于蘆丁2.86282、5.72567、8.58846、11.45129、22.90257、34.35386、45.80515、57.25643、68.70772μg/mL),按上述測定法測定吸收度,以吸收度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得回歸方程:Y=0.0287528X+0.00831103,r2=0.99985,結(jié)果表明蘆丁在2~68μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.5.6精密度試驗(yàn)取同一批樣品6份(產(chǎn)地:西雙版納景洪市曼蚌湯,批號:20190702),按供試品測定方法測定,總黃酮的平均含量為5.32%,RSD為1.5%。
2.5.7重復(fù)性試驗(yàn)精密量取2.5.1對照品溶液(22.90257μg/mL),按“2.3”項(xiàng)下方法操作,依次測定7次,以吸收度值計(jì)算RSD為0.16%,結(jié)果符合要求。
2.5.8加樣回收率試驗(yàn)根據(jù)《中國藥典》2015版四部(通則9101)[14],藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中準(zhǔn)確度相關(guān)規(guī)定,設(shè)計(jì)同一濃度,9份供試品溶液按2.5.3方法進(jìn)行測定。該分析方法的回收率為101.17%~107.89.20%,且RSD為2.4%,結(jié)果符合要求。
2.5.9樣品測定取不同產(chǎn)地的10批紅花臭牡丹根飲片,按照上述方法制備供試品溶液,按2.5.2確定工作曲線,以干燥品計(jì)算總黃酮含量。測定結(jié)果均符合規(guī)定,結(jié)果見表1。
3討論
3.1試驗(yàn)條件的考察
3.1.1含量測定試驗(yàn)以蘆丁為對照品采用分光光度法,以相應(yīng)的試劑為空白,分別考察溶劑:50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇;提取方式:回流提取時(shí)間分別為60min、90min、120min;回流溫度分別為75℃、85℃、95℃;超聲處理分別為30min、45min、60min;溶劑量分別為25mL、50mL、100mL;取樣量分別為0.25g、0.5g、1.0g、1.5g制備的供試品溶液,在357nm波長處測定吸光度,計(jì)算總黃酮的含量。結(jié)果表明,取樣量為0.25g,100mL80%乙醇為溶劑85℃回流提取,紅花臭牡丹根中總黃酮的溶出量最大,因此選取此方法制備供試品溶液。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明供試品溶液在30分鐘內(nèi)穩(wěn)定性良好。
3.1.2薄層色譜鑒別本次飲片研究考察了薄層色譜的耐用性。不同廠牌的薄層板,硅膠G薄層板(青島海洋化工廠、青島譜科分離材料有限公司、青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司);其它的方法驗(yàn)證《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]已收載。
3.2限度擬定各項(xiàng)限度是根據(jù)各測定結(jié)果照《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2005年版第三冊·傣族藥)[1]收載“紅花臭牡丹根藥材”項(xiàng)下的限度擬定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行擬定,具體見表1。鑒于砷鹽均符合規(guī)定暫不納入標(biāo)準(zhǔn),重金屬均小于百萬分之十暫不納入標(biāo)準(zhǔn),有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量中總六六六(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC之和)、總滴滴涕(p,p'-DDE、p,p'-DDD、o,p'-DDT、p,p'-DDT之和)、五氯硝基苯均未檢出故不納入標(biāo)準(zhǔn)。
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(收稿日期:2021-10-02編輯:劉斌)
作者簡介:陸應(yīng)彩(1982-),女,布依族,本科,副主任藥師,研究方向?yàn)橹写鏊幊煞址治黾皹?biāo)準(zhǔn)研究。E-mail:503889408@qq.com
通信作者:彭霞(1966-),女,彝族,本科,主任藥師,研究方向?yàn)橹写鏊幊煞址治黾皹?biāo)準(zhǔn)研究。E-mail:425580460@qq.com