青島嶗山灣近海扇貝養(yǎng)殖區(qū)細菌多樣性及環(huán)境因子分析

馬景雪張培玉王宗興鄭明剛高 萍曲凌云王 波鄭風榮*

(1.青島大學 環(huán)境科學與工程學院,山東 青島 266071;2.自然資源部 第一海洋研究所,山東 青島 266061;3.自然資源部 海洋生態(tài)環(huán)境科學與工程實驗室,山東 青島 266061)

中國擁有豐富的海洋漁業(yè)資源[1],海水養(yǎng)殖在海洋漁業(yè)中占有重要的地位。近年來,我國水產養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛,其中貝類養(yǎng)殖已經發(fā)展成為我國海水養(yǎng)殖的支柱產業(yè)[2],據(jù)漁業(yè)年鑒統(tǒng)計,2019年全國貝類的海水養(yǎng)殖面積為120.42×104萬m2,占全國海水養(yǎng)殖總面積60.45%;2019年全國貝類海水養(yǎng)殖產量為1 438.97萬t,占全國海水養(yǎng)殖總產量的69.67%,其中山東省位居全國沿海省份貝類養(yǎng)殖產量首位[3]。

養(yǎng)殖規(guī)模的增加,加速了向沿海生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分排放[4-7],使近海養(yǎng)殖水域的環(huán)境惡化,導致病害頻發(fā),給貝類養(yǎng)殖產業(yè)造成了巨大的經濟損失。養(yǎng)殖自身污染問題成為養(yǎng)殖海域環(huán)境惡化的主要原因之一[8],加劇了海水富營養(yǎng)化程度,破壞了生物多樣性,在不同濃度有機質的影響下,微生物群落的生理機能也隨之發(fā)生改變[9-10],而每天過濾大量海水的濾食性動物——雙殼貝類則更容易受到水中細菌群落變化的影響[11],從而誘發(fā)貝類病變。

位于青島嶗山灣海域的青山村扇貝養(yǎng)殖區(qū)規(guī)模龐大,其中櫛孔扇貝的筏式養(yǎng)殖占據(jù)主要比例。該養(yǎng)殖區(qū)位于河口附近,河流的輸入會導致近海岸呈現(xiàn)顯著的鹽度梯度,p H、溫度和營養(yǎng)鹽也發(fā)生明顯變化,從而形成動態(tài)復雜的水環(huán)境系統(tǒng)[12]。前人對養(yǎng)殖區(qū)浮游植物群落結構多樣性頗有研究[13-20],而對近海扇貝養(yǎng)殖區(qū)浮游細菌群落結構研究鮮少。2019年本研究選取養(yǎng)殖活動頻繁的5月至10月,對該海域環(huán)境理化因子進行監(jiān)測,利用基于16S rRNA基因的Illumina Miseq高通量測序方法對其細菌群落多樣性及其在空間和時間尺度上的變化進行分析,并探討了環(huán)境因子與菌群結構的相互作用,以期為該水域的水產養(yǎng)殖及近海海域生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展提供支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集時間與地點

本研究于2019年5至10月在青島市嶗山灣青山村近海扇貝養(yǎng)殖海域采樣,每月采集1次。采樣區(qū)(圖1)分為養(yǎng)殖密區(qū)(120°41′40″E,36°09′21″N)、養(yǎng)殖疏區(qū)(120°42′04″E,36°09′28″N)、對照區(qū)(120°42′24″E,36°09′35″N)三個區(qū),分別命名為M 區(qū)、S區(qū)和D 區(qū),在每個區(qū)域均等地選3個站位采樣(間距＞500 m)。

圖1 樣品采集地理位置示意圖Fig.1 Geographic location of sample collection

1.2 樣品采集與處理

用手持式柱狀采水器在指定點采取1 L表層水,在低溫(4 ℃)條件下運回實驗室;采用0.22μm 的濾膜負壓過濾300 m L水樣,將處理好的濾膜用液氮速凍,放-80 ℃冰箱保存。每份水樣過濾重復3次。

