親環(huán)素A在人卵巢癌組織中表達(dá)情況及臨床意義

嚴(yán)京哲， 梁衍濤， 袁 勇， 周 莉

吉林省腫瘤醫(yī)院1.腹部腫瘤二科；2.骨及軟組織腫瘤外科；3.婦瘤二科，吉林 長(zhǎng)春 130021

卵巢癌是常見的女性生殖器官惡性腫瘤，因卵巢位于盆腔深部，早期病變不易被發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者出現(xiàn)癥狀時(shí)已處于晚期。卵巢上皮性癌病死率居?jì)D科惡性腫瘤第1位[1]。因此，尋找特異性的卵巢癌治療及預(yù)后標(biāo)志物有助于卵巢癌的早期診治，進(jìn)而改善患者預(yù)后。親環(huán)素A(Cyclophilin A，CypA)是免疫抑制劑環(huán)孢霉素A在細(xì)胞內(nèi)的作用靶點(diǎn)[2-3]。有研究表明，多種實(shí)質(zhì)性腫瘤組織中CypA蛋白均高表達(dá)[4-8]；而卵巢癌與CypA蛋白相關(guān)性的研究較少。因此，本研究通過手術(shù)切除人卵巢癌組織標(biāo)本，采用免疫組化法分析人卵巢癌組織中CypA蛋白表達(dá)與其病理分級(jí)、臨床分期及預(yù)后的相關(guān)性，探討CypA蛋白作為輔助標(biāo)志物診斷人卵巢癌的可行性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 選取吉林省腫瘤醫(yī)院自2000年1月至2012年12月收治的37例接受婦科手術(shù)切除并病理證實(shí)為卵巢癌的患者為研究對(duì)象。卵巢癌患者年齡32～71歲，平均年齡(47.3±8.8)歲；病理分級(jí)高(G1級(jí))、中分化(G2級(jí))13例，低分化(G3級(jí))24例；臨床分期Ⅰ/Ⅱ期15例，Ⅲ/Ⅳ期22例；均為初發(fā)，且術(shù)前未接受過放化療。收集卵巢癌患者的卵巢癌組織。另選取同期10例接受婦科子宮肌瘤手術(shù)的患者作為對(duì)照。子宮肌瘤患者年齡36～60歲，平均年齡(46.0±8.2)歲。收集子宮肌瘤患者的正常卵巢組織?；颊呒凹覍倬橥狻１狙芯拷?jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。組織標(biāo)本甲醛40 g/L固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度約5 μm。DAB、ABC復(fù)合物、羊抗兔二抗購(gòu)自Vector公司，兔抗人CypA多克隆抗體ab41684購(gòu)自abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 (1)常規(guī)脫蠟、水化切片；(2)用pH 6.0的枸櫞酸鈉緩沖溶液0.01 mol/L抗原修復(fù)1～2次；(3)用含H2O230 ml/L的甲醇800 ml/L室溫條件下封閉切片20 min，目的在于消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響；(4)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗時(shí)間5 min，加入0.3% Triton X-100，置于室溫條件下孵育30 min，目的在于提高細(xì)胞的通透性；(5)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗時(shí)間5 min，加入CypA多克隆抗體(1∶200)，置于4℃條件下24 h；(6)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗時(shí)間5 min，加入二抗(1∶400)，置于室溫條件下孵育2 h；(7)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗時(shí)間5 min，加入ABC復(fù)合物(1∶400)，置于室溫條件下孵育2 h；(8)用PBS溶液0.01 mol/L清洗3次，每次清洗時(shí)間5 min，用蒸餾水迅速?zèng)_3次，然后再加入DAB-H2O2顯色3 min，蘇木精復(fù)染，脫水、封片。將PBS溶液0.01 mol/L代替一抗作空白對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 CypA蛋白表達(dá)結(jié)果判定：陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞有棕褐色、棕色、淺黃色顆粒；以陽(yáng)性顆粒定位好，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清洗、著色與背景對(duì)比清晰為陽(yáng)性染色細(xì)胞條件。觀察5個(gè)(400倍)高倍視野陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，其中，(-)表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<1%或無陽(yáng)性細(xì)胞，(+)表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1%～10%，(++)表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)11%～50%，(+++)表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%。

