基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)研究白頭翁治療肺癌的潛在作用機(jī)制

高宇 高秀麗 岳麗玲

【摘要】目的：探尋白頭翁治療肺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在的作用機(jī)制，為肺癌的中醫(yī)藥治療提供參考。方法：通過 TCMSP 及 Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫檢索白頭翁活性成分及作用靶點(diǎn);通過 OMIM 和GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選肺癌疾病靶點(diǎn);采用 DAVID 數(shù)據(jù)庫對(duì)白頭翁的作用靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 功能和 KEGG 信號(hào)通路富集分析;使用 Auto Dock Vina 軟件對(duì)白頭翁核心成分與靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。結(jié)果：白頭翁與肺癌交集靶點(diǎn)共21個(gè)，主要富集在33個(gè) GO 生物功能和50條 KEGG 通路，分子對(duì)接所得結(jié)合能均較低。結(jié)論：白頭翁通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡等功能，并影響 VEGF 和 p53等信號(hào)通路發(fā)揮其抗癌作用，可為肺癌的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與臨床研究提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】白頭翁;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);肺癌;機(jī)制;活性成分

【中圖分類號(hào)】S858.28? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A? 【文章編號(hào)】2096-5249（2022）14-0001-0004

To study the potential mechanism of pulsatilla pulsatilla in the treatment of lung cancer based on network pharmacology and molecular docking technology

Gao Yu1，Gao Xiu-li1，Yue Li-ling2△

1.Jiamusi University，Jiamusi 154000，China

2.Qiqihar Medical College ，Qiqihaer 161006，China

【Abstract】Objective：To explore the material basis and potential mechanism of Pulsatilla pulsatilla in the treatment of lung cancer，and to provide reference for the treatment of lung cancer with TRADITIONAL Chinese medicine.Methods：The? active? components? and? Target? were? searched? by? TCMSP? and? Swiss? Target? Prediction database.Lung? cancer? targets? were? screened? by? OMIM? and? GeneCards? databases. DAVID? database? was? used to analyze the GO function and KEGG signal pathway enrichment of the target of Pulsatilla pulsatilla.Auto Dock Vina was used to verify the molecular docking between core components and target protein of Pulsatilla pulsatilla. Results：There were 21 targets for the intersection of Pulpaeatum and lung cancer，which were mainly enriched in 33 GO biological functions and 50 KEGG pathways，and the binding energy obtained by molecular docking was low. Conclusion：Pulsatilla pulsatilla plays an anticancer role by regulating cell proliferation and apoptosis and in?uencing VEGF and p53 signaling pathways，which can provide theoretical basis for basic experiments and clinical studies of lung cancer.

【Key words】Pulsatilla pulsatilla;Network pharmacology;Lung cancer;Mechanism;The active ingredient

肺癌是全世界最常見、最致命的惡性腫瘤之一，目前，肺癌死亡率呈逐漸上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類生命。也是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因。對(duì)疾病生物學(xué)的普遍了解的實(shí)質(zhì)性改善、預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物的應(yīng)用以及治療的改進(jìn)使許多患者取得了顯著的進(jìn)步并改變了許多患者的預(yù)后。此外，降低吸煙率也有助于降低高收入國家的肺癌發(fā)病率和提高患者生存率。近年來，男性肺癌發(fā)病率的下降速度是女性的兩倍，反映出女性吸煙和戒煙的歷史延遲。然而，低收入國家的新肺癌確診病例繼續(xù)增加，這些國家的戒煙倡議落后，獲得保健服務(wù)的機(jī)會(huì)很少[1]。此外，從未吸煙的人也會(huì)被診斷為肺癌。因此，我們要特別關(guān)注肺癌的篩查、診斷和治療的進(jìn)展。