1.2.1 環(huán)境因子的測量

本研究采用WZB-170型便攜式濁度計測量水樣濁度,JENCO 9030M 便攜式溶氧(S)測定儀測量溶氧(Dissolved Oxygen,DO)質量濃度和溫度(θ),556MPS 便攜式多參數(shù)水質測量儀測量鹽度,TURNER Designs Triligy實驗室熒光儀測量葉綠素a(Chl-a)質量濃度,其他參數(shù)在實驗室中均用標準方法測量。

1.2.2 流式細胞術測定細菌豐度

各站位取4 m L海水至凍存管中,隨后加入444μL戊二醛固定,在低溫避光的條件下帶回實驗室,液氮處理后,-80 ℃保存。采用細胞流式儀進樣前,取180μL 樣品和20μLSYBRTMGreenⅠnucleic acid gelstain(invitrogen,USA)染料混勻,染色完成后,上機測樣。使用低流速(14μL/min),激發(fā)電壓為SSC 450、FL1 500、FL2 510和FL3 661。

1.2.3 Illumina Miseq高通量測序

用DNeasy Powerwater Pro Kit試劑盒(QIAGEN,USA)提取DNA,用1%的瓊脂糖凝膠檢測提取的DNA 質量。分別用細菌通用引物338F-806R[21]和弧菌特異性引物V_169F-V_680R[22-23]兩對引物對DNA 進行PCR 擴增(表1)。將同一樣本的PCR 產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,利用Axy Prep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)回收產物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用QuantusTMFluorometer(Promega,USA)對回收產物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences in this study

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

利用均值法處理環(huán)境因子的數(shù)據(jù)及細菌細胞的豐度;使用Fastp軟件[24]和FLASH 軟件[25]分別對原始測序序列進行質控和拼接,利用UPARSE 軟件根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU 聚類并剔除嵌合體[26-27]。利用RDP classifier[28]對每條序列進行物種分類注釋。利用R 語言(version 3.3.1)進行物種組成分析、環(huán)境因子與群落結構的相關性分析及冗余分析。利用SPSS 22.0 的單因素方差分析(one-way Analysis of Variance,one-way ANOVA)進行組間差異顯著性檢驗。

2 結果

2.1 環(huán)境因子理化指標

養(yǎng)殖環(huán)境是水產養(yǎng)殖中一個不可忽視的部分,養(yǎng)殖用水的理化性質是養(yǎng)殖活動的重要保證,表2展示了嶗山灣青山村近海養(yǎng)殖區(qū)在2019年5月至10月的環(huán)境理化指標變化,養(yǎng)殖水質符合《海水水質標準》(GB 3097-1997)[29]第二類水質標準要求。

表2 2019年嶗山灣青山村扇貝養(yǎng)殖區(qū)理化性質指標Table 2 Physical and chemical properties of scallop culture area in Qingshan Village,Laoshan District from May to October in 2019

續(xù)表

2.2 流式細胞儀檢測細菌豐度結果

從海水中細菌單細胞的集聚分布情況(圖2)所示,側向散射光(Side Scattering,SSC)與細胞的內容物含量有關,FL表示顆粒被染上的熒光的數(shù)量。通過SSC對FL1和FL3對FL1雙參數(shù)圖對細菌細胞進行區(qū)分和計數(shù)。R1和R2分別為在不同的熒光強度下根據(jù)聚集情況劃分的細菌細胞門。由流式細胞儀計數(shù)結果(圖2)可知,每毫升海水的細胞數(shù)的變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。養(yǎng)殖密區(qū)及疏區(qū)均在9月達到最高點,對照區(qū)的最高點出現(xiàn)在8月,其最低點均出現(xiàn)在5月(圖3)。

圖2 細胞流式圖Fig.2 Cell flow diagram

圖3 2019年5月至10月養(yǎng)殖區(qū)海域細菌細胞數(shù)量Fig.3 The number of bacterial cells in the aquaculture area from May to October in 2019