1.4 隨訪 采用信訪和電話隨訪方式，于患者手術(shù)之日開始，隨訪至2013年6月。統(tǒng)計(jì)資料除外隨訪期內(nèi)死于卵巢癌以外原因或術(shù)后3個(gè)月內(nèi)死亡者。記錄患者生存時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 CypA蛋白表達(dá)情況 子宮肌瘤患者的正常卵巢組織CypA蛋白陰性表達(dá)(圖1a)；病理分級(jí)G1～G2級(jí)卵巢癌細(xì)胞胞質(zhì)有棕黃色細(xì)顆粒，染色淡，陽(yáng)性細(xì)胞少(圖1b)；病理分級(jí)G3級(jí)卵巢癌細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞多，且胞質(zhì)棕黃色著色較深(圖1c)。37例卵巢癌組織中，CypA蛋白表達(dá)22例，陽(yáng)性率為59.5%(22/37)；10例正常卵巢組織中，CypA蛋白表達(dá)0例，陽(yáng)性率為0(0)。卵巢癌組織CypA蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CypA蛋白表達(dá)22例患者中：(1)病理分級(jí)G1～G2級(jí)4例，陽(yáng)性率為30.8%(4/13)；病理分級(jí)G3級(jí)18例，陽(yáng)性率為75.0%(18/24)。G3級(jí)卵巢癌組織CypA蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于G1～G2級(jí)卵巢癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)臨床分期Ⅰ/Ⅱ期5例，陽(yáng)性率為33.3%(5/15)；臨床分期Ⅲ/Ⅳ期17例，陽(yáng)性率為77.3%(17/22)。Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌組織CypA蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ/Ⅱ期卵巢癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 卵巢組織CypA蛋白表達(dá)情況[a.正常卵巢組織，CypA蛋白表達(dá)陰性，200倍；b.人卵巢癌病理分級(jí)G1級(jí)組織，CypA蛋白表達(dá)弱陽(yáng)性(+)，400倍；c.人卵巢癌病理分級(jí)G3級(jí)組織，CypA蛋白表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，400倍]

2.2 CypA蛋白在人卵巢癌組織中表達(dá)強(qiáng)度與預(yù)后相關(guān)性 37例卵巢癌患者平均隨訪43.54個(gè)月(3～87個(gè)月)。15例患者CypA蛋白表達(dá)陰性(-)，7例患者弱陽(yáng)性(+)，6例患者中度陽(yáng)性(++)，9例患者強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。CypA蛋白表達(dá)陰性(-)患者平均生存時(shí)間(62.55±14.32)個(gè)月，弱陽(yáng)性(+)(44.29±13.33)個(gè)月，中度陽(yáng)性(++)(31.83±7.78)個(gè)月，強(qiáng)陽(yáng)性(+++)(19.11±10.79)個(gè)月，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CypA蛋白表達(dá)強(qiáng)度與患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.792，P<0.05)。

3 討論

有研究報(bào)道，CypA蛋白在胰腺癌[4]、肺癌[5-6]、大腸癌[7]等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。多項(xiàng)研究證實(shí)，癌組織中CypA蛋白表達(dá)增高，在子宮內(nèi)膜癌和胰腺癌中，CypA的表達(dá)與病理分級(jí)、預(yù)后密切相關(guān)[8-9]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中CypA蛋白的表達(dá)在胰腺癌的生長(zhǎng)、侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[10-11]。

本研究結(jié)果顯示：CypA蛋白在正常卵巢組織中表達(dá)陰性，而在人卵巢癌組織中表達(dá)陽(yáng)性率高，主要為胞漿著色；卵巢癌組織CypA蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于正常卵巢組織，病理分級(jí)G3級(jí)卵巢癌組織CypA蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于G1～G2級(jí)卵巢癌組織，臨床分期Ⅲ/Ⅳ期卵巢癌組織CypA蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于Ⅰ/Ⅱ期卵巢癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CypA蛋白表達(dá)強(qiáng)度與患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.792，P<0.05)。即隨著卵巢癌惡性程度增長(zhǎng)，CypA蛋白表達(dá)水平呈升高趨勢(shì)，不同病理級(jí)別、臨床分期卵巢癌組織的CypA蛋白表達(dá)差異明顯，且CypA蛋白表達(dá)與患者生存時(shí)間密切相關(guān)。這提示，人卵巢癌組織中CypA蛋白的表達(dá)可反映卵巢癌的病理級(jí)別、臨床分期及預(yù)后等因素，CypA蛋白表達(dá)水平可以作為判斷人卵巢癌惡性程度的指標(biāo)之一。

綜上所述，人卵巢癌組織中CypA蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的惡性程度及預(yù)后相關(guān)，檢測(cè)CypA蛋白表達(dá)對(duì)于判斷人卵巢癌的性質(zhì)和預(yù)后具有一定價(jià)值，其可能為癌癥治療方式的發(fā)展提供新的藥物靶點(diǎn)。