黨曉婷　郇雪潔　焦倩　姜宏

[摘要]目的 探究高表達OTUD3對C6星形膠質瘤細胞增殖的影響。方法 C6膠質瘤細胞轉染Myc-OTUD3質粒載體48 h后，采用Western Blot方法檢測OTUD3蛋白表達變化;采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）細胞增殖試劑盒和細胞克隆形成實驗檢測高表達OTUD3的C6膠質瘤細胞增殖改變情況。結果 轉染Myc-OTUD3質粒載體48 h后，C6膠質瘤細胞OTUD3蛋白表達升高（t=3.472，P<0.01）。CCK-8和細胞克隆形成實驗結果顯示，高表達OTUD3的C6膠質瘤細胞增殖水平降低（F=17.326、70.345，t=3.646，P<0.05）。結論 高表達OTUD3可抑制C6星形膠質瘤細胞的增殖。

[關鍵詞]星形細胞瘤;去泛素酶類;OTUD3;細胞增殖

[中圖分類號]R338.2[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）03-0321-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.090

EFFECT OF OVEREXPRESSION OF OTUD3 ON THE PROLIFERATION OF C6 ASTROGLIOMA CELLS

DANG Xiaoting， HUAN Xuejie， JIAO Qian， JIANG Hong

（State Key Disciplines： Physiology （inIncubation）， Department of Physiology， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of overexpression of OTUD3 on the proliferation of C6 astroglioma cells.

Methods Myc-OTUD3 was transfected into C6 astroglioma cells for 48 h. Western Blot was used to determine OTUD3 protein expression changes. The Cell Counting Kit-8 （CCK-8） and colony-forming assays were used to measure the impact of OTUD3 overexpression on the proliferation of C6 astroglioma cells.Results After transfection with the Myc-OTUD3 vector for 48 h， OTUD3 protein expression was significantly increased in C6 astroglioma cells （t=3.472，P<0.01）. The CCK-8 and colony-forming assays showed that high expression of OTUD3 significantly reduced the proliferation of C6 astroglioma cells （F=17.326，70.345;t=3.646;P<0.05）.Conclusion Overexpression of OTUD3 inhibits the proliferation of C6 astroglioma cells.

[KEY WORDS] astroglioma; deubiquitinating enzymes; OTUD3; cell proliferation

膠質瘤是一種極為常見的原發(fā)性惡性顱內腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的81%[1]。目前膠質瘤的治療方法包括手術、化療和放療等，但病人的中位生存期較短，預后差[2]。因此，研究膠質瘤發(fā)生發(fā)展機制對開發(fā)新的療法有重要意義。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）是調節(jié)蛋白質最重要的體系，它通過在底物的泛素化和去泛素化之間建立動態(tài)平衡參與廣泛的細胞過程的調節(jié)，如細胞周期、DNA損傷修復、凋亡、表觀遺傳和信號轉導等[3-6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，泛素化酶和去泛素化酶參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并可能成為潛在的抗癌靶點。泛素特異性蛋白酶USP39通過誘導mRNA成熟，增加含有WW結構域的轉錄調節(jié)子1（TAZ）的蛋白水平促進膠質瘤的發(fā)展進程[7-8];而敲除去泛素化酶USP8可間接靶向 RNA結合蛋白SF2/ASF1，促進膠質瘤細胞的凋亡，從而應對膠質瘤復發(fā)[9]。OTUD3屬于卵巢腫瘤蛋白酶（OTU）家族，也是一種去泛素化酶[10]。已有研究表明，OTUD3可能在細胞環(huán)境中參與促進或抑制腫瘤的發(fā)生[11-12]。本實驗室的前期研究結果表明，與原代星形膠質細胞相比，大鼠C6星形膠質瘤細胞中的OTUD3蛋白表達顯著降低[13]。為了研究OTUD3對星形膠質瘤發(fā)生的作用，本實驗通過質粒轉染高表達OTUD3，探究過表達OUTD3對C6星形膠質瘤細胞增殖的影響?，F(xiàn)將結果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料

本實驗所用的細胞為大鼠C6星形膠質瘤細胞系，為貼壁生長的細胞。高糖DMEM細胞培養(yǎng)液（以色列BI公司），胎牛血清（FBS，北京全式金生物公司），青鏈霉素合劑、Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（北京索萊寶公司）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)C6膠質瘤細胞接種于含體積分數(shù)0.10 FBS和體積分數(shù)0.01青鏈霉素合劑的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達80%～90%時，用胰酶消化3 min，加入少量完全培養(yǎng)液終止消化，收集至50 mL離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液后加入新鮮培養(yǎng)液，用吸管輕吹充分懸浮細胞，移至新的培養(yǎng)瓶中傳代。