2.3 水體菌群多樣性及其對環(huán)境因子響應

2.3.1 微生物Alpha多樣性分析

通過聚類操作,根據(jù)97%的相似度水平,對所有序列進行OTU 劃分,青山村扇貝養(yǎng)殖區(qū)及對照區(qū)細菌的香農-威納指數(shù)(Shannon-Weiner Index)呈現(xiàn)波動的變化趨勢,養(yǎng)殖疏區(qū)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢?；【南戕r-威納指數(shù)均呈現(xiàn)M 型變化。2019年9月,細菌多樣性升高而弧菌多樣性降低,且細菌細胞數(shù)也達到峰值(圖4a和4b)。

圖4 2019年5月至10月水環(huán)境細菌和弧菌多樣Fig.4 The diversities of bacteria and Vibrio in water environment from May to October in 2019

2.3.2 水環(huán)境群落組成

本研究共檢測出52 個細菌門,其中存在11 個優(yōu)勢門(豐度占比大于1%),分別為變形菌門(Proteobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、Patescibacteria、疣微菌門(Verrucomicrobia)、Marinimicrobia_SAR406-clade、綠彎菌門(Chloroflexi)、Epsilonbacteraeota、酸桿菌門(Acidobacteria),其中變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢菌門(圖5)。

圖5 細菌門水平群落結構組成Fig.5 Compostion of community structure at bacterial phylum level

在綱水平,共檢測出115個綱,其中存在13個優(yōu)勢綱(豐度占比大于1%),相對豐度較高的是γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、擬桿菌綱(Bacteroidia)和放線菌綱(Actinobacteria)(圖6)。

圖6 細菌綱水平群落結構組成Fig.6 Composition of community structure at bacterial class level

弧菌屬在細菌屬水平豐度中占據(jù)重要的比例(圖7),養(yǎng)殖密區(qū)在2019年6月和7月出現(xiàn)較高的豐度比例,對照區(qū)在2019年7月的豐度比例最高。

圖7 養(yǎng)殖區(qū)弧菌豐度比例分布Fig.7 Diagram of abundance proportion of Vibrio in culture area from May to October in 2019

對各區(qū)不同月份的樣品及密區(qū)、疏區(qū)和對照區(qū)的樣品進行優(yōu)勢門的組間差異顯著性檢驗分析,結果表明,各區(qū)樣品在不同月份Bacteroidetes、Verrucomicrobia、Marinimicrobia_SAR406_clade、Chloroflexi、Acidobacteria具有差異(P＜0.05)或顯著差異(P＜0.01),而密區(qū)、疏區(qū)和對照區(qū)的樣品在門水平上微生物組成沒有顯著差異(圖8)。

圖8 組間差異顯著分析Fig.8 Analysis of significant differences between groups from May to October in 2019

2.3.3 水環(huán)境群落組成與環(huán)境因子的相關性

RDA 分析揭示了不同區(qū)域樣品中微生物組成與環(huán)境因子的相關性,采用bioenv函數(shù)檢驗了每個環(huán)境因子的顯著性,在養(yǎng)殖密區(qū)、養(yǎng)殖疏區(qū)和對照區(qū)的RDA 分析中,第一坐標軸和第二坐標軸共貢獻解釋量分別為59.25%、47.1%和45.27%。結果表明,濁度(P=0.027)對養(yǎng)殖密區(qū)OTU 水平的物種組成和群落結構具有顯著的影響;硝酸鹽(P=0.017)、濁度(P=0.033)對養(yǎng)殖疏區(qū)OTU 水平的物種組成和群落結構具有顯著的影響,磷酸鹽(P=0.004)、DO(P=0.001)、p H(P=0.004)對其具有顯著的影響;DO(P=0.018)對對照區(qū)OTU 水平的物種組成和群落結構具有顯著的影響(圖9)。

圖9 細菌OTU 水平環(huán)境因子RDA 分析Fig.9 RDA analysis on the correlation between environmental factors and bacterial OTU level

通過Spearman 相關性計算,利用求平均的方式對環(huán)境因子和物種層級進行聚類,選取門水平上豐度為前11位的物種進行分析,相關性Heatmap圖和環(huán)境因子聚類樹分析結果表明:

