葛志標　管燕　廖明亮

摘? ?要? ?羊肚菌栽培具有高投入、高風險、高效益特點，其菌種必須含有兩種交配型基因才能出菇，普通羊肚菌菌種分離技術均有可能缺失交配型基因，而科研院所可以通過PCR技術檢測菌種后用于生產(chǎn)，導致羊肚菌菌種市場價高并趨于壟斷?？梢宰孕兄谱餮蚨蔷N，利用冷庫進行出菇效果對比試驗，篩選出菌種用于大田栽培。通過3年生產(chǎn)實踐，方法可行，具有推廣價值。

關鍵詞? ?羊肚菌;菌種;冷庫;出菇試驗

羊肚菌栽培具有高投入、高風險、高效益特點，其菌種必須含有兩種交配型基因才能出菇。采用普通的羊肚菌菌種分離技術，可能造成菌種缺失交配型基因，需要專業(yè)科研院所通過PCR技術進行菌種檢測篩選，由此導致羊肚菌菌種市場價高并趨于壟斷。

為了解決普通食用菌種植戶自制羊肚菌母種，擴繁后生產(chǎn)出的羊肚菌栽培種因交配型基因缺失而造成大田生產(chǎn)不出菇的問題，貴州市遵義縣中信食用菌專業(yè)合作社組織課題組自制母種后，利用冷庫進行菌種出菇試驗，篩選出菌種用于大面積大田栽培，3年平均畝產(chǎn)150 kg以上，與科研院所采用PCR技術生產(chǎn)的菌種大田栽培產(chǎn)量相當，具有實用推廣價值。以下是這一實踐經(jīng)驗的操作流程總結，供參考。

1? ?母種分離

1.1? ?多孢子分離? 選大田栽培中個大、形好、肉厚的羊肚菌頭茬菇，用于菌種分離。分離步驟如下：

用市售標準PDA培養(yǎng)基40.1 g，加水? ? ? 1 000 mL煮沸，分裝入試管和100 mL組培瓶、錐形瓶中，高壓滅菌鍋121 ℃保持30分鐘，試管擺成斜面，組培瓶內置100 mL培養(yǎng)基，冷卻后備用。

準備回形針、刀片、鑷子、吹風機、羊肚菌子實體等。在超凈工作臺內進行如下無菌操作：

用吹風機冷風吹羊肚菌菌蓋表面，達到干凈的效果，用刀片把菌蓋表面切成1 cm見方的小塊;用酒精給回形針消毒，制成“Z”字形掛鉤，用一頭鉤住小塊羊肚菌菌蓋，另一頭掛在組培瓶或錐形瓶上，塞緊棉塞。

放置20 ℃恒溫箱內12～24小時后，取出組培瓶或錐形瓶，在超凈工作臺內將掛鉤連同組織塊取出，繼續(xù)塞緊棉塞，20 ℃下培養(yǎng)，2～5天即可見到彈射出的孢子萌發(fā)出的小菌落。

仔細觀察辨認菌落，挑取少量菌絲轉入試管中，編號標記。待5天左右長滿試管后，用體視鏡或顯微鏡檢測，選出9支純菌種編號標記，按編號標記一一對應進行擴繁備用，9個編號標記的母種各用1支接種原種，剩余保存至出菇試驗后確定淘汰或繼續(xù)擴繁。

1.2? ?組織分離? ?PDA培養(yǎng)基，采用柄蓋交接處組織分離獲得純菌種，每支試管進行編號標記。分離步驟如下：

用市售標準PDA培養(yǎng)基40.1 g，加1 000 mL水煮沸，分裝入試管中，高溫滅菌鍋121 ℃下保持30分鐘，試管擺成斜面，冷卻后備用。

準備刀片、鑷子、吹風機、酒精燈、羊肚菌子實體等。在超凈工作臺內進行如下無菌操作：

先用75%酒精擦拭雙手，再用吹風機冷風吹羊肚菌菌蓋表面，達到干凈的效果，用75%酒精棉球擦拭羊肚菌表面，器械用酒精燈火焰滅菌冷卻后，縱向切開羊肚菌子實體，挑取柄蓋交接處組織，置入斜面培養(yǎng)基試管中，編號標記。

放置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～5天菌絲萌發(fā)，挑取菌絲轉管培養(yǎng)，按編號標記，5天左右長滿試管，選擇9支進行編號擴繁標記，將9個編號標記的母種各用1支接種原種，剩余保存至出菇試驗后確定淘汰或繼續(xù)擴繁。

