耐鹽溶磷菌YJC19的鑒定及不同培養(yǎng)條件對(duì)其溶磷效果的影響

譚海霞 李麗艷 王連龍 彭紅麗 杜迎輝 孫杉杉

摘要：對(duì)前期從鹽堿土壤中篩選到的1株溶磷菌株YJC19進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，探討分析菌株的耐鹽特性及不同培養(yǎng)條件對(duì)其溶磷能力的影響，以期為其在鹽堿地改良中的應(yīng)用提供理論參考，為進(jìn)一步開發(fā)耐鹽溶磷微生物菌肥提供種質(zhì)資源。通過(guò)形態(tài)觀察和系統(tǒng)發(fā)育樹分析對(duì)溶磷菌株進(jìn)行鑒定，通過(guò)不同鹽濃度PDA培養(yǎng)基對(duì)菌株生長(zhǎng)影響判斷其耐鹽特性，采用鉬銻抗比色法測(cè)定菌株YJC19在不同磷源[Ca 3（PO 4） 2、AlPO 4、FePO 4]、鹽濃度（0、2.5%、5.5%、7.5%）、初始pH值（5.5、6.5、7.5、8.5）液體培養(yǎng)條件下的溶磷量。結(jié)果表明，菌株YJC19鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger），可耐受鹽濃度高達(dá)15.0%，在鹽濃度為0～7.5%培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。菌株YJC19具有較強(qiáng)的溶磷能力，對(duì)磷酸鈣的溶解能力遠(yuǎn)大于磷酸鋁和磷酸鐵，溶磷量為1 741.59 mg/L;隨著鹽濃度的提高，菌株YJC19溶磷能力降低，2.5%鹽濃度處理組的溶磷量與無(wú)鹽對(duì)照組差異不顯著。菌株YJC19在pH值5.5～8.5范圍內(nèi)均可正常生長(zhǎng)，初始pH值為6.5時(shí)其溶磷量最高。不同環(huán)境條件的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)中，溶磷量與pH值均呈顯著負(fù)相關(guān)，初步判斷菌株YJC19溶磷機(jī)制為酸溶磷。菌株YJC19是1株耐鹽堿性較強(qiáng)的高效溶磷真菌，為其應(yīng)用于鹽堿土改良提供了保證，可為北方鹽堿土壤修復(fù)改良提供優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，具有良好的開發(fā)與應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：黑曲霉;耐鹽溶磷菌;溶磷能力;培養(yǎng)條件;相關(guān)性分析

中圖分類號(hào)：X171.4 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）09-0235-05

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，磷肥施入土壤，約有80%的磷被土壤中鋁、鐵、鈣等陽(yáng)離子吸附固定，導(dǎo)致土壤中有效磷含量較低，磷已成為影響植物產(chǎn)量的養(yǎng)分限制因素之一[1]。化肥過(guò)量施用不利于農(nóng)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展，研究表明，溶磷微生物可以活化土壤中的不溶性磷，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)，利用微生物提高土壤中磷的利用率已成為目前研究的熱點(diǎn)[2-3]。目前已報(bào)道的多數(shù)溶磷菌都不耐鹽堿，在高鹽堿環(huán)境中溶磷能力有限，不適合在鹽堿地施用。鹽堿地的改良修復(fù)是亟需解決的問題，利用微生物改良鹽堿土壤既節(jié)本增效，又可促進(jìn)農(nóng)業(yè)環(huán)境生態(tài)健康發(fā)展。本試驗(yàn)從河北濱海鹽生植物根際土壤中篩選獲得了1株高效溶磷耐鹽真菌，對(duì)其耐鹽能力及在不同培養(yǎng)環(huán)境溶磷特性進(jìn)行初步分析，以期豐富鹽堿地改良菌種資源庫(kù)，為在鹽堿地實(shí)際應(yīng)用中提高鹽漬土不溶性磷的利用效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗(yàn)于2021年3—5月在河北省農(nóng)業(yè)生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。試驗(yàn)菌株：解磷真菌YJC19（由領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司微生物實(shí)驗(yàn)室從曹妃甸鹽地堿蓬根際土壤中篩選分離得到）。

1.2 培養(yǎng)基

含鹽PDA培養(yǎng)基：以馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基[4]為基礎(chǔ)，分別添加0、2.5%、5.5%、7.5%、10.0%、15.0% NaCl。

含鹽無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基：在解磷液體培養(yǎng)基[5]的基礎(chǔ)上添加2.5%、5.5%、7.5% NaCl。

1.3 溶磷菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 參照文獻(xiàn)[6-7]，對(duì)溶磷菌株 YJC19的菌落和分生孢子進(jìn)行觀察及鑒定。

1.3.2 菌株分子鑒定 參考文獻(xiàn)[8]對(duì)溶磷菌株 YJC19進(jìn)行基因組DNA提取并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。將測(cè)序得到的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列在 NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中使用BLAST比對(duì)后，使用MEGA 6.0軟件Clus-tral W 進(jìn)行聚類分析，以 Neighbour-Joining 法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合形態(tài)鑒定，確定各菌株的親緣關(guān)系及分類地位。