1)在門水平上,養(yǎng)殖密區(qū)的細菌群落物種與環(huán)境因子均具有不同程度的相關性,其中,擬桿菌門與鹽度(Spearman相關系數(shù)r=-0.776,P＜0.001)呈現(xiàn)極顯著負相關關系;綠彎菌門與濁度(Spearman相關系數(shù)r=0.744,P＜0.001)呈現(xiàn)極顯著正相關關系。養(yǎng)殖疏區(qū)的放線菌門與濁度呈現(xiàn)極顯著正相關關系(Spearman相關系數(shù)r=0.808,P＜0.001);Marinimicrobia_SAR406_clade與鹽度呈現(xiàn)極顯著正相關關系(Spearman相關系數(shù)r=0.856,P＜0.001),厚壁菌門分別與DIN(Spearman相關系數(shù)r=0.760,P＜0.001)和硝酸鹽(Spearman相關系數(shù)r=0.751,P＜0.001)呈現(xiàn)極顯著正相關關系(圖10和圖11)。

圖10 養(yǎng)殖密區(qū)細菌門水平環(huán)境因子相關性Heatmap圖Fig.10 Heatmap diagram of correlation between bacterial phylum level and environmental factors in intensive culture area

圖11 養(yǎng)殖疏區(qū)細菌門水平環(huán)境因子相關性Heatmap圖Fig.11 Heatmap diagram of correlation between bacterial phylum level and environmental factors in sparse culture area

2)在門水平上,對照區(qū)的物種與環(huán)境因子具有不同程度的相關性,與養(yǎng)殖區(qū)不同,其中,酸桿菌門和厚壁菌門與葉綠素分別呈現(xiàn)顯著負相關關系(Spearman相關系數(shù)r=-0.612,P＜0.01)和極顯著正相關關系(Spearman相關系數(shù)r=0.736,P=0.001),Patescibacteria與溫度呈現(xiàn)顯著正相關關系(Spearman相關系數(shù)r=0.650,P＜0.01),綠彎菌門和擬桿菌門分別與濁度具有顯著正相關(Spearman相關系數(shù)r=0.642,P＜0.01)和極顯著負相關關系(Spearman相關系數(shù)r=-0.722,P＜0.001),放線菌門與溶解氧呈現(xiàn)顯著正相關關系(Spearman相關系數(shù)r=0.607,P＜0.01)(圖12)。

圖12 對照區(qū)細菌門水平環(huán)境因子相關性Heatmap圖Fig.12 Heatmap diagram of correlation between bacterial phylum level and environmental factors in control area

3 討論

3.1 海水水樣細菌群落多樣性

通過Illumina Miseq高通量測序的方法對養(yǎng)殖區(qū)海水水樣進行門、綱水平的群落結構分析,結果表明,在水樣樣品中共檢測到52個門、115個綱,香農-威納指數(shù)為4.762～5.539,Sobs指數(shù)為676～2 140。2019年8月和9月的細菌多樣性指數(shù)較高,香濃指數(shù)總體上隨溫度的變化而變化,但2019年7月的養(yǎng)殖密區(qū)和對照區(qū)的多樣性指數(shù)相對低于趨勢線,這可能是由在該月份取樣時出現(xiàn)連續(xù)的雷雨天氣所致。根據(jù)圖5可知,不同區(qū)域不同月份的樣品中的優(yōu)勢群落均為變形菌門(Proteobacteria),占總群落50%以上,主要包括α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria。其他的優(yōu)勢菌門排列依次是藍細菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、Patescibacteria、疣微菌門(Verrucomicrobia)、Marinimicrobia、綠彎菌門(Chloroflexi)、Epsilonbacteraeota、酸桿菌門(Acidobacteria)。檢測結果與近年來的研究結果相似,楊銘玉等[30]對東海舟山漁場近岸細菌群落結構分析得出,該養(yǎng)殖區(qū)主要的細菌群落類群為變形菌(62.99%)、擬桿菌群(10.23%)、藍藻細菌(9.69%)、放線菌門(8.94%)。遼東灣沿海的仿刺參、對蝦混養(yǎng)養(yǎng)殖水體中主要是變形菌門(51.5%),其次是放線菌門(23.6%)、擬桿菌門(11.3%)、厚壁菌門(9.1%)[31]。王飛飛[32]利用高通量測序、分子生物學方法等手段對黃海北部海域貝類養(yǎng)殖區(qū)進行細菌群落分析,也證明養(yǎng)殖區(qū)的海水中變形菌門占絕對優(yōu)勢。

