作物根系活力檢測方法改進與優(yōu)化

周歡 劉昌森 周辰炎 范良苗 唐凡 胡欣朦 王佩玉 徐建明 楊文杰

摘要：通過試驗條件的優(yōu)化，建立一種植物根系活力的批量快速檢測方法。以小麥、黃瓜以及玉米根系為試驗材料，針對乙酸乙酯-甲醇混合液配比、浸提溫度及浸提時間3個因素設(shè)計正交試驗，優(yōu)化根系活力的檢測條件。結(jié)果表明，在試驗影響因素中，影響程度從大到小依次為浸提溫度>乙酸乙酯-甲醇混合液配比>浸提時間。浸提液中乙酸乙酯與甲醇的比例為2 ∶1，浸提溫度為60 ℃，浸提時間為20 min，三苯基甲臜提取率最高。本研究提出的植物根系活力的最佳浸提方案，具有三苯基甲臜的浸出效率高、重現(xiàn)性好、操作簡便等特點，此法更適合批量樣本根系活力的快速檢測。

關(guān)鍵詞：根系活力;氯化三苯基四氮唑法;三苯基甲臜提取率;快速熱浸提法;正交試驗

中圖分類號：S311 ??文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）09-0191-04

植物根系十分龐大，能夠適應(yīng)自然而不斷進化發(fā)展，不但具有吸收水分和無機鹽及固定植株的功能，而且對輸導(dǎo)、合成、儲藏和轉(zhuǎn)化多種有機物質(zhì)有關(guān)鍵的作用[1]。根系活力是一個表征植物根系的重要生理參數(shù)[2]，能夠表明植物根系的吸收與合成能力，其強弱是制約作物生長發(fā)育、產(chǎn)量形成以及肥料利用率等生理指標(biāo)的關(guān)鍵因素[3]。因此，建立一種快速、簡便的根系活力檢測方法，對于大批量樣本根系活力的快速檢測具有較為重要的實踐意義。目前，根系活力的檢測有多種方法，比如氯化三苯基四氮唑法[4]、α-奈胺法[5]、根系傷流法[3]、甲烯藍(lán)法[6]等。對比之下，氯化三苯基四氮唑法檢測根系活力具有快速簡便、結(jié)果準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好等特點，由此得到最為廣泛的應(yīng)用[7]。對于傳統(tǒng)的研磨法，由于需要研磨、沖洗、過濾、定容等步驟，操作較為繁瑣，耗時較長，不利于大批量樣本根系活力的檢測。同時，由于研磨、過濾等環(huán)節(jié)，往往導(dǎo)致三苯基甲臜的損失，致使樣本中三苯基甲臜的提取率降低，從而影響試驗結(jié)果的可靠性。此外，對于已報道的浸提法，雖然避免了傳統(tǒng)研磨法操作繁瑣、提取率較低的缺點，但三苯基甲臜的提取過程一般需要4～6 h或更長的時間，而且單一的甲醇或二甲基亞砜提取液對三苯基甲臜的提取效率尚不令人滿意。因此，有必要對植物根系活力檢測方案進行進一步的優(yōu)化和改進，以期獲得更高效、更便捷的根系活力檢測方法。針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，針對浸提液配比、浸提溫度及浸提時間3個影響因素，通過正交試驗優(yōu)化根系活力的檢測條件，建立一種簡便高效的植物根系活力的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

小麥品種淮麥33、黃瓜品種津研4號及玉米品種蘇玉31均由江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。所有試劑均為國藥分析純。主要儀器：TU-1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同浸提液對三苯基甲臜提取率的比較 分別稱取小麥、黃瓜及玉米的根尖樣品0.5 g，清洗干凈并吸干表面水分，利用氯化三苯基四氮唑方法[8-9]檢測各樣品材料的根系活力，三苯基甲臜的提取分別以甲醇、二甲基亞砜、乙酸乙酯及乙酸乙酯-甲醇混合液（體積比1 ∶1）為浸提液，37 ℃浸提6 h，并分別以不同樣品及相應(yīng)浸提液充分提?。ǜ鈽悠纷?yōu)榘咨┑娜交着H的含量作為對照。

