高效液相色譜法測定鴨肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素及強(qiáng)力霉素殘留量的研究

閑少玲

摘 要：本文采用高效液相色譜法，檢測鴨肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素殘留量，選用Shim-pack GIST C18色譜柱，樣品經(jīng)過Mcllvaine緩沖溶液（pH=3.5）提取，HLB固相萃取柱凈化，流動相梯度洗脫，檢測波長為365 nm，采用外標(biāo)法定量。結(jié)果表明4種抗生素的線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率為83.2%～97.5%。證實(shí)了高效液相色譜法應(yīng)用優(yōu)勢，能夠滿足土霉素、四環(huán)素、金霉素及強(qiáng)力霉素殘留量檢測要求。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;鴨肉;霉素殘留

Determination of Oxytetracycline， Tetracycline， Chlortetracycline and Doxycycline Residues in Duck Meat by High Performance Liquid Chromatography

XIAN Shaoling

（Zhaoqing Food Inspection Institute， Zhaoqing 526000， China）

Abstract： High performance liquid chromatography was used to detect the residues of oxytetracycline， tetracycline， chlortetracycline and doxycycline in duck meat. Shim-pack GIST C18 chromatography was used. The samples were extracted with Mcllvaine buffer solution （pH=3.5）， HLB Solid-phase extraction column purification， mobile phase gradient elution， detection wavelength of 365 nm， using external standard method for quantification. The results showed that the linear relationship of the four antibiotics was good， and the spiked recoveries ranged from 83.2% to 97.5%. The application advantages of high performance liquid chromatography are confirmed， and it can meet the detection requirements of oxytetracycline， tetracycline， chlortetracycline and doxycycline residues.

Keywords： high performance liquid chromatography; duck meat; penicomycin residue

四環(huán)素類抗生素是一種由放線菌產(chǎn)生的廣譜性抗生素，有良好的殺菌抑菌作用[1]。一些養(yǎng)殖場為追求利益，作為飼料添加劑給禽畜進(jìn)食，降低禽畜發(fā)病率，改善產(chǎn)品質(zhì)量，長期大量不合理使用四環(huán)素類藥物，會導(dǎo)致動物源性產(chǎn)品體內(nèi)殘留，從而危害人體健康。因此需嚴(yán)格監(jiān)控動物源性食品中四環(huán)素類藥物殘留量以維護(hù)人體健康。目前，四環(huán)素類抗生素殘留量的檢測方法有紫外分光光度法[2]、高效液相色譜法[3-5]、液質(zhì)聯(lián)用法[6-7]等多種方法。本次研究采用通過高效液相色譜法對鴨肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素殘留量進(jìn)行檢測，并對該方法進(jìn)行了優(yōu)化、分析檢測效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土霉素、四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品;HLB固相萃取柱;甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器;全自動濃縮儀;電子天平;pH計(jì);高速臺式冷凍離心機(jī);全自動智能氮吹儀;多管漩渦混合器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

精密稱取粉碎混合5.0 g鴨肉樣品，置于50 mL離心管中，加入20 mL的Mcllvaine緩沖液，渦旋振蕩5 min，低于15 ℃條件下10 000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5 min，移出上清液，在剩余殘?jiān)蟹謩e加入

15 mL的Mcllvaine緩沖液重復(fù)提取兩次，合并3次上清液，并定容至50 mL，混勻。將提取液用快速濾紙過濾，收集過濾液，準(zhǔn)確吸取10 mL濾液，濾液經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，35 ℃氮吹近干，用流動相溶解并定容至1 mL，0.45 μm濾膜過濾，濾液供上機(jī)測定。

1.3.1 溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲備液。稱取土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容100 mL，各抗生素濃度為100 μg/mL，于-18 ℃條件下存儲。

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用流動相將標(biāo)準(zhǔn)儲備液根據(jù)需要配制成適當(dāng)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)液。

（3）Mcllvaine緩沖液。稱取檸檬酸12.9 g、磷酸氫二鈉27.6 g、乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，用水溶解后稀釋并定容至1 000 mL。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18;流動相：A為草酸水溶液（0.01 mol/L），B為乙腈︰甲醇（1︰1）;流速：1 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測波長：365 nm;進(jìn)樣量：50 μL。流動相梯度洗脫見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

