營養(yǎng)不良對γ-干擾素釋放試驗檢測結核病陽性率的影響

拉巴 張蒙蒙 王明桂 賀建清

【Fundprogram】 The National Natural Science Foundation of China Grants (81870015)

早期準確診斷和治療結核病是“終止結核病戰(zhàn)略”的重要措施[1-2]。目前，診斷結核病主要依賴于抗酸桿菌涂片鏡檢、分枝桿菌培養(yǎng)、結核分枝桿菌核酸檢測以及組織病理等病原學檢查，但即使結合了多種檢測手段，全球肺結核的確診率仍不足60%[1]，在低收入及資源有限的地區(qū)甚至更低。這就意味著結核抗體、結核菌素皮膚試驗以及γ-干擾素(IFN-γ)釋放試驗(interferon gamma release assays，IGRA)等在內(nèi)的免疫學檢測可能在臨床診斷中發(fā)揮重要作用[1, 3-5]。尤其是近幾年發(fā)現(xiàn)，IGRA檢測試劑盒可以克服結核菌素皮膚試驗的一些假陽性率及測量誤差等局限性[6]，已被廣泛應用于結核病的早期輔助診斷和監(jiān)測中[1, 3-5]，但該方法的診斷價值在機體免疫功能受到抑制時可能會受到影響。

營養(yǎng)不良是結核病的危險因素，而結核病作為一種消耗性疾病，又會加重營養(yǎng)不良[7-8]。研究顯示，IGRA檢測結果的不確定性和低水平的IFN-γ濃度均與營養(yǎng)不良相關[9]。有學者在低體質(zhì)量指數(shù)(BMI)的結核分枝桿菌潛伏感染者(latent tuberculosis infection, LTBI)中發(fā)現(xiàn)多種重要趨化因子水平降低[10]，但目前尚無探討營養(yǎng)不良對IGRA檢測結核病結果影響的報道。因此，筆者擬通過對不同營養(yǎng)狀態(tài)結核病患者的IGRA檢測結果進行分析，以評價營養(yǎng)狀態(tài)是否會影響結核病患者的IGRA檢測結果。

資料和方法

1.研究對象：采用回顧性研究的方法，納入2015年1月至2018年11月于四川大學華西醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科符合入組標準的443例住院結核病患者作為研究對象，收集患者的性別、年齡、身高、體質(zhì)量、吸煙史、飲酒史、病原學檢測結果(包括抗酸桿菌涂片鏡檢、分枝桿菌培養(yǎng)、病理學檢測、結核DNA檢測)、IGRA、外周血淋巴細胞和T淋巴細胞亞群等臨床資料。

按照BMI數(shù)值，將患者分為營養(yǎng)不良組(BMI<18.5)和非營養(yǎng)不良組(BMI≥18.5)。其中，營養(yǎng)不良組136例，包括男性90例，女性46例，中位年齡為29.0(20.0,49.0)歲；非營養(yǎng)不良組307例，包括男性161例，女性146例，中位年齡為39.0(27.0，52.0)歲。 兩組患者在性別、年齡、身高、體質(zhì)量和病原學檢測任一陽性的差異均有統(tǒng)計學意義，在其他方面的差異均無統(tǒng)計學意義，具體見表1。

表1 結核病患者一般特征在兩組患者中的分布情況

2.入組標準：剔除臨床資料不全者后，納入結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性、病理組織檢查陽性、結核DNA檢測任一陽性者(病原學確診)；排除其他肺部疾病后納入符合結核病影像學表現(xiàn)，并至少有肺結核可疑癥狀、結核菌素皮膚試驗中等及以上陽性、IGRA陽性、結核抗體陽性、抗結核藥物治療有效之一者(臨床診斷病例)。

3.IGRA檢測：本研究使用QuantiFERON-TB-Gold-In-tube(QFT-GIT)檢測技術，采用TB-IGRA檢測試劑(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：TR20141207-TR20181010A)按照說明書進行檢測。(1)標本采集與處理：采用肝素抗凝真空采血管采集患者外周靜脈全血4～6 ml。2 h內(nèi)將全血標本分裝到N(本底對照管)、T(測試管，即結核抗原管)、P(陽性對照管，即促有絲分裂因子管)，37 ℃培養(yǎng)20～24 h，3000 r/min離心10 min(離心半徑為20 cm)后收集上清液，檢測上清液中IFN-γ含量。(2)結果判定：本底對照管及陽性對照管用于判斷檢測的有效性；以校準品的抗原含量(12.5～400 pg/ml)及其對應的吸光度值制作標準曲線，求出線性回歸方程，P管含量值為陽性對照值，IGRA絕對值為T管含量值與N管含量值的差值(T-N)，當T-N≥14.0且≥N/4則判定為檢測結果陽性。

