包小雅 楊宇昊 翟景波

摘要：布魯氏桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，現(xiàn)階段針對布魯氏桿菌病主要從細菌學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)等幾方面進行檢測。該文對布魯氏桿菌及檢測方法加以介紹，以期為后續(xù)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：布魯氏桿菌;血清學(xué)檢測;分子生物學(xué)檢測

中圖分類號：R516.7文獻標識碼：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2022.01.001

Research Progress in Brucella and Detection Methods

BAO Xiaoya1，YANG Yuhao2，ZHAI Jingbo1

（Medical School，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao Inner Mongolia 028000，China;2.College of Animal Science and Technology，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao Inner Mongolia 028000，China）

Abstract：Brucellosis is mainly detected from bacteriology，serology，molecular biology and so on. In this paper，Brucella and its detection methods are introduced in order to provide reference for the follow-up research.

Keywords：brucella，serological detection，molecular biological detection

0引言

布魯氏桿菌?。˙rucellosis）簡稱布病，是一種由布魯氏桿菌引起的人畜共患型傳染病。1887年，英國醫(yī)生Bruce于一病死于“馬耳他熱”的患者脾臟內(nèi)分離到了布魯氏桿菌，自此該病原菌被公布于世。該病流傳范圍極其廣泛，于170多個國家和地區(qū)均有流傳[1]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將布病設(shè)為必須通報的動物疫病，我國也將該病列為二類動物疫病。

1病原學(xué)

布魯氏桿菌為革蘭氏陰性菌，屬α-變形菌，菌體多呈現(xiàn)球桿狀，也可見卵圓狀，大小為（0.5～0.7）μm×（0.6～1.2）μm，無運動性、無天然質(zhì)粒，除部分具有毒力的菌株外多數(shù)菌株同樣不具有莢膜，為兼性胞內(nèi)寄生。與其他胞內(nèi)寄生菌相區(qū)別的是，該菌不含陰性菌所有的外毒素等毒力因子，且不具有抗原變異性，這些特性可幫助其脫逃免疫防線成功侵入機體內(nèi)并進行復(fù)制。在入侵過程中，布魯氏桿菌的非經(jīng)典脂多糖（lipopolysaccharide，簡稱LPS）可與細胞表面特異性受體進行相互作用，保護菌體不受殺菌肽及補體引發(fā)的裂解，從而協(xié)助菌體逃避免疫應(yīng)答，此外該結(jié)構(gòu)在菌體發(fā)揮毒性的過程中也起著十分重要的作用[2]。

布魯氏桿菌可感染多數(shù)的哺乳動物及部分兩棲動物，目前已知的主要有6種經(jīng)典類型19個亞型，分別為B.melitensis（羊種，主要感染綿羊和山羊，分為1、2、3亞型）、B.abortus（牛種，分為1、2、3、4、5、6、7、9亞型）、B.suis（豬種，主要感染豬、野兔、野豬、馴鹿和嚙齒動物，分為1、2、3、4、5亞型）、B. canis（犬種）、B. neotomae（沙林鼠種）、B.ovis（綿羊附睪種）。之后又鑒定到B.microti（田鼠型）、B.pinnipediae（鰭型）、B.cetacea（鯨型）、B.vulpis（狐貍型）和B.inopinata（人類為天然宿主）5種類型菌種。此外，還有從兩棲類動物中分離出布魯氏桿菌的報道[1]。目前，我國已經(jīng)分離到該菌的6個經(jīng)典種及其所有亞型。

2檢測方法

2.1細菌學(xué)

細菌學(xué)檢測是布病檢測的“金標準”，該檢測方法可根據(jù)布魯氏桿菌在無二氧化碳環(huán)境下、含堿性品紅染劑或不同設(shè)置的生化培養(yǎng)基內(nèi)的生長狀態(tài)進行細菌的基因分型[3]，在疾病的診斷與流行病學(xué)調(diào)查上具有重要意義。動物布病檢測可選擇流產(chǎn)胎兒、陰道分泌物、奶水、血液等組織為樣本進行培養(yǎng)。該方法準確性高，但所需時間較長，且布魯氏桿菌的培養(yǎng)鑒定需在生物安全3級以上的實驗室進行操作，分離過程危險性較高，因此不適用于疫情緊急檢測[4]。

2.2血清學(xué)

由于血清學(xué)檢測相對簡單、成本低、陰性預(yù)測值高，在經(jīng)濟和技術(shù)資源有限的流行地區(qū)，血清學(xué)檢測仍是主要的診斷工具。目前針對布病已經(jīng)開發(fā)了高效的血清學(xué)檢測技術(shù)，多見于酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、補體結(jié)合試驗、凝集試驗、熒光偏振檢測方法和膠體金免疫層析技術(shù)。