西醫(yī)治療肺癌的方法包括手術(shù)、化療、放療和免疫治療，其中化療治療效果較顯著，能提高患者的生活質(zhì)量 [2]。但化療的同時(shí)，會(huì)導(dǎo)致患者的正常細(xì)胞受到損傷，可產(chǎn)生胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制和口腔黏膜損傷等較嚴(yán)重的副作用。因此，肺癌患者進(jìn)行化療時(shí)，臨床上多采用中藥或中藥復(fù)方進(jìn)行輔助治療，在防治肺癌的過程中彌補(bǔ)西醫(yī)治療的缺點(diǎn)和不足，提高患者生活質(zhì)量并延長患者的生存期。中醫(yī)藥作為綜合療法的一部分，受到了廣泛的研究關(guān)注。因此，研究肺癌早期轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，結(jié)合新的中醫(yī)藥治療方法和抑制非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的藥物，可能是治療非小細(xì)胞肺癌的一條有前途的途徑。

白頭翁（Pulsatilla radix）在中國已有兩千多年的藥用歷史。“中國藥典”記載它來源于毛茛科白頭翁的干燥根，白頭翁的根具有增強(qiáng)免疫功能作用、抗氧化、抗炎、抗腫瘤的藥理作用。目前，白頭翁治療肺癌的藥理作用已有相關(guān)報(bào)道[3]，但其系統(tǒng)性藥理學(xué)研究較少，尚未完全闡明其抗肺癌的藥用有效成分及分子作用機(jī)制。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，構(gòu)建“藥物- 成分 -靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，探究白頭翁治療肺癌過程中發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)和相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，可為白頭翁治療肺癌的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供新的思路和方向。

1? 材料與方法

1.1? 白頭翁藥效成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以“白頭翁”為關(guān)鍵詞，在TCMSP（TCMSP：http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）平臺(tái)及 Swiss Target Predictio n （http：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫篩選有效成分及靶點(diǎn)，并在Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫對(duì)有效成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選和標(biāo)準(zhǔn)化命名為基因名。并在 Cytoscape3.7.2軟件中，構(gòu)建“藥物- 成分- 靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行可視化拓?fù)浞治觥?/p>

1.2? 預(yù)測(cè)肺癌疾病靶點(diǎn)

以“Lung Cancer”為關(guān)鍵字，在Genecards和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索肺癌靶點(diǎn)并去除重復(fù)值，建立肺癌疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。利用Venn軟件繪制“藥物- 疾病”共同靶點(diǎn)圖，其交集部分可認(rèn)為是白頭翁治療肺癌的候選靶標(biāo)。

1.3? 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)輸入 STRING（https：//string-db.org/）平臺(tái)，繪制共表達(dá)靶點(diǎn)蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。? 1.4? 靶點(diǎn)富集分析

將1.2中得到的交集靶點(diǎn)輸入 DAVID 數(shù)據(jù)庫，分析GO 生物過程和KEGG 信號(hào)通路。并在SangerBox網(wǎng)站對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖及可視化分析。

1.5? 分子對(duì)接

將1.5項(xiàng)下篩選的10個(gè)核心靶點(diǎn)與白頭翁主要活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。根據(jù)Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得白頭翁活性成分的結(jié)構(gòu)，從 PDB（https：//www.rcsb.org/） 數(shù)據(jù)庫中獲得作用靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)信息（PDB：CASP- 4 PS0，ERS1-3 P86，JUN-2 G01），利用AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接以驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，計(jì)算出活性成分與靶蛋白的最小結(jié)合能。

2? 結(jié)果

2.1? 收集白頭翁活性成分與潛在靶點(diǎn)

通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫共獲得8個(gè)有效成分和73個(gè)藥物成分作用靶點(diǎn)，包括Sitosteryl acetate（谷甾醇乙酸酯）、Aureusidi n（金魚草素）、層粘連蛋白（LAN）、鋅指蛋白（ZINC01615307）、Mairi n（丁子香萜）、Isorhamneti n （異鼠李素）、Beta-sitosterol（β-谷甾醇）和 Stigmasterol （豆甾醇）。將上述藥物、成分及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)輸入到 Cytoscape3.7.2軟件中，獲得藥物- 成分- 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

2.2? 收集肺癌疾病靶點(diǎn)

利用GeneCards和 OMIM 數(shù)據(jù)庫，獲得與肺癌疾病靶點(diǎn)信息共1021個(gè)，將這些靶點(diǎn)定義為肺癌疾病的相關(guān)靶點(diǎn)。利用 Venn 圖軟件獲得白頭翁藥物與肺癌交集靶點(diǎn)共21個(gè)。