以4種抗生素的峰面積和分離度為指標(biāo)，選用Aielent5 TC C18、BIossmate ?psv C18、Shim-pack Veloxsp C18和Shim-pack GIST C18等不同色譜柱對鴨肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素的分離效果，見圖1。結(jié)果表明，在1.3.2的色譜條件下Shim-pack GIST C18色譜柱，4種抗生素達(dá)到較好的分離效果，適合分析各目標(biāo)物，且各目標(biāo)物峰形良好。

2.2 流動相的選擇

采用Shim-pack GIST C18作為分析色譜柱，分別選用甲醇∶乙腈（1∶1）-0.01 mol/L三氟乙酸，乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鈉，乙腈∶甲醇（1∶1）-0.01 mol/L草酸水溶液等流動相作土霉素、四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素的分離度及色譜響應(yīng)效果的選擇。結(jié)果表明，采用甲醇∶乙腈（1∶1）-0.01 mol/L三氟乙酸，土霉素、四環(huán)素兩者完全不能分離。采用乙腈-0.01 mmol/L磷酸二氫鈉，土霉素、四環(huán)素兩者未徹底分離，峰形較扁平，出峰時(shí)間滯后。當(dāng)采用乙腈∶甲醇（1∶1）-0.01 mol/L草酸水溶液，土霉素、四環(huán)素兩者能完全分離，峰形尖銳。因此選擇乙腈∶甲醇（1∶1）-0.01 mol/L草酸水溶液作為流動相，4種抗生素響應(yīng)值較好，且經(jīng)過梯度洗脫后具有更好的分離效果和靈敏度，再改變流動相比例縮短出峰時(shí)間。

2.3 提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用5%的高氯酸和Mcllvaine緩沖液作為樣品中4種抗生素提取溶劑，通過空白鴨肉加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行提取效果比較，采用Mcllvaine緩沖溶液時(shí)效果最好，回收率均高于5%高氯酸提取溶劑回收率。說明Mcllvaine緩沖溶液提取能力較強(qiáng)，因此選擇Mcllvaine緩沖液作為樣品提取溶劑最為合適，再結(jié)合與HLB固相萃取柱凈化，有效去除其雜質(zhì)，回收率、重現(xiàn)性不易被影響。不同pH值提取溶劑對4種抗生素分離度均有一定影響，考慮到四環(huán)素類抗生素一般情況在弱酸條件下比較穩(wěn)定，將Mcllvaine緩沖溶液設(shè)為pH值為3.5，可有效分離，且不會影響峰形。

2.4 檢測波長的選擇

通過二極管陣列檢測器進(jìn)行測定，選檢測波長在350～365 nm對加標(biāo)樣品進(jìn)行檢測，隨著檢測波長增大，峰面積逐漸增大，在365 nm時(shí)吸收最大，干擾小，靈敏度高，因此選擇365 nm檢測波長為最佳吸收波長。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在1.3.2的色譜條件下，繪制4種抗生素標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比，準(zhǔn)確計(jì)算檢出限。結(jié)果如表2所示。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，4種抗生素濃度、峰面積具備良好線性關(guān)系。

2.6 加標(biāo)回收率和精密度

實(shí)驗(yàn)采用空白鴨肉樣品中分別加入4種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品溶液最終濃度為0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、1.0 μg/mL，每個(gè)水平重復(fù)測定6次，計(jì)算平均回收率和精密度，結(jié)果見表3。土霉素加標(biāo)回收率為85.7%～89.3%，4環(huán)素回收率為83.2%～84.8%，金霉素回收率為92.4%～97.5%，強(qiáng)力霉素回收率為87.0%～90.7%，4種抗生素RSD為0.9%～3.0%，說明本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度高、精密度好。

3 結(jié)論

通過此次實(shí)驗(yàn)研究，優(yōu)化高效液相色譜法色譜條件，改進(jìn)測定方法，可以更好地分離土霉素、四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素，且使用本方法前處理簡單，靈敏度高，分離效果好，準(zhǔn)確度高，可以滿足四環(huán)素類抗生素檢測要求，值得推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

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