4.外周血淋巴細胞檢測：考慮到IGRA是免疫學檢測方法，營養(yǎng)不良可能會影響外周血淋巴細胞數(shù)據(jù)，故研究進一步比較兩組患者不同IGRA檢測結果中的外周血淋巴細胞計數(shù)和T淋巴細胞亞群分布情況。

采用美國BD公司的FACSCount流式細胞計數(shù)儀、Truecount計數(shù)管和FACS溶血素進行T細胞計數(shù)，所有試劑均在有效期內(nèi)按說明書使用。Immuno-Trol質(zhì)控血同檢測標本一同進行操作，在流式細胞檢測的試管中加20 μl CD4熒光標記抗體，然后加入混勻的抗凝血50 μl，室溫避光孵育15 min。在標本中加入溶血素，室溫避光孵育15 min 后上機檢測，上機前應用CaliBRITETM磁珠及FACSCompTM軟件校準流式細胞儀，將制備好的樣本上機，使用MultiSETTM軟件獲取并自動分析檢測結果。

5.統(tǒng)計學處理：使用Excel 2016軟件建立數(shù)據(jù)庫并進行雙錄入。采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。本研究計量資料均呈偏態(tài)分布，采用“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1,Q3)]”描述，組間差異的比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以“構成比/百分率(%)”描述，組間差異的比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.IGRA檢測結果：IGRA檢測陽性率在兩組患者中的差異無統(tǒng)計學意義，且檢測兩組患者中病原學陽性患者陽性率的差異也無統(tǒng)計學意義。具體見表2。

表2 IGRA結果在兩組患者中的分布情況

2.外周血淋巴細胞計數(shù)及T淋巴細胞亞群檢查結果：本研究中有T淋巴亞群檢查結果的結核病患者共計344例，其中，營養(yǎng)不良組118例，對照組226例。結果顯示，外周血淋巴細胞計數(shù)及T淋巴細胞亞群分布在兩組所有患者間差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)，并且在營養(yǎng)不良患者中IGRA陽性與IGRA陰性患者間的分布差異也均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。具體見表3、4。

表3 淋巴細胞及T淋巴細胞亞群在兩組患者中的檢測水平

討 論

結核病是一種慢性消耗性傳染病，常伴有營養(yǎng)不良的表現(xiàn)。本研究根據(jù)BMI值將443例結核病患者分為營養(yǎng)不良組(BMI<18.5)和非營養(yǎng)不良組(BMI≥18.5)，發(fā)現(xiàn)IGRA檢測營養(yǎng)不良結核病患者的陽性率與非營養(yǎng)不良患者差異無統(tǒng)計學意義，且在病原學陽性結核病患者亞組分析中陽性率的差異也無統(tǒng)計學意義，這提示IGRA檢測可以推薦用于營養(yǎng)不良患者結核病的輔助診斷。

表4 淋巴細胞及T淋巴細胞亞群在IGRA陽性與陰性營養(yǎng)不良結核病患者中的檢測水平

傳統(tǒng)的結核感染篩查方法如結核菌素皮膚試驗等應用廣泛，但敏感度和特異度均較低。而QFT-GIT是通過酶聯(lián)免疫吸附法在體外測定結核特異性抗原刺激新鮮肝素化全血中IFN-γ的濃度來判斷患者是否感染結核分枝桿菌，在早期的研究中就顯示出其診斷結核感染的敏感度約為80%[4]，已成為當前運用較為成熟的檢測方法。本研究使用該技術的檢測結果顯示，營養(yǎng)不良及非營養(yǎng)不良結核病患者的陽性檢出率分別為76.47%和78.18%，且在病原學陽性結核病患者中的陽性率分別為75.61%和80.65%，這說明QFT-GIT對不同營養(yǎng)狀態(tài)下結核病患者的檢測結果具有較好的一致性。而且，本研究結果高于另一研究中IGRA在營養(yǎng)不良結核病患兒中診斷結核病的陽性率(69.6%)，該研究共計納入86例疑似結核病患兒[11]，提示QFT-GIT對成年人的陽性檢出率較高，可能與兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全有關。另外，一項納入1928例疑似結核病患者的研究指出，高BMI可能與TB-IGRA檢測的假陰性相關[12]，但并未指出營養(yǎng)不良即低BMI與IGRA檢測結核病患者的不良結果相關。