1.4 溶磷菌株YJC19耐鹽能力探究

參考文獻(xiàn)[9]測(cè)定菌株YJC19的耐鹽能力，用接種環(huán)挑取菌株YJC19的菌絲1環(huán)于含鹽PDA固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

1.5 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株YJC19溶磷能力的影響

分別改變?cè)袩o(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中磷源[Ca 3（PO 4） 2、AlPO 4、FePO 4]、鹽濃度（2.5%、5.5%、7.5%）、初始pH值（5.5、6.5、7.5、8.5）等，在 100 mL 無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中接種108 CFU/mL菌株YJC19孢子懸液1 mL，28 ℃、180 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng) 5 d[10]，每隔24 h取2 mL發(fā)酵液，測(cè)定上清液中有效磷的含量和pH值，以不接菌種處理為對(duì)照。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、SPSS 25、Origin 8.0和MEGA 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌株YJC19分類學(xué)鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)特征 菌株YJC19的菌落顏色先呈黃白后變黑。分生孢子梗長(zhǎng)度不同，分生孢子頭呈放射狀，黑褐色，分生孢子呈褐色，球形。將純化的菌株YJC19接種到無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基中，觀察菌株的溶磷效果，如圖1所示，培養(yǎng)5 d后，菌株YJC19周圍的Ca 3（PO 4） 2已經(jīng)明顯被溶解并形成了透明的溶磷圈。

2.1.2 菌株分子鑒定 利用ITS通用引物ITS1和ITS4有效擴(kuò)增出603 bp的片段。測(cè)序結(jié)果在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov上進(jìn)行比較。利用BLAST軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出，菌株YJC19與已報(bào)道的黑曲霉（Aspergillus niger）在分類學(xué)生態(tài)學(xué)中親緣關(guān)系最密切，同源性較高。結(jié)合形態(tài)分析鑒定菌株YJC19為黑曲霉（A. niger） YJC19。

2.2 溶磷菌株YJC19的耐鹽能力

培養(yǎng)7 d后，與對(duì)照組（無(wú)鹽培養(yǎng)基）相比，鹽含量為15.0%的培養(yǎng)基中，菌株YJC19有被抑制的趨勢(shì)，長(zhǎng)勢(shì)較弱;鹽含量為10.0%時(shí)，菌株可生長(zhǎng)。可見，菌株YJC19可耐受高達(dá)15.0%的NaCl（表1）。目前研究的耐鹽解磷菌主要為江紅梅等篩選得到的草酸青霉M2，最高可耐受7%的鹽濃度[4];范延輝等篩選的草酸青霉PSF2最高可耐受鹽濃度閾值為12.5%[11];而本研究中菌株YJC19可耐受高達(dá)15.0%的鹽濃度。菌株YJC19生長(zhǎng)能力隨鹽脅迫的增加而降低，其原因可能是高鹽濃度下細(xì)胞內(nèi)Na+濃度較低，以此來(lái)免受毒害[12]，大量的能量用來(lái)調(diào)整自身的代謝途徑以及適應(yīng)環(huán)境，用于生長(zhǎng)繁殖的能量相對(duì)減少，所以自身生長(zhǎng)受到影響。

2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)其溶磷效果的影響

2.3.1 不同磷源對(duì)菌株YJC19溶磷能力的影響 由圖3可知，菌株YJC19對(duì)3種磷酸鹽的溶解能力總體表現(xiàn)為Ca 3（PO 4） 2>FePO 4>AlPO 4。培養(yǎng) 144 h，3種磷化合物培養(yǎng)液中有效磷含量均呈先升后降再趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。以Ca 3（PO 4）為磷源時(shí)，培養(yǎng)液中有效磷含量在48～72 h內(nèi)快速增加，96 h時(shí)達(dá)到峰值（1 741.59 mg/L），此后平緩減少，同一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)它的有效磷含量顯著高于其他2種磷源。磷源為AlPO 4時(shí)，在72 h時(shí)有效磷含量最高（403.33 mg/L）;磷源為FePO 4時(shí)，在96 h時(shí)有效磷含量最高（693.75 mg/L）。

2.3.2 不同NaCl濃度對(duì)菌株YJC19溶磷能力的影響 在不同鹽濃度的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，菌株YJC19對(duì)磷酸三鈣的溶解能力存在顯著差異（P<0.05），總體表現(xiàn)為隨著鹽濃度的提高，菌株YJC19的溶磷能力降低。鹽濃度為2.5%時(shí)，菌株YJC19溶磷能力僅次于對(duì)照組;鹽濃度為7.5%時(shí)，溶磷能力最差。144 h培養(yǎng)期間，菌株YJC19對(duì)磷酸鈣的溶磷量變化如圖4所示，不同鹽濃度對(duì)菌株YJC19溶磷能力的影響基本表現(xiàn)一致，溶磷量達(dá)到峰值的培養(yǎng)時(shí)間不同，鹽濃度為2.5%和5.0%時(shí)溶磷量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸提高而后下降。鹽濃度為2.5%時(shí)，前120 h溶磷量逐漸增加，120 h時(shí)達(dá)到峰值（1 719.48 mg/L）;鹽濃度為5.0%時(shí)，96 h溶磷量達(dá)到峰值（790.83 mg/L）;鹽濃度為7.5%時(shí)，溶磷量變化曲線呈“S”形，72 h時(shí)溶磷量達(dá)到峰值（497.08 mg/L），隨后溶磷量略有降低再升高后趨于平穩(wěn)趨勢(shì)。