1.2.2細胞轉染將C6膠質瘤細胞懸液按照每孔1×105個細胞的密度接種于6孔板中，24 h后，待細胞密度達70%～80%時進行轉染。實驗分為Myc-Vector組和Myc-OTUD3組，分別轉染Myc-Vector質粒載體和Myc-OTUD3質粒載體。向Myc-Vector組的基礎培養(yǎng)液中加入Myc-Vector質粒，Myc-OTUD3組基礎培養(yǎng)液中加入Myc-OTUD3質粒，靜置5 min后與配制好的LipofectaminTM 2000混合液混合，室溫靜置10～20 min。向6孔板中每孔加入1 200 μL基礎培養(yǎng)液及300 μL質?；旌弦?，置于含體積分數(shù)0.05 CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)4～8 h后換新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。

1.2.3Western Blot檢測OTUD3蛋白表達將轉染后的C6膠質瘤細胞6孔板取出，棄上清液，每孔加入100 μL細胞裂解液冰上裂解，提取細胞蛋白。每孔上樣蛋白量為20 μg，以90 V恒定電壓電泳，300 mA恒定電流轉膜1 h，100 g/L脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。加一抗4 ℃過夜孵育，以TBST溶液清洗3次，每次10 min;加二抗室溫孵育1 h，以TBST溶液漂洗。配制ECL化學發(fā)光液進行顯影。

1.2.4CCK-8檢測細胞增殖將轉染48 h的C6膠質瘤細胞懸液按每孔100 μL接種于5個96孔板，每孔細胞數(shù)目為（3～4）×10³個。每日同一時間點向96孔板中加入CCK-8溶液10 μL，置培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)1 h，用酶標儀（美國BioTek公司）檢測波長450 nm處的吸光度，連續(xù)記錄5 d，繪制細胞生長曲線。

1.2.5細胞克隆形成實驗用胰酶消化細胞后，將C6膠質瘤細胞懸液接種于6孔板中，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2周后棄培養(yǎng)液，用預冷的PBS溶液緩慢沖洗，甲醇固定10 min，結晶紫染色10 min，觀察結晶紫染色情況，統(tǒng)計著色的細胞集落數(shù)目。

1.3統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，兩因素設計資料比較采用析因設計的方差分析。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1Myc-OTUD3質粒轉染后細胞內OTUD3蛋白表達水平的變化

Western Blot檢測結果顯示，與Myc-Vector組（0.403±0.065）相比較，Myc-OTUD3組（0.832±0.105）C6膠質瘤細胞中OTUD3蛋白表達水平明顯升高（n=6，t=3.472，P<0.01）。見圖1。

2.2過表達OTUD3對C6膠質瘤細胞增殖的影響

細胞轉染Myc-OTUD3質粒后，連續(xù)5 d檢測450 nm波長處的吸光度，析因設計的方差分析結果顯示，轉染和時間存在交互效應（F=12.300，P<0.001）。進行單獨效應分析結果顯示，與Myc-Vector組相比，Myc-OTUD3組在轉染4、5 d時的細胞增殖水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（n=6，F(xiàn)=17.326、70.345，P<0.001），表明細胞生長明顯受到抑制。見圖2。

2.3過表達OTUD3對C6膠質瘤細胞克隆形成能力的影響

細胞克隆形成實驗結晶紫染色的結果顯示，與Myc-Vector組（103.300±5.239）相比較，Myc-OTUD3組（77.670±4.702）的細胞克隆數(shù)顯著降低（n=3，t=3.646，P<0.05）。見圖3。

3討論

神經(jīng)膠質瘤是最具侵襲性的惡性腦腫瘤，具有較高的發(fā)病率和致死率。膠質母細胞瘤是最常見的膠質瘤組織學類型，約占膠質瘤的45%[14-15]。雖然基礎研究和臨床試驗已進行多年，但膠質母細胞瘤仍是成年人最致命的原發(fā)性惡性腦腫瘤之一[16-17]。目前膠質母細胞瘤的標準化治療是在可行的范圍內進行手術切除，然后進行單獨放療或化療與替莫唑胺藥物聯(lián)合治療，但預后較差[18-19]。由于腫瘤組織學相同的病人預后不同，因此研究膠質瘤中不同的分子表達變化可能是開發(fā)新的有效治療方法和提高病人生存率的有效途徑。

