陳菊

【摘 要】 目的：優(yōu)化黔東南續(xù)斷中多糖的提取工藝，研究續(xù)斷多糖的抗氧化活性。方法：選擇料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化續(xù)斷多糖提取工藝，并研究續(xù)斷中多糖的抗氧活性。結(jié)果：續(xù)斷多糖的最佳提取工藝為：料液比1∶25（g·mL-1）、提取溫度91 ℃、提取時(shí)間90 min、提取次數(shù)3次，在此條件下多糖的平均提取率為4.74%。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)續(xù)斷多糖具有較好的抗氧化活性。結(jié)論：優(yōu)化后的工藝簡便、合理、可行。續(xù)斷中多糖具有抗氧化活性。

【關(guān)鍵詞】 續(xù)斷;多糖;響應(yīng)面分析;抗氧化性

【中圖分類號】R284.2?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2022）12-0025-06

Optimization of Extraction Technology of Polysaccharides from Dipsaci Radix

in Guizhou Province and Its Antioxidant Activity

CHEN Ju

Qiandongnan National Polytechnic，Kaili 556000，China

Abstract：Objective? To optimize the extraction process of polysaccharides from Qiandongnan local Dipsaci Radix，and study the antioxidantiong of polysaccharides from Dipsaci Radix.Methods The material-liquid ratio，extraction temperature， extraction time and extraction times were selected for single factor experiment. The response surface method was used to optimize the extraction process of polysaccharides from Dipsaci Radix，and the antioxidant activity of that was tested. Results? The optimum extraction conditions was as follows： material-liquid ratio 1∶25 （g/mL）， extraction temperature 90 ℃，extraction time 90min， extraction times 3 times. Under these? conditions， the average extraction rate of polysaccharides reaches 4.74%.In vitro experiments showed that the polysaccharides in Dipsaci Radix had good antioxidant activity.Conclusion The optimized process is simple，reasonable and feasible.The polysaccharide in Dipsaci Radix has antioxidantiong.

Dipsaci Radix;Polysaccharides;Response Surface Analysis;Antioxidantiong

續(xù)斷，為川續(xù)斷科，多年生草本植物，俗稱接骨草、南草、和尚頭等，臨床上常用于肝腎不足、腰膝酸軟、風(fēng)濕痹痛、跌撲損傷、筋傷骨折、崩漏、胎漏等疾病[1]。貴州是續(xù)斷的主產(chǎn)區(qū)之一，在其東南部境內(nèi)，常常生于路旁、溝邊、田埂及撂荒土地等潮濕處。目前對續(xù)斷的研究主要是其中的三萜皂苷類、揮發(fā)油、生物堿[2-3]等化學(xué)成分，續(xù)斷中還含有多糖成分，有關(guān)利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化續(xù)斷多糖提取工藝及其抗氧化特性方面的研究鮮見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以黔東南產(chǎn)續(xù)斷為材料，提取續(xù)斷中的多糖，采用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，并在體外測定其抗氧化活性，以期為進(jìn)一步開發(fā)和利用續(xù)斷資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 續(xù)斷采自黔東南州境內(nèi)，洗凈，烘干;苯酚、濃硫酸、葡萄糖、1，1-二苯基-2-苦肼自由基（DPPH·）、維生素C、雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸、無水乙醇、正丁醇、丙酮，分析純;蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制。

UV8000S紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司;MS204S型電子分析天平（精確度0.0001g），梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司）;SYG-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器制造有限公司;EV311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，北京萊伯泰科儀器有限公司;DUG-90764型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 續(xù)斷多糖的提取 續(xù)斷烘干品，粉粹→粗粉（5 g），石油醚脫脂2次→以90%乙醇超聲提取2～3次→抽濾，棄去濾液，殘?jiān)铀?，水浴提取→活性炭脫色→減壓抽濾→用Sevag法脫蛋白→定容→測吸光度→計(jì)算提取率。

1.2.2 續(xù)斷多糖提取率的測定 精密稱取無水葡萄糖對照品0.0116 g，置于100 mL量瓶中，加水適量使溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液（每1 mL中含無水葡萄糖0.116 mg）。精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置具塞試管中，并加水補(bǔ)至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，濃硫酸5 mL，搖勻，于水浴中加熱15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以蒸餾水作為空白，在490 nm的波長處測定吸光度[4]。以葡萄糖對照品的質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出回歸方程：A=16.310C-0.075（R2=0.9998）。續(xù)斷多糖提取率按（1）式計(jì)算