2? ?原種制作

1）制作培養(yǎng)基。按照木屑68%、麥粒22%、土壤7%、石灰2%、石膏1%的比例配制培養(yǎng)基。步驟如下：稱取麥粒，加石灰浸泡24小時或煮沸后保持30分鐘左右，以麥粒吸水飽滿且麥皮不開裂為度，加木屑（0.5 cm）、土壤、石膏等混勻裝瓶，高壓或常壓滅菌，冷卻后接種培養(yǎng)。

2）接種培養(yǎng)。用多孢分離或組織分離后編號標記的9支斜面母種，每支接種1瓶原種培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，按母種編號標記，共9瓶。10天左右長滿菌種瓶。

3? ?栽培種制作

1）制作培養(yǎng)基。按照木屑45%、麥粒45%、土壤7%、石灰2%、石膏1%的比例配制培養(yǎng)基。步驟如下：稱取麥粒，加石灰浸泡24小時或煮沸后保持30分鐘左右，以麥粒吸水飽滿且麥皮不開裂為度，加木屑（0.5 cm）、土壤、石膏等混勻裝袋，高壓或常壓滅菌，冷卻后接種培養(yǎng)。

2）接種培養(yǎng)。將9瓶編號標記的原種，1瓶接種1個栽培袋，按原種編號標記，共9袋。15天左右長滿菌種袋。

4? ?營養(yǎng)袋制作

準備12 cm×24 cm聚丙烯袋，玉米芯100 g，麥粒150 g，石膏2 g，石灰2 g。將麥粒用石灰水浸泡12～24小時;玉米芯加水，24小時翻1次，悶48小時后與石灰、石膏、浸泡的麥?；靹颍b入聚丙烯袋，高溫高壓滅菌8小時，冷卻備用。每袋營養(yǎng)袋濕重350 g左右。

5? ?篩選菌種

通過冷庫出菇試驗篩選菌種。

5.1? ?試驗過程

1）準備長方形或正方形容器，保證底部能夠瀝水。

2）選取壤土，用石灰混勻消毒，根據(jù)土壤干濕度進行水分調節(jié)，至土壤手握成團，自由落下能散開為宜。

3）容器底部及四周用地膜鋪蓋。地膜要超出容器至完全覆蓋上部，地膜上橫豎20 cm均勻打孔通水通氣，然后裝入消毒處理后的土壤至容器4/5處。

4）撒播栽培種。播種后覆蓋2 cm厚的土壤，栽培容器按栽培種編號標記，共9個處理，每個處理重復3次。以科研院所的菌種作對照（1個）。共28個處理。

5）調控出菇環(huán)境。將播種后的容器放置在可調溫冷庫中，調節(jié)溫度上限為19 ℃，溫度下限為10 ℃，溫差9 ℃。

6）日常管理。播種5天左右，菌絲長滿土面，放置營養(yǎng)袋。把覆蓋打孔的黑地膜蓋在營養(yǎng)袋上，保溫保濕。每周檢查1次土壤濕度，土壤含水量保持在50%～60%。營養(yǎng)袋放置30天左右后，噴出菇水，開啟燈光，土面菌霜消退，原基開始分化。

5.2? ?試驗結果與應用? ?16個處理出現(xiàn)原基，其中包括對照（1個），試驗和對照出現(xiàn)原基的密度基本相當;其余12個處理無原基，淘汰。

選擇出現(xiàn)原基的5支栽培種試管進行擴繁，生產(chǎn)菌種，用于大田栽培。

6? ?應注意的問題

1）配方中的原材料要新鮮，玉米芯、麥粒、木屑等處理要到位。

2）母種轉管時要橫向截取菌塊，不要縱向截取。

3）培養(yǎng)溫度一定不要超過22 ℃，菌種用冷藏車運輸，保證低溫環(huán)境。

4）菌種一定要放置在通風、涼爽的地方儲存，不能堆碼。

5）控制轉管次數(shù)，不要超過5代。

【項目資助】：“羊肚菌菌種穩(wěn)定性與外源營養(yǎng)應用優(yōu)化研究”項目[黔科合支撐〔2019〕2340號]資助。

葛志標，貴州省遵義市播州區(qū)科技服務中心，郵編563100;管燕，廖明亮，遵義市播州區(qū)中等職業(yè)學校。

收稿日期：2021-10-08