1.2.2 正交試驗設(shè)計 采用L 9（34）正交試驗，以小麥、黃瓜以及玉米根系為試驗材料，優(yōu)化浸提方案，具體因素水平見表1。將混合液配比（A）、浸提溫度（B）、浸提時間（C）3個因素分為9組，每組重復(fù)3次。

1.2.3 三苯基甲臜的提取 第1步：繪制氯化三苯基四氮唑標(biāo)準(zhǔn)曲線。首先，取0.4% 氯化三苯基四氮唑溶液0.2 mL，并放入少許保險粉置于容量瓶中，充分搖勻后可產(chǎn)生紅色且不溶于水的三苯基甲臜，然后用乙酸乙酯進行定容至10 mL。其次，找5個不同的10 mL容量瓶，并取上述溶液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL放置其中，用乙酸乙酯進行定容得到標(biāo)準(zhǔn)液，其三苯基甲臜含量分別為25、50、100、150、200 μg。最后，以空白為對照，記錄485 nm波長下的吸光度（D 485 nm），繪制氯化三苯基四氮唑標(biāo)準(zhǔn)曲線。橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)液中的三苯基甲臜含量，縱坐標(biāo)為吸光度。

第2步：根系處理。稱取根尖樣本0.5 g，沖洗干凈后用吸水紙吸干根尖樣本表面的水分。然后將5 mL 0.4% 氯化三苯基四氮唑溶液和5 mL 1/15 mol/L 磷酸緩沖液（pH值7.0）置于10 mL小燒杯中，使樣本在37 ℃恒溫箱、暗處理條件下充分反應(yīng)，1 h后立即加入1 mol/L硫酸2 mL，終止反應(yīng)。上述操作重復(fù)進行5次?？瞻讓φ战M，除先加入 1 mol/L 硫酸2 mL，后加入根系以外，其他操作步驟與上述相同。

第3步：快速熱浸提。將已顯色的根系分別轉(zhuǎn)入盛有甲醇、二甲基亞砜、乙酸乙酯及乙酸乙酯-甲醇混合液（體積比1 ∶1）的10 mL刻度試管中。將上述刻度試管置于37 ℃水浴鍋中浸提6 h后，用與之相對應(yīng)的浸提液再次定容。

第4步：數(shù)據(jù)整理。以空白試驗為對照，485 nm波長下檢測吸光度，根據(jù)上述所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入線性回歸方程，計算出氯化三苯基四氮唑的還原量（mg）。再根據(jù)公式：氯化三苯基四氮唑還原強度[mg/（g·h）]=氯化三苯基四氮唑還原量（mg）/[根鮮質(zhì)量（g）×?xí)r間（h）]，求出其氯化三苯基四氮唑還原強度。與空白試驗相比，求出不同浸提液對三苯基甲臜的提取率。然后，針對乙酸乙酯-甲醇混合液配比、浸提溫度及浸提時間3個因素設(shè)計正交試驗（表1），優(yōu)化浸提最佳方案。最后，采用最佳浸提方案比較甲醇、二甲基亞砜、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇混合液的提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同浸提液中三苯基甲臜吸收光譜的比較

分別對甲醇、二甲基亞砜、乙酸乙酯及乙酸乙酯-甲醇混合液等4種不同試劑的三苯基甲臜溶液，在400～600 nm的波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，獲得并比較4種浸提液的吸收光譜曲線（圖1）。從各浸提液的吸收光譜可見，以上試驗所用各溶劑的吸收光譜的最大吸收峰均在485 nm。因此，可以通過分光光度法在波長485 nm下對以上各浸提液的三苯基甲臜溶液進行比色測定。

2.2 不同浸提液的三苯基甲臜提取率比較

由表2可知，在小麥和黃瓜供試根系樣本中，二甲基亞砜對三苯基甲臜提取率均顯著高于甲醇（P<0.05）。在玉米供試根系樣本中，二甲基亞砜對三苯基甲臜提取率顯著高于乙酸乙酯（P<0.05）。而乙酸乙酯-甲醇混合液對3種供試根系樣本的三苯基甲臜提取率均顯著高于其他單一浸提液（P<0.05）。