多糖提取率=C×V×NW×100%（1）

式中：C為續(xù)斷提取液中多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL;V為續(xù)斷多糖的定容體積（mL）;N為稀釋倍數(shù);W為樣品的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 選取料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g·mL-1））、提取時(shí)間（30、60、90、120、150 min）、提取溫度（60、70、80、90、100 ℃）和提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）為單因素，分別依次按照1.2.1進(jìn)行續(xù)斷多糖提取的單因素試驗(yàn)。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)之上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用4因素3水平響應(yīng)面分析法對續(xù)斷中多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并對優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

1.2.5 續(xù)斷多糖抗氧化活性測定 取適量干燥的續(xù)斷多糖，配置成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的續(xù)斷多糖水溶液，備用。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定 參考文獻(xiàn)[5]的方法稍作修改，準(zhǔn)確移取2.0 mL 不同濃度的續(xù)斷多糖水溶液液于比色管中，加入預(yù)先配置好的2.0 mL 2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，搖勻后暗處放置30 min，以樣品溶劑為空白，測定其在517 nm 波長處吸光度A，同時(shí)測定樣品溶液在517 nm處的吸光度A0及DPPH 甲醇溶液在517 nm 處的吸光度A1，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。清除率計(jì)算如（2）式所示。

清除率（%）=（1-A-A0A1）×100%（2）

1.2.5.2 羥基自由基清除能力測定 參考文獻(xiàn)[6]的方法稍作修改，取2.0 mL 不同濃度的續(xù)斷多糖溶液，依次加入2.0 mL 6 mmol 硫酸亞鐵、2.0 mL 6 mmol 水楊酸和2.0 mL 6 mmol/mL 雙氧水，混勻后在35 ℃水浴中反應(yīng)25 min后，在536 nm處測吸光度Ai。以蒸餾水代替雙氧水測定吸光值A(chǔ)j，空白對照以2.0 mL 蒸餾水代替續(xù)斷多糖溶液測定吸光度A0。清除率計(jì)算如（3）所示。

清除率（%）=A0-（Ai-Aj）A0×100%（3）

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 單因素試驗(yàn)采用EXCEL、SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對續(xù)斷多糖提取率的影響 如圖1所示，隨著料液比的增加，續(xù)斷多糖提取率逐漸增加，當(dāng)料液比達(dá)1∶25時(shí)，提取率達(dá)最大，繼續(xù)增加料液比，提取率反而下降。這是因?yàn)橐毫媳容^小時(shí)，溶劑無法充分浸透，分子擴(kuò)散速度低，使得提取率較低，隨著液料比的增大，溶劑與續(xù)斷細(xì)胞間的濃度差增加，增大了多糖從細(xì)胞內(nèi)部向溶劑主體的擴(kuò)散系數(shù)，使提取率增大，當(dāng)料液比超過1∶25后，繼續(xù)增加溶劑，由于溶劑過多，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的其他物質(zhì)溶出，使提取率下降。因此，最佳料液比選擇1∶25。

2.1.2 提取時(shí)間對續(xù)斷多糖提取率的影響 如圖2所示，隨著提取時(shí)間的延長，續(xù)斷多糖提取率逐漸增大，當(dāng)達(dá)最大值90 min時(shí)，提取率達(dá)最大，繼續(xù)延長提取時(shí)間，提取率反而下降。其原因可能是提取時(shí)間過長，多糖經(jīng)長時(shí)間的高溫浸泡，多糖分子結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致提取率下降。因此，最佳提取時(shí)間選擇90 min。

2.1.3 提取溫度對續(xù)斷多糖提取率的影響 如圖3所示，提取溫度在60～90 ℃之間，隨著溫度的升高，續(xù)斷多糖提取率逐漸增大，當(dāng)溫度到達(dá)90 ℃時(shí)，提取率達(dá)最大值，繼續(xù)升高溫度，提取率反而下降。這可能是溫度過高，會導(dǎo)致多糖開始降解，造成提取率下降。因此，最佳提取溫度選擇90 ℃。

2.1.4 提取次數(shù)對續(xù)斷多糖提取率的影響 如圖4所示，當(dāng)提取次數(shù)在2～4之間時(shí)，續(xù)斷多糖提取率變化最為明顯，提取次數(shù)在3次時(shí)，提取率最大，提取次數(shù)超過3次以后，提取率逐漸減少。其原因可能是提取次數(shù)增多后提取液逐漸粘稠過濾困難，造成損失，導(dǎo)致提取率下降。因此，最佳提取次數(shù)選擇3次。

2.2 響應(yīng)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與優(yōu)化分析

2.2.1 回歸模型的建立和顯著性檢測 采用Design-Expert 8.0.6 分析軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)，其中4、12、13、22、27 五個(gè)試驗(yàn)為中心試驗(yàn)，其余試驗(yàn)為析因試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，續(xù)斷多糖提取率Y為響應(yīng)值。