2.3? 靶蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)

將交集靶基因輸入到STRING 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析。PPI 網(wǎng)絡(luò)中有20個(gè)節(jié)點(diǎn)，96條邊，平均度值為9.14，這充分體現(xiàn)了疾病機(jī)制的交互復(fù)雜性以及中藥治療疾病的機(jī)制特點(diǎn)。將 STRING 數(shù)據(jù)庫中得到的結(jié)果輸入到 Sytoscape3.7.2中，利用其中的SytoHubba插件篩選hub 基因，選擇 Degree 算法篩選出前十位的 hub 基因，分別為：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（CASP3，CASP8， CASP9）、前列腺素 G/H 合酶（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK14）、轉(zhuǎn)錄因子 p65（RELA）、雄激素受體（AR）、轉(zhuǎn)錄因子 AP-1（JUN）和 RAS 相關(guān)蛋白R(shí)ab-28（PGR）及 ESR1。表明這些靶點(diǎn)在互作網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，可作為白頭翁治療肺癌的重要預(yù)測(cè)靶標(biāo)。

2.4? GO功能與KEGG信號(hào)通路富集分析

將21個(gè)交集靶基因提交至 DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 GO 功能和 KEGG 信號(hào)通路富集分析，P <0.05。涉及 GO 功能共33個(gè)，其中生物過程（BP）22個(gè)，細(xì)胞組成（CC）4個(gè)，分子功能（MF）7 個(gè)。其主要的 GO 功能包括細(xì)胞增殖及凋亡、調(diào)節(jié)線粒體膜電位和轉(zhuǎn)錄激活活性等。涉及 KEGG 信號(hào)通路共50條，主要包含肺結(jié)核、腫瘤壞死因子、VEGF、P53和小細(xì)胞肺癌等通路。

2.5? 分子對(duì)接

為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，本研究選擇白頭翁治療肺癌的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中度值較高的3 個(gè)核心靶點(diǎn) JUN、CASP3和 ESR1與 8個(gè)化合物進(jìn)行分子對(duì)接（見圖1），計(jì)算活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均低于-5.0 kcal/mol，表明所篩選的藥物成分與靶點(diǎn)之間具有很好的結(jié)合活性。靶點(diǎn) JUN 與 ESR1與化合物 LAN、ZINC01615307和 Stigmasterol 的結(jié)合能小于 -9.0 kcal/mol，表明白頭翁的多種活性成分可能通過作用于以上靶點(diǎn)參與肺癌的治療。

3? 討論

我國名貴中藥白頭翁用藥歷史悠久，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》[4]中就有記載，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、促進(jìn)免疫等作用。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是早期肺癌患者死亡的主要原因，白頭翁皂苷 E 抑制 A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5]。白頭翁皂苷 D 通過調(diào)節(jié) AKT/mTOR 信號(hào)通路抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的發(fā)展。

本研究通過白頭翁有效活性成分的挖掘，發(fā)現(xiàn)白頭翁中主要活性成分包含：豆甾醇、β-谷甾醇和異鼠李素等，提示這幾種有效成分在治療肺癌中發(fā)揮著重要的作用。豆甾醇是植物甾醇中的一個(gè)重要組分，既往研究證實(shí)植物甾醇能降低腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、遏制腫瘤細(xì)胞生長、促凋亡和調(diào)節(jié)免疫活性。有研究表明，β-谷甾醇可通過上調(diào) p53、Bax基因表達(dá)而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，表明植物甾醇能降低腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、遏制腫瘤細(xì)胞生長、促凋亡和調(diào)節(jié)免疫活性[6]。在 Lewis 肺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)白頭翁具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。其在體外和體內(nèi)抑制人肝細(xì)胞癌和胰腺癌細(xì)胞的生長。分子研究表明， PSA 可能誘導(dǎo) DNA 損傷，導(dǎo)致細(xì)胞 G2/M 期停滯和細(xì)胞凋亡。有研究表明，β-谷甾醇可通過上調(diào) p53、Bax基因表達(dá)而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡[7]，異鼠李素可能通過上調(diào)凋亡基因Bax、caspase-3和 p53的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2、Cyclin-D1和 PCNA 表達(dá)的機(jī)制有關(guān)，誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡[8]。另外，官紫祎[9]等發(fā)現(xiàn)白頭翁皂苷抑制肺癌NCI-H460細(xì)胞的增殖并可能干預(yù) MAPK 信號(hào)通路及調(diào)控 CASP 途徑誘導(dǎo)其凋亡。我們對(duì)白頭翁治療肺癌的預(yù)測(cè)結(jié)果與當(dāng)前相關(guān)研究結(jié)果基本一致，證明預(yù)測(cè)的可靠性，所以豆甾醇、β-谷甾醇和異鼠李素等可能是白頭翁治療肺癌的主要有效成分，具有潛在的研究?jī)r(jià)值。