在綱水平中,γ-變形菌綱在群落中占據(jù)了主導地位,且養(yǎng)殖區(qū)豐度占比高于對照區(qū),其中包含許多重要的病原菌,如沙門氏菌屬(Salmonella)、耶爾辛氏菌屬(Yersinia)、弧菌屬(Vibrio),這些菌群會引起不同程度的生物感染,嚴重者會導致大面積流行病的爆發(fā)。變形菌門中σ-變形菌綱的比例相對較小,具有硫氧化、固碳、C1利用和異養(yǎng)能力[33],在2019年8、9和10月份活動較為頻繁。SAR406在2019年9和10月份占比較高,該菌門參與厭氧氨氧化與磷循環(huán)的過程[34-35],且能夠影響無機碳的固定[36]。

在屬水平,弧菌屬是我們重點關注的對象,研究發(fā)現(xiàn)2019年6月的弧菌屬比例在養(yǎng)殖區(qū)處在最高點,弧菌多樣性也處于較高值,說明單一弧菌種的數(shù)量較低,且細菌細胞數(shù)量也較低,因此患病的幾率大幅降低。2019年7月弧菌的相對比例較高,細菌總數(shù)下降,弧菌多樣性降低,因此單一弧菌種數(shù)量增加。2019年7月、8月和9月處于高溫時期,適宜弧菌的快速繁殖,同時會降低扇貝的活性。因此該時期易爆發(fā)弧菌病。2019年9月份雖然弧菌屬占比不高,但是細胞總數(shù)處于峰值,且細菌多樣性增大而弧菌多樣性減少。因此2019年9月相較于其他高溫月份(2019年7月和8月)更具有爆發(fā)弧菌病的條件。鄧歡等[37]也曾報道過在2019年9月份大連爆發(fā)了扇貝弧菌病,造成了扇貝群體突發(fā)性死亡。

對各區(qū)不同月份的樣品及密、疏、對照區(qū)的樣品進行優(yōu)勢門的組間差異顯著性檢驗分析,發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖活動對海水中菌群優(yōu)勢門的影響不大,組間沒有明顯差異,表明從養(yǎng)殖區(qū)到海區(qū),浮游細菌群落優(yōu)勢門季節(jié)變化大于空間尺度差異。Lü 等[38]研究表明黃河三角洲演替潮灘的細菌群落結構存在季節(jié)性差異。而MA等[39]認為黃海沿岸由于河口的存在,從河流到深海,浮游細菌群落的空間變化大于季節(jié)尺度。