人類基因組中總共編碼90種去泛素化酶[20]，OTU作為去泛素化酶的一個亞型，通過調節(jié)基因轉錄、細胞周期、免疫反應、炎癥和腫瘤生長等，在多種生物調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[21-24]。含有OTU結構域的蛋白質（OTUD）是OTU的一個亞家族，OTUD3是OTU家族中的一種重要酶，由398個氨基酸組成[25]。近期的研究顯示，OTUD3在癌癥中發(fā)揮重要的作用，其表達下調與乳癌病人的不良預后相關，OTUD3作為一種腫瘤抑制因子通過直接去泛素化并穩(wěn)定P53，促進腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[26-27]。有研究表明，OTUD3作為腫瘤突變抑制因子人第10號染色體缺失并與張力蛋白同源的磷酸酶（PTEN，即MMAC1）的去泛素化酶，在乳癌OTUD3-PTEN軸中發(fā)揮去泛素化功能并穩(wěn)定PTEN，在腫瘤抑制過程中起到重要作用[11，28]。泛素特異性肽酶USP13能夠促進卵巢癌的發(fā)展和轉移[29]。此外，在肝細胞癌中OTUD3能夠通過去泛素化增強α-輔肌動蛋白4（ACTN4）的穩(wěn)定性，促進肝細胞癌的生長和轉移[30]。盡管多項研究結果已經(jīng)證明OTUD3參與癌癥的進程[31-35]，但目前關于OTUD3在膠質瘤特別是膠質母細胞瘤中發(fā)揮的細胞功能卻少有研究。

本研究團隊的前期研究結果已經(jīng)證明，與正常腦組織相比，神經(jīng)膠質瘤細胞中OTUD3的轉錄顯著下調，而C6膠質瘤細胞中OTUD3的mRNA以及蛋白表達水平明顯低于正常原代星形膠質細胞，且OTUD3高表達的膠質瘤病人比低表達的膠質瘤病人存活時間更長[13]。本次研究通過CCK-8和細胞克隆形成實驗檢測細胞增殖能力，結果表明，質粒轉染高表達OTUD3可以降低C6星形膠質瘤細胞增殖水平，進一步說明了OTUD3對膠質瘤發(fā)生的作用，為靶向治療膠質瘤提供了實驗證據(jù)。

[參考文獻]

[1]OSTROM Q T， PATIL N， CIOFFI G， et al. CBTRUS statistical report： primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2013—2017[J].? Neuro-oncology， 2020，22（12 Suppl 2）：iv1-iv96.

[2]SOZIO P， FIORITO J， DI GIACOMO V， et al. Haloperidol metabolite Ⅱ prodrug： asymmetric synthesis and biological evaluation on rat C6 glioma cells[J].? European Journal of Medicinal Chemistry， 2015，90：1-9.

[3]XIANG T X， LI L L， YIN X D， et al. The ubiquitin peptidase UCHL1 induces G₀/G₁cell cycle arrest and apoptosis through stabilizing p53 and is frequently silenced in breast cancer[J].? PLoS One， 2012，7（1）：e29783.

[4]NAGAMACHI A， NAKATA Y， UEDA T， et al. Acquired deficiency of A20 results in rapid apoptosis， systemic inflammation， and abnormal hematopoietic stem cell function[J].? PLoS One， 2014，9（1）：e87425.

[5]JIN W L， MAO X Y， QIU G Z. Targeting deubiquitinating enzymes in glioblastoma multiforme： expectations and challenges[J].? Medicinal Research Reviews， 2017，37（3）：627-661.

[6]LANCINI C， VAN DEN BERK P C， VISSERS J H， et al. Tight regulation of ubiquitin-mediated DNA damage response by USP3 preserves the functional integrity of hematopoietic stem cells[J].? The Journal of Experimental Medicine， 2014，211（9）：1759-1777.

[7]CORDENONSI M， ZANCONATO F， AZZOLIN L， et al. The Hippo transducer TAZ confers cancer stem cell-related traits on breast cancer cells[J].? Cell， 2011，147（4）：759-772.

[8]DING K K， JI J X， ZHANG X， et al. RNA splicing factor USP39 promotes glioma progression by inducing TAZ mRNA maturation[J].? Oncogene， 2019，38（37）：6414-6428.

[9]VASHISTHA V， BHARDWAJ S， YADAV B K， et al. Depleting deubiquitinating enzymes promotes apoptosis in glioma cell line via RNA binding proteins SF2/ASF1[J].? Biochemistry and Biophysics Reports， 2020，24：100846.

[10]MEVISSEN T E， HOSPENTHAL M K， GEURINK P P， et al. OTU deubiquitinases reveal mechanisms of linkage specifi-city and enable ubiquitin chain restriction analysis[J].? Cell，2013，154（1）：169-184.

[11]YUAN L， LV Y R， LI H C， et al. Deubiquitylase OTUD3 regulates PTEN stability and suppresses tumorigenesis[J].? Nature Cell Biology， 2015，17（9）：1169-1181.

[12]DU T D， LI H C， FAN Y S， et al. The deubiquitylase OTUD3 stabilizes GRP78 and promotes lung tumorigenesis[J].? Nature Communications， 2019，10（1）：2914.