靶蛋白相互作用 PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選 CASP3、CASP8、 CASP9、NOS2、ESR1和 MAPK14等為白頭翁治療肺癌的核心靶點(diǎn)。CASP3可能作為潛在的干預(yù)靶點(diǎn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]，其誘導(dǎo) PAC-1與順鉑聯(lián)用而協(xié)同誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡[11]。CASP8影響 T 細(xì)胞的活性和增殖，在治療肺癌中發(fā)揮著重要作用[12]。研究發(fā)現(xiàn) NOS2基因（CCTTT）n 多態(tài)性的長等位基因與非吸煙者中的肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)[13]，NOS2的高表達(dá)可被認(rèn)為是治療非小細(xì)胞肺癌良好的預(yù)后指標(biāo)。ESR1能有效地抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)肺癌細(xì)胞異常增殖，ESR1信號(hào)的激活被證明與肺癌細(xì)胞的間質(zhì)和耐藥特征相關(guān)[14]。MAPK14對(duì)肺癌細(xì)胞 H1299具有放射增敏作用，在細(xì)胞分化和增殖等過程中具有重要影響[15]。以上研究均表明 CASP3等靶點(diǎn)與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是白頭翁治療肺癌的重要靶標(biāo)。

GO 生物學(xué)過程富集分析證實(shí)了白頭翁對(duì)細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡過程、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生與炎癥、類固醇、線粒體膜電位的調(diào)節(jié)、NF-ΚB 信號(hào)和轉(zhuǎn)錄激活活性等生物學(xué)過程有一定影響，這些生物學(xué)過程在白頭翁治療肺癌所涉及的作用靶點(diǎn)及其相關(guān)通路都有體現(xiàn)。在 KEGG 富集分析中，篩選得到與肺癌密切相關(guān)的信號(hào)通路，如癌癥通路、肺結(jié)核、細(xì)胞凋亡、 TNF-α、VEGF、p53和小細(xì)胞肺癌等信號(hào)通路。研究表明， VEGF 是 HIF-1的調(diào)控靶基因之一，VEGF 過表達(dá)或高表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌中都有報(bào)道，在人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中也觀察到 VEGF 和磷酸化的 VEGFR2的表達(dá)，提示 VEGF 可能通過自分泌機(jī)制維持小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞功能[16]。40%～60%的肺癌細(xì)胞與腫瘤抑制基因 P53突變有關(guān)，這些突變?cè)谂c煙草相關(guān)的肺癌中比在從不吸煙的肺癌中更常見[17]。白頭翁在治療肺癌的機(jī)制方面是通過多條通路發(fā)揮作用。而且利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)所篩選的關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性物質(zhì)進(jìn)行模擬結(jié)合驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，所得結(jié)合能均較低，具有良好的結(jié)合效果，進(jìn)一步驗(yàn)證了本文所篩選的白頭翁治療肺癌的關(guān)鍵活性物質(zhì)和核心作用靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究為中藥白頭翁的多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用提供了依據(jù)，促進(jìn)了人們對(duì)中藥多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的理解。然而，在未來的研究中，還需要進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)和臨床調(diào)查，以驗(yàn)證白頭翁治療肺癌的作用機(jī)制。

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（收稿日期：2021-10-28）