2.2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗

將菌體抗原包被于ELISA板上，若被檢血清內(nèi)含有相應(yīng)抗體，此時板內(nèi)則會形成抗原抗體復(fù)合物，之后加入酶標二抗，再與酶的底物進行反應(yīng)產(chǎn)生顏色，最后根據(jù)酶標儀檢測樣品的OD值得出抗體量。該項檢測技術(shù)準確性高，但操作需要專業(yè)技術(shù)人員及儀器，因此不適用于基層大規(guī)模檢測。補體結(jié)合試驗是通過將布魯氏桿菌補體結(jié)合抗原與待檢血清中的抗體結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物再與補體結(jié)合，從而不再引起指示系統(tǒng)中紅細胞溶血的檢測方法[5]。該方法敏感性強，特異性高，是OIE認可的血清學(xué)檢測的標準檢測法，多應(yīng)用于牛羊布病的檢測。

2.2.2凝集試驗

布病常用的凝集試驗為虎紅平板凝集試驗（RBPT）與試管凝集試驗（SAT）?；⒓t平板凝集是根據(jù)虎紅平板抗原對IgG類抗體進行檢測，操作簡單、快速，適用于大范圍的布病篩查工作[6]。試管凝集試驗則是針對IgM抗體進行檢測，不易受非特異性抗體的干擾，假陰性率低，可對疾病進行定性分析[7]。此外，2- 巰基乙醇試驗（2-ME）和乳牛全乳環(huán)狀試驗（MRT）也被應(yīng)用于布病的檢測。

2.2.3熒光偏振檢測

最早的熒光偏振檢測技術(shù)是由Nielsen等建立的，主要利用分子旋轉(zhuǎn)特性，來測量抗原與抗體的結(jié)合進行檢測，但由于檢測設(shè)備價格昂貴，目前市場上尚未廣泛應(yīng)用該方法進行布病的檢測[8]。

2.2.4膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)是將膠體金標記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和蛋白層析技術(shù)相結(jié)合的以硝酸纖維膜作為載體的固相膜免疫分析技術(shù)，該技術(shù)檢測快速，可被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場的快速檢測，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景和極大的發(fā)展?jié)摿9]。

2.3分子生物學(xué)

近些年，分子生物學(xué)診斷不斷取得進展，特別是針對一些培養(yǎng)難度較大的微生物所引起的感染。由于布魯氏桿菌屬的培養(yǎng)條件具有一定特殊性，因此分子生物學(xué)檢測是其最優(yōu)的檢驗方式。布病的分子生物學(xué)檢測方式以聚合酶鏈式反應(yīng)、實時熒光定量PCR、重組酶聚合酶擴增以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增等4種方法較為多見。

2.3.1聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）

近年，PCR檢測技術(shù)憑借其操作方法簡單、準確率高等優(yōu)勢再檢測領(lǐng)域占有一定優(yōu)勢。Paul[10]等針對不同基因片段設(shè)計了5對引物，建立了可檢測布魯氏桿菌分型的多重PCR方法，之后對80株布魯氏桿菌進行鑒別檢測，成功地區(qū)分出了不同種屬的菌株。Morata等[11]為評估PCR檢測法對布魯氏桿菌的診斷率，對比了34份不同樣品下PCR與常規(guī)微生物培養(yǎng)技術(shù)的準確率，結(jié)果顯示PCR準確率為97%，靈敏度遠高于培養(yǎng)所得的29.4%。

2.3.2實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR是許多實驗室診斷的首選方法。該技術(shù)將聚合酶鏈反應(yīng)與熒光報告分子的使用相結(jié)合，以便在PCR反應(yīng)的每個周期中監(jiān)測擴增產(chǎn)物。良好的靈敏度和特異性、可重復(fù)的數(shù)據(jù)、低污染風(fēng)險和減少人工操作時間的相結(jié)合，使得實時PCR技術(shù)成為傳統(tǒng)PCR的一種替代方法。為對該方法靈敏度進行檢測，研究者使用SYBR Green I熒光定量PCR對10例布魯氏桿菌陽性樣本進行檢測，并與傳統(tǒng)的微生物學(xué)技術(shù)進行了比較。結(jié)果顯示W(wǎng)right的血清凝集30%呈陰性，而SYBR Green I熒光定量PCR檢測陽性為90%。表明了該檢測方法具有良好的敏感度[12]。

2.3.3重組酶聚合酶擴增

重組酶聚合酶擴增（RPA）是一種核酸體外擴增技術(shù)，與傳統(tǒng)PCR技術(shù)不同，該方法在核酸復(fù)制過程中形成D型結(jié)構(gòu)，之后雙向引物同時復(fù)制，從而實現(xiàn)基因片段的指數(shù)型增長。且復(fù)制的整個過程只需在37～42 ℃的恒溫條件下進行即可。Ren等[13]建立了一種用于檢測布魯氏桿菌的重組酶聚合酶擴增方法（RPA），該檢測方法可在20 mm內(nèi)檢測到每個反應(yīng)中至少有3拷貝布魯氏桿菌。RPA具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)勢。