3.2 環(huán)境因子相關性分析

環(huán)境因子對微生物群落結構的影響一直是學者們關注的熱點。不同的地理位置、環(huán)境因子與海域浮游細菌的群落結構組成之間會進行相互作用。在黃海沿岸,鹽度是導致微生物群落結構向河流、河口兩部分空間分化的主要因素[39]。而在黃河三角洲附近,溫度和亞硝酸鹽構成菌群結構季節(jié)變化的主要驅動力[38]。王彩霞等[9]對渤海三灣環(huán)境因子與菌群結構進行Heatmap相關性分析得出,溫度、磷酸鹽、硝酸鹽和銨鹽與門水平上物種分布有顯著正相關關系(P＜0.01),而溶解氧、緯度和鹽度與門水平上物種組成有明顯的負相關關系(P＜0.05)。養(yǎng)殖活動是否會影響環(huán)境因子與近海細菌群落結構的相互作用,大家鮮少關注。通過對環(huán)境因子與菌群結構的Heatmap相關性分析,我們發(fā)現(xiàn)對照區(qū)與養(yǎng)殖區(qū)所呈現(xiàn)的相關性結果之間還是有明顯的差異。在門水平上,養(yǎng)殖區(qū)與對照區(qū)的相同的菌群所受到的不同環(huán)境因子影響,不但表現(xiàn)在相關性的程度上,甚至還改變了其作用方向,例如疣微菌門,在養(yǎng)密區(qū)與硝酸鹽呈現(xiàn)負相關關系,而在對照區(qū)與其呈現(xiàn)微弱的正相關關系。綠彎菌門在養(yǎng)殖密區(qū)與溫度(Spearman相關系數(shù)r=0.636,P＜0.01)呈現(xiàn)顯著正相關關系,養(yǎng)殖疏區(qū)與溫度(Spearman相關系數(shù)r=0.678,P＜0.01)呈現(xiàn)顯著正相關關系,而在對照區(qū)綠彎菌門與溫度(Spearman相關系數(shù)r=0.555,P＜0.05)的相關性區(qū)域性降低。綠彎菌門在海洋生態(tài)系統(tǒng)中參與光合作用的過程,利用3-羥基丙酸途徑來固定二氧化碳,養(yǎng)殖區(qū)中的綠彎菌門更易受溫度升高而增加,加強光合作用,釋放更多的溶解氧,而扇貝是高耗氧生物,集聚性養(yǎng)殖會消耗大量溶解氧,綠灣菌門在養(yǎng)殖區(qū)與對照區(qū)中的相關性差異結果也證實養(yǎng)殖活動會影響環(huán)境因子與菌落結構的相關程度,這與先前的研究結果一致[10]。研究近海養(yǎng)殖區(qū)海域微生物群落結構多樣性和環(huán)境因子相關性為保護近海養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展以及扇貝健康養(yǎng)殖提供了更好的理論基礎。

4 結論

本文利用細胞流式儀和高通量測序技術,對青島嶗山灣近海扇貝養(yǎng)殖水樣進行多層次的分析,集中分析扇貝高發(fā)病月份的細菌群落變化情況,并綜合考慮環(huán)境因子的變化,對樣品菌群結構與環(huán)境因子相關性進行了分析,得到的結論如下:

1)青島嶗山灣近海扇貝養(yǎng)殖水樣中的優(yōu)勢菌門為變形菌門,其中,γ-變形菌綱在群落菌門中占據(jù)主導地位,養(yǎng)殖區(qū)γ-變形菌綱豐度占比高于對照區(qū),由于γ-變形菌綱中含有多種致病菌,豐度占比增長的同時也增加了養(yǎng)殖區(qū)扇貝感染流行病的潛在風險。9月處于高溫時期,細菌總數(shù)增大,養(yǎng)殖區(qū)的細胞多樣性上升且弧菌多樣性指數(shù)降低,使得扇貝在9月爆發(fā)弧菌病的可能性驟增。

2)在該近海區(qū),養(yǎng)殖活動對海水細菌群落結構的影響主要以季節(jié)變化為主,在門水平上,濁度對養(yǎng)殖密區(qū)的菌群結構具有顯著影響,DO 對對照區(qū)的菌群結構具有顯著影響。

3)養(yǎng)殖活動不僅影響了環(huán)境因子與菌群結構相關性的程度,甚至還會改變其相互作用的方向。

研究結果表明,青島嶗山灣近海扇貝養(yǎng)殖活動影響了正常的近海菌落的結構分布,集聚式養(yǎng)殖不同程度上增加了某些病原菌的豐度,增加了該區(qū)近海生物疾病爆發(fā)的風險,因此在近海養(yǎng)殖活動中要做到合理布局、科學喂養(yǎng)、適當降低養(yǎng)殖密度,這些措施對降低養(yǎng)殖活動對菌落結構多樣性的影響具有重要意義。本文的研究結果可為實現(xiàn)近?？茖W養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。