2.3 正交設(shè)計試驗結(jié)果

由表3可以看出，B因素極差最大，其次為A因素和C因素。由正交設(shè)計方差分析（表4）可知，A因素、B因素和C因素的不同水平之間差異極顯著（P<0.01）。結(jié)合表3和表4可知，3個因素對三苯基甲臜的提取率均有顯著影響，其影響程度順序從大到小依次為B>A>C，主要因素B取最好的水平3，而其他因素則根據(jù)時間、成本等方面綜合考慮選取適當(dāng)水平。由此得到最佳浸提方案組合為A 2B 3C 2，即浸提液混合配比為2 ∶1、浸提溫度為 60 ℃、浸提時間為20 min，此時三苯基甲臜提取效果最佳。

2.4 最佳浸提方案下不同浸提液對三苯基甲臜提取率的比較

在最佳浸提方案處理下，進一步對混合浸提液與單一浸提液對三苯基甲臜的提取率進行了比較研究，結(jié)果顯示，乙酸乙酯-甲醇混合液提取三苯基甲臜的效果極顯著優(yōu)于單一浸提液（P<0.01）（表5）。

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)的乙酸乙酯研磨法是一種廣泛應(yīng)用于科研和教學(xué)試驗的根系活力檢測方法[4]，但此法操作環(huán)節(jié)多且繁瑣，耗時較長，同時，研磨、過濾等環(huán)節(jié)又極易造成試驗誤差，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果的偏離。研究表明，利用有機溶劑浸泡處理過的根尖樣本，對三苯基甲臜提取顯示出了較大的優(yōu)勢[10]。在此基礎(chǔ)上，前人對2-甲氧乙醇、乙酸乙酯、甲醇及二甲基亞砜等不同試劑的浸提效果進行了比較研究[8-10]。本試驗從2020年6月開始，在江蘇省淮安市丁集鎮(zhèn)和袁集鄉(xiāng)開展田間試驗，2021年4月正式結(jié)束。研究結(jié)果顯示，乙酸乙酯-甲醇混合液的浸提效果顯著優(yōu)于單一的浸提液。究其原因，可能是由于甲醇較強的組織細(xì)胞穿透力與乙酸乙酯較高的三苯基甲臜溶解度的有機結(jié)合和協(xié)同作用，顯著提高了樣本中三苯基甲臜的溶出率。

雖然浸提法較好地避免了傳統(tǒng)研磨法中繁瑣的操作環(huán)節(jié)，但浸提時間一般都在6 h以上，檢測效率不夠理想，這一缺陷在大批量樣本根系活力的檢測中表現(xiàn)的更為突出。由于三苯基甲臜較為穩(wěn)定，因此，在一定范圍內(nèi)提高浸提的溫度，可以加快對三苯基甲臜的提取[11]。本研究利用正交設(shè)計對乙酸乙酯-甲醇混合液浸提法檢測根系活力的條件進行了優(yōu)化，通過小麥、黃瓜和玉米等試驗材料的比較研究，建立了一種根系活力的快速熱浸提法，此法具有高效快速、重現(xiàn)性好、操作簡便等優(yōu)點，更利于大批量樣本根系活力的檢測。這對于根系活力的相關(guān)研究及教學(xué)試驗的開展都具有非常重要的作用[2]。但其可靠性尚需在更為廣泛的科研實踐中加以驗證。此外，本試驗只針對乙酸乙酯-甲醇混合液進行了浸提條件的優(yōu)化研究，其他混合浸提液對三苯基甲臜的浸提效果尚有待進一步探究。

為了優(yōu)化浸提法根系活力的檢測條件，首先，通過4種浸提液對三苯基甲臜提取效率的比較研究顯示，乙酸乙酯-甲醇混合液提取率最高。在此基礎(chǔ)上，利用正交試驗設(shè)計，進一步針對混合液配比、浸提溫度及浸提時間3個影響因素對浸提方案進行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，以上3個因素對根系三苯基甲臜的提取均有極顯著影響（P<0.01），而且在乙酸乙酯-甲醇混合液配比為2 ∶1、浸提溫度為60 ℃的條件下浸提20 min時，三苯基甲臜提取率最高。由此，建立了一種快速熱浸提方法，以克服無法進行大批量樣本檢測的缺點。

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