由表2，可建立（4）式的四元二次回歸方程：

Y=4.87-0.071A+0.14B+0.093C-0.17D+0.052AB-0.012AC-0.12AD-0.047BC-0.1BD+0.11CD-0.26A2-0.14B2-0.47C2-0.22D2（4）

由表3、表4可知，該回歸模型P<0.0001，說明該二次方程模型為高度顯著，而失擬項(xiàng)不顯著（P=0.1532<0.05），說明方程擬合效果好，CV%=3.29表明試驗(yàn)的可信度和精確度高。因此，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。通過對回歸方程進(jìn)行顯著性分析可知，二次項(xiàng)B2與C2達(dá)高度顯著，二次項(xiàng)A2、D2及一次項(xiàng)B、D均達(dá)極顯著，交互項(xiàng)AB、AC、AD、BC、BD、CD對續(xù)斷多糖提取率均不顯著。因此，各因素對續(xù)斷多糖提取的影響順序從大到小依次為提取溫度、提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比。根據(jù)四元二次回歸模型，在所選取的各工藝條件范圍內(nèi)，由軟件分析得到提取續(xù)斷多糖的最佳條件為：料液比1∶24.78、提取溫度90.62 ℃、提取時(shí)間91.8 min、提取次數(shù)2.62次，此條件下多糖提取率理論上為4.91%。根據(jù)實(shí)際操作要求，選取最佳提取工藝條件為料液比1∶25、提取溫度91 ℃、提取時(shí)間90 min、提取次數(shù)3次、試驗(yàn)重復(fù)3次，得到提取率為4.74%，與理論值接近，由此得出該續(xù)斷多糖提取工藝條件具有較好的穩(wěn)定性和可操作性。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 清除DPPH自由基（DPPH·）能力測定 續(xù)斷多糖清除DPPH自由基能力如圖5所示。在續(xù)斷多糖質(zhì)量濃度0.2～1.2 mg/mL范圍內(nèi)，隨著續(xù)斷多糖質(zhì)量濃度增加，清除DPPH自由基能力增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，清除能力最強(qiáng)，達(dá)到93.9%，相同濃度下VC的清除率為105.9%，說明續(xù)斷多糖具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力。

2.3.2 清除羥基自由基（·OH）能力測定 續(xù)斷多糖清除羥基自由基能力如圖6所示。在續(xù)斷多糖質(zhì)量濃度0.2～1.2 mg/mL范圍內(nèi)，隨著續(xù)斷多糖質(zhì)量濃度增加，清除羥基自由基能力增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時(shí)，清除能力最強(qiáng)為68%，說明續(xù)斷多糖具有較強(qiáng)的清除羥基自由基能力。

3 討論

張丹等[7]運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)提取渝產(chǎn)續(xù)斷中的多糖，結(jié)果表明在料液比為1∶20（g·mL-1），提取時(shí)間60 min，提取4次的最佳工藝條件下，續(xù)斷多糖的平均提取率為7.47%，但并沒有將試驗(yàn)中的各因素與指標(biāo)的相互關(guān)系進(jìn)行擬合，建立數(shù)學(xué)模型。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法，得出影響續(xù)斷多糖提取的因素順序?yàn)樘崛囟醛兲崛〈螖?shù)﹥提取時(shí)間﹥料液比，并建立提取續(xù)斷多糖的回歸模型方程為：

Y=4.87-0.071A+0.14B+0.093C-0.17D+0.052AB-0.012AC-0.12AD-0.047BC-0.1BD+0.11CD-0.26A2-0.14B2-0.47C2-0.22D2

通過對提取工藝中的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化得到最佳提取條件為：料液比1∶25（ g·mL-1）、提取溫度91 ℃、提取時(shí)間90 min、提取3次，在該條件下續(xù)斷多糖提取率為4.74%。此法比正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)直觀，試驗(yàn)精度高，還提高了試驗(yàn)的預(yù)測性，具有較好的實(shí)用價(jià)值。

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，對DPPH自由基的清除率可以作為評價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的指標(biāo)之一[8]。羥基自由基毒性極強(qiáng)，可對生物膜造成損傷，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，清除體內(nèi)羥基自由基是確保機(jī)體健康必不可少的需求[9]。將本試驗(yàn)中最佳提取條件下的多糖提取液進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、羥基自由基的能力，說明續(xù)斷具有良好的體外抗氧化活性。因此，該研究為續(xù)斷資源在抗氧活性方面的研究提供理論參考依據(jù)。

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（收稿日期：2021-10-13 編輯：劉 斌）