[13]LIU Y Z， DU X X， ZHAO Q Q， et al. The expression change of OTUD3-PTEN signaling axis in glioma cells[J].? Annals of Translational Medicine， 2020，8（7）：490.

[14]LUDWIG K， KORNBLUM H I. Molecular markers in glioma[J].? Journal of Neuro-Oncology， 2017，134（3）：505-512.

[15]OSTROM Q T， BAUCHET L， DAVIS F G， et al. The epidemiology of glioma in adults： a “state of the science” review[J].? Neuro-oncology， 2014，16（7）：896-913.

[16]CHEN R， COHEN A L， COLMAN H. Targeted therapeutics in patients with high-grade gliomas： past， present， and future[J].? Current Treatment Options in Oncology， 2016，17（8）：42.

[17]BUCKNER J C. Factors influencing survival in high-grade gliomas[J].? Seminars in Oncology， 2003，30：10-14.

[18]STUPP R， MASON W P， VAN DEN BENT M J， et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J].? The New England Journal of Medicine， 2005，352（10）：987-996.

[19]YUNG W K， ALBRIGHT R E， OLSON J， et al. A phase Ⅱ study of temozolomide vs. procarbazine in patients with glioblastoma multiforme at first relapse[J].? British Journal of Cancer， 2000，83（5）：588-593.

[20]COYNE E S， WING S S. The business of deubiquitination-location， location， location[J].? F1000 Research， 2016，5：163.

[21]DENG J J， HOU G X， FANG Z X， et al. Distinct expression and prognostic value of OTU domain-containing proteins in non-small-cell lung cancer[J].? Oncology Letters， 2019，18（5）：5417-5427.

[22]YANG J M. Emerging roles of deubiquitinating enzymes in human cancer[J].? Acta Pharmacologica Sinica， 2007，28（9）：1325-1330.

[23]PRIOLO C， TANG D， BRAHAMANDAN M， et al. The isopeptidase USP2a protects human prostate cancer from apoptosis[J].? Cancer Research， 2006，66（17）：8625-8632.

[24]ZHAO Q Q， LI Y X， DU X X， et al. Effects of deubiquitylases on the biological behaviors of neural stem cells[J].? Deve-

lopmental Neurobiology， 2021，81（6）：847-858.

[25]GARSHOTT D M， SUNDARAMOORTHY E， LEONARD M， et al. Distinct regulatory ribosomal ubiquitylation events are reversible and hierarchically organized[J].? eLife， 2020，9：e54023.

[26]PU Q， LV Y R， DONG K， et al. Tumor suppressor OTUD3 induces growth inhibition and apoptosis by directly deubiquitinating and stabilizing p53 in invasive breast carcinoma cells[J].? BMC Cancer， 2020，20（1）：583.

[27]XIAO Z N， ZHANG P J， MA L. The role of deubiquitinases in breast cancer[J].? Cancer Metastasis Reviews， 2016，35（4）：589-600.

[28]ZHANG J S， ZHANG P J， WEI Y K， et al. Deubiquitylation and stabilization of PTEN by USP13[J].? Nature Cell Biology， 2013，15（12）：1486-1494.

[29]KWON J， CHOI H， WARE A D， et al. USP13 promotes development and metastasis of high-grade serous ovarian carcinoma in a novel mouse model[J].? Oncogene， 2022. doi：10.1038/s41388-022-02224-x.

[30]XIE P Y， CHEN Y L， ZHANG H F， et al. The deubiquitinase OTUD3 stabilizes ACTN4 to drive growth and metastasis of hepatocellular carcinoma[J].? Aging， 2021，13（15）：19317-19338.

[31]ZHANG P F， LI C N， LI H C， et al. Ubiquitin ligase CHIP regulates OTUD3 stability and suppresses tumour metastasis in lung cancer[J].? Cell Death and Differentiation， 2020，27（11）：3177-3195.

[32]WANG M， LI Y， XIAO Y Y， et al. Nicotine-mediated OTUD3 downregulation inhibits VEGF-C mRNA decay to promote lymphatic metastasis of human esophageal cancer[J].? Nature Communications， 2021，12（1）：7006.

[33]GENG W W， SONG H Y， ZHAO Q Q， et al. miR-520h sti-mulates drug resistance to paclitaxel by targeting the OTUD3-PTEN axis in breast cancer[J].? BioMed Research Internatio-nal， 2020，2020：9512793.

[34]QI L Y， YAO Y， ZHANG T T， et al. A four-mRNA model to improve the prediction of breast cancer prognosis[J].? Gene， 2019，721：144100.

[35]HONG W， LI A， LIU Y H， et al. Clonal hematopoiesis mutations in patients with lung cancer are associated with lung cancer risk factors[J].? Cancer Research， 2022，82（2）：199-209.

（本文編輯馬偉平）