錢茂升 ， 周海梅 ， 韓 立 ， 卞 華 ， 徐興敏*

(1.河南科技大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院 ， 河南 洛陽 471023 ； 2.南陽理工學(xué)院 河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室 ， 河南 南陽 473004)

黃連主要含小檗堿、黃連堿、表小檗堿、巴馬汀等生物堿，目前主要采用黃連藥材的根塊來提取，發(fā)揮藥效作用[1-2]。而黃連葉柄、葉莖、根須這些下腳料，據(jù)記載也含有可觀的藥效成分，但尚未得到充分利用，造成較大的資源浪費。目前從黃連中提取小檗堿類的測定方法也多為高效液相色譜法等，測定黃連下腳料中生物堿含量的研究鮮有報道[3-4]。本實驗以開發(fā)黃連藥材的全面利用為目的，從黃連下腳料出發(fā)，采用柱色譜-紫外可見光光度法對黃連下腳料中生物堿的含量進行測定，方法簡單，結(jié)果穩(wěn)定可靠[5-6]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；高速多功能粉碎機-200Y，永康市鉑歐五金制品有限公司；電子分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司； SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；色譜用氧化鋁柱，洛陽市新慕實驗儀器有限公司。

1.2 試藥

黃連下腳料，河南永超生物科技有限公司提供；鹽酸小檗堿對照品，購于合肥博美生物科技有限責任公司；層析堿性氧化鋁，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇、鹽酸，試劑均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

準確稱量鹽酸小檗堿1 mg，用甲醇溶解于10 mL容量瓶中，定容至刻度，倒置搖勻。用移液管準確量取2 mL溶液置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，倒置搖勻，即得20 mg/L的鹽酸小檗堿對照品溶液[7]。

2.2 供試品溶液的制備

①將黃連下腳料粉碎研磨，過二號篩；②準確稱取粉末5 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，準確加入鹽酸-甲醇(1∶100)溶劑100 mL，稱定質(zhì)量，搖勻靜置一段時間；③超聲處理30 min，時時振蕩，冷卻至室溫稱定質(zhì)量，用前述溶劑補齊質(zhì)量，搖勻抽濾；④準確量取濾液5 mL，至堿性氧化鋁柱上(20 g，濕法裝柱，用30 mL甲醇預(yù)洗)，30 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，倒置搖勻；⑤準確量取洗脫液1 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，振蕩搖勻，即得供試品溶液[8-10]。

2.3 測定波長的選擇

將對照品溶液、供試品溶液置于紫外可見分光光度計上，在200～700 nm波長范圍內(nèi)分別進行掃描，紫外光譜圖見圖1。由圖1可見，對照品溶液與供試品溶液的光譜圖線性相似，在229 nm處都有最大吸收峰，確定本實驗的測定波長為229 nm。

圖1 紫外光譜圖

2.4 標準曲線的建立

分別準確量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶劑定容至刻度，倒置搖勻。按照紫外分光光度法，以甲醇溶劑為空白對照，在229 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，鹽酸小檗堿濃度(mg/L)為橫坐標進行線性回歸，建立標準曲線，得到線性方程y=0.072 12x-0.000 8，R2=0.999 8。結(jié)果表明，在2～12 μg/mL內(nèi)吸光度與鹽酸小檗堿濃度線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實驗

按照2.1方法制備得濃度為8 mg/L的鹽酸小檗堿對照品溶液，在波長229 nm處連續(xù)測定5次，測得吸光度分別為0.576、0.575、0.576、0.577、0.577。5次測定的相對標準偏差RSD為0.12%，表明實驗用紫外可見分光光度計精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗與含量測定

按照2.2的方法制備供試品溶液5份，在波長229 nm處分別進行吸光度測定，實驗結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明：黃連下腳料中生物堿的平均含量為4.66%，實驗結(jié)果重復(fù)性高，方法穩(wěn)定。

表1 含量測定與重復(fù)性實驗結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性實驗

按照2.2的方法下制備得供試品溶液，在229 nm波長下，每隔6 h進行吸光度測定，測定結(jié)果分別為0.338、0.341、0.333、0.334、0.331，其相對標準偏差RSD為1.2%，表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好，在24 h之內(nèi)均可測定。

2.8 回收率實驗

準確稱量黃連下腳料粉末0.5 g，稱定5份，過堿性氧化鋁柱前，準確加入濃度為0.1 mg/L的對照品溶液1.2 mL，按照2.2的方法和條件操作制備供試品溶液，在229 nm波長處分別測定吸光度，計算加標回收量和回收率，實驗結(jié)果見表2。結(jié)果表明：實驗回收率在95.00%～102.50%，平均回收率為98.17%，相對標準偏差RSD為3.03%，該實驗測定方法準確可靠。

表2 回收率實驗結(jié)果

3 結(jié)論

黃連下腳料成分復(fù)雜，采用堿性氧化鋁柱層，紫外分光光度法測定其有效成分生物堿的含量，能較好地消除雜質(zhì)對測定的干擾，可以作為研究黃連下腳料小檗堿類含量的分析方法。

采用紫外可見分光光度法測定生物堿含量時，其最大吸收峰在波長228、265、346、430 nm附近，最大吸收峰的位置可能受不同溶劑的影響。本實驗對照品溶液與供試品溶液在229 nm波長處有最大吸收峰，所以選擇229 nm作為黃連下腳料中生物堿含量的測定波長。

目前對黃連下腳料中生物堿含量的研究較少，常見的方法有高效液相色譜法和薄層掃描法，而采用紫外可見分光光度法操作便捷，方法可靠，準確穩(wěn)定。通過本實驗研究表明，在2～12 mg/L濃度范圍內(nèi)濃度與吸光度線性關(guān)系良好，以標準曲線法測得黃連下腳料中生物堿的平均含量為4.66%，平均回收率為98.17%，重復(fù)性實驗RSD為1.3%，為黃連下腳料中小檗堿類的研究提供數(shù)據(jù)參考，為黃連藥材的全面開發(fā)應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。