結核分枝桿菌感染人體后，機體對結核分枝桿菌的抵抗是由特異性T淋巴細胞介導的細胞免疫。在T細胞亞群中，CD4+T細胞和CD8+T細胞是機體針對結核分枝桿菌的細胞免疫應答中的主要細胞[13]，與外周血淋巴細胞呈線性相關，CD4+T細胞是產(chǎn)生IFN-γ的主要細胞，少量的CD8+T細胞也誘導產(chǎn)生IFN-γ[14]。QFT-GIT檢測法可通過誘導CD4+T細胞免疫應答來檢測結核分枝桿菌感染情況，其檢測結果與CD4+T細胞和CD8+T細胞計數(shù)密切相關。一項Meta分析顯示，外周血淋巴細胞計數(shù)低可能是IGRA假陰性的常見危險因素[15]；另一項研究發(fā)現(xiàn)，當患者在使用免疫抑制藥物或合并HIV感染等情況時，其免疫功能極易受損，從而出現(xiàn)免疫缺陷，導致T細胞無法充分產(chǎn)生IFN-γ，可能降低IGRA檢測的陽性率[16]。故建議對于需要篩查的結核病高危人群，在進行TB-IGRA 檢測的同時應完善淋巴細胞亞型的分析[17]。另外，嚴重營養(yǎng)不良或饑餓也可以通過影響T細胞的存活和增殖來改變T細胞數(shù)量。有研究將禁食48 h后的小鼠與正常喂養(yǎng)的小鼠進行對比，發(fā)現(xiàn)被禁食小鼠的胸腺細胞數(shù)明顯下降[18]；另有研究在營養(yǎng)不良的細菌感染患兒中發(fā)現(xiàn)，CD4+和CD8+T細胞計數(shù)明顯低于正常體質(zhì)量的細菌感染的患兒[19]。本研究顯示，外周血淋巴細胞計數(shù)及T細胞亞群在營養(yǎng)不良及非營養(yǎng)不良結核病患者中的差異均無統(tǒng)計學意義，說明在本研究中營養(yǎng)不良并未影響到淋巴細胞計數(shù)及T淋巴細胞亞群的分布，這可能與本研究納入的研究者均為免疫系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)育完全的成年人有關，這也可能是兩組患者中IGRA檢測結果未受到影響的原因。

與本研究結果類似，糖尿病患者雖然有免疫功能異常，但Walsh等[20]發(fā)現(xiàn)IGRA并未降低合并結核病的糖尿病患者的陽性檢出率，提示IGRA不僅可以用于糖尿病患者結核感染的診斷，也可以用于LTBI者的檢測。同理，本研究得出的結論也可延伸到LTBI人群，即IGRA診斷營養(yǎng)不良人群中LTBI者的敏感度不會降低，這可能與結核病患者容易發(fā)展成結核分枝桿菌特異性免疫無能，使IGRA檢測敏感度下降[21-23]，而在營養(yǎng)不良的LTBI者中并無此類免疫無能發(fā)生有關。因此，IGRA對于診斷營養(yǎng)不良患者結核分枝桿菌潛伏感染的敏感度應與IGRA輔助診斷營養(yǎng)不良疑似結核病患者的敏感度相當或者更好。因此，IGRA用于診斷營養(yǎng)不良患者中LTBI與其他人群同樣可靠，但該推斷需要在營養(yǎng)不良和非營養(yǎng)不良LTBI者中進行研究確定。

綜上所述，營養(yǎng)不良并不會影響不同營養(yǎng)狀態(tài)下IGRA檢測結核病的陽性率，提示IGRA在營養(yǎng)不良的結核病患者中具有與其他人群同樣的輔助診斷價值，并有可能適用于營養(yǎng)不良人群中LTBI者的篩查。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻拉巴：實驗設計、數(shù)據(jù)的采集與整理、初稿撰寫；張蒙蒙和王明桂：數(shù)據(jù)分析及初稿撰寫；賀建清：主導整個課題設計及論文初稿修改