2.3.4環(huán)介導(dǎo)等溫擴增

與RPA相似，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）同樣是是一種快速、簡便的DNA檢測方法，不同的是該檢測方法所需溫度為60 ℃。Bhat等[14]應(yīng)用不同引物及試劑的LAMP進行RT-LAMP檢測，并與qPCR結(jié)果進行比較。試驗結(jié)果顯示RT-LAMP分析的靈敏度比qPCR高10倍左右。且該檢測方法與其他病原菌沒有任何交叉反應(yīng)，其特異性強，是直接和早期檢測布魯氏桿菌的一種特異和快速診斷工具。

3討論與結(jié)論

布病病程較長，為慢性傳染性疾病，臨床表現(xiàn)不具有特異性，多見于波浪熱、關(guān)節(jié)性疾病以及生殖系統(tǒng)疾病，且嚴重程度依據(jù)個體不同臨床差異性較大，這為疾病的治療增加了極大的難度。動物患病后的臨床表現(xiàn)不明顯，可見于流產(chǎn)及生殖系統(tǒng)疾病，多數(shù)患畜無明顯臨床表現(xiàn)。

對于布病而言，防控與及時的診斷極為重要，各種診斷手段都存在不同的利弊，必要時需要結(jié)合多種檢測手法進行共同診斷。日常的防控工作中要注意動物疫苗的注射，現(xiàn)階段主要應(yīng)用的疫苗為弱毒苗，基因工程苗也在研究中[15]。

參考文獻

[1]楊勇，段博芳，董國棟，等.人畜間布魯氏菌病研究進展[J].中國動物檢疫，2020，37（4）：76-83.

[2]馬忠臣，胡瑞瑞，李芮芮，等.布魯氏菌的胞內(nèi)生存機制研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2021，42 （6）：71-78.

[3]楊懷珍，張朝輝，徐林，等.布魯氏菌病實驗室診斷方法研究進展[J].畜牧獸醫(yī)科學(xué)（電子版），2021（9）：13-15.

[4]杜清春，王鵬.布魯氏桿菌病檢測技術(shù)研究進展[J].中國動物傳染病學(xué)報，2019，27（2）：105-109.

[5]加孜拉·托留漢，劉向陽，雷程紅，等.布魯氏菌病檢測方法的比較[J].新疆畜牧業(yè)，2020，35（2）：44-46.

[6]高玉芬，李淑慧，杜曉敏.試管凝集試驗與虎紅平板凝集試驗對布魯氏桿菌病的診斷價值[J].臨床醫(yī)學(xué)研究與實踐，2021，6（5）：114-115，118.

[7]李宗瑾，郭晏強，李艷艷，等.虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗及酶聯(lián)免疫吸附試驗等布魯菌病檢測方法比較和ROC曲線分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2020，30（9）：1 069-1 071.

[8]劉佳音，姜海，楊文杰.熒光偏振檢測法在布魯氏菌病診斷中的應(yīng)用[J].疾病監(jiān)測：2021，36（2）：1 248-1 251.

[9]楊旭欣，于守鴻，馬麗，等.膠體金免疫層析技術(shù)在羊布魯氏菌病的檢測應(yīng)用[J].中國人獸共患病學(xué)報，2018，34（10）：950-951，965.

[10] Paul S M，Peddayelachagiri B V，Gogoi M，et al. Genomewide unique insertion sequences among five Brucella species and demonstration of differential identification of Brucella by multiplex PCR assay[J]. Sci Report，2020，4（10）：6 468-6 478.

[11] Morata P，Queipo-Ortuno M I，Reguera J M，et al. Diagnostic Yield of a PCR Assay in Focal Complications of Brucellosis[J].J Clin Microbiol，2001，39（10）：3 743.

[12] Queipo-Ortuo M I，Colmenero J D，Muoz N，et al. Rapid diagnosis of Brucella epididymo-orchitis by real-time polymerase chain reaction assay in urine samples[J]. J Urol，2006，176 （5）：2 290-2 293.

[13] Ren H，Yang M J，Zhang G X，et al. Development of a rapid recombinase polymerase amplification assay for detection of Brucella in blood samples[J].Mol Cell Probes，2016，30 （2）：122-124.

[14] Bhat I A，Mashooq M ，Kumar D，et al. Development of probe based real-time loop-mediated isothermal amplification for detection of Brucella[J]. J Appl Microbiol，2019，26（5）：1 332-1 339.

[15]孫天浩，馬忠臣，張歡，等.家畜布魯氏菌病相關(guān)疫苗的研究進展[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2021（7）：80-86.