2.3.3 不同初始pH值對(duì)菌株YJC19溶磷能力的影響 如圖5顯示，菌株YJC19在pH值5.5～8.5范圍內(nèi)均可正常生長(zhǎng)，但溶磷特性不同，處理組間差異極顯著（P<0.01）。各處理組溶磷量出現(xiàn)峰值的時(shí)間不同，溶磷量峰值排序?yàn)?.5>7.5> 5.5>8.5。初始pH值為6.5時(shí)，溶磷量峰值達(dá)到 1 741.71 mg/L，分別比pH值為5.5、7.5、8.5處理組增加29.45%、9.38%、46.26%，表明培養(yǎng)菌株YJC19的培養(yǎng)基最適初始pH值為6.5。

2.4 菌株YJC19溶磷能力與pH值的關(guān)系

將菌株YJC19接種到不同環(huán)境條件的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，總體來(lái)看，培養(yǎng)液的 pH值在培養(yǎng)144 h內(nèi)均逐漸降低，在48～72 h迅速降低，均在120 h后逐漸平緩（圖6）。不同磷源[Ca 3（PO 4） 2、AlPO 4、FePO 4）培養(yǎng)液在144 h內(nèi)溶液pH值從7.0分別下降到2.33、3.96、3.02;不同鹽濃度（2.5%、5.5%、7.5%）培養(yǎng)液在144 h內(nèi)溶液pH值從7.0分別下降到2.65、3.56、3.98;不同初始pH值（5.5、6.5、7.5、8.5）培養(yǎng)液在144 h內(nèi)溶液pH值分別下降到2.21、2.48、2.75、3.61。培養(yǎng)液pH值變化范圍在2.0～8.5之間，在此范圍內(nèi)菌株均能正常生長(zhǎng)，這表明菌株YJC19具有廣泛的酸堿適應(yīng)性。

對(duì)溶磷量與pH值數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，不同環(huán)境的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)液中溶磷量與pH值兩者均呈負(fù)相關(guān)（圖7）。菌株YJC19在難溶磷源[Ca 3（PO 4） 2、AlPO 4、FePO 4]培養(yǎng)液中的溶磷量與pH值的相關(guān)系數(shù)分別為-0.886 （P<0.05）、-0.815 （P<0.05）、-0.903 （P<0.05）;不同鹽濃度（2.5%、5.5%、7.5%）培養(yǎng)液中的溶磷量與pH值的相關(guān)系數(shù)分別為-0.976 （P<0.01）、-0.952 （P<0.01）、-0.829 （P<0.05）;不同初始pH值（5.5、6.5、7.5、8.5）培養(yǎng)液中的溶磷量與pH值的相關(guān)系數(shù)分別為-0.894 （P<0.05）、-0.812 （P<0.05）、-0.818 （P<0.05）、-0.978 （P<0.01）。這可能是因?yàn)閅JC19菌體適應(yīng)環(huán)境后，不斷產(chǎn)生釋放酸性代謝產(chǎn)物，隨著溶磷量的增加，培養(yǎng)液pH值下降，這表明將菌株YJC19作為微生物菌劑應(yīng)用于鹽堿土中，不僅能增加鹽堿土中可溶磷的含量，也可以改善鹽堿土的酸堿環(huán)境。

3 結(jié)論與討論

研究表明，溶磷真菌比溶磷細(xì)菌具有更高的溶磷能力[13]，從高鹽環(huán)境中篩選分離得到的溶磷真菌主要局限于青霉屬（Penicillium）[14]、曲霉屬（Aspergillus）[15-16]等。本研究所用的菌株是1株從鹽地堿蓬根際土中分離得到的溶磷真菌，鑒定為黑曲霉（A. niger），命名為YJC19。

研究表明，隨著外界環(huán)境或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化，溶磷菌的生長(zhǎng)代謝會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致菌株溶磷能力有明顯差異[14，17]。在不同環(huán)境下菌株YJC19均具有溶磷能力，但溶磷效果有顯著差異，它對(duì)磷酸鈣（1 741.59 mg/L）的溶解能力顯著高于磷酸鐵（693.75 mg/L）和磷酸鋁（403.33 mg/L），這與相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)論[18-20]一致。但與劉文干等的結(jié)論[21]不一致，其從紅壤中篩選的黑曲霉菌株B1-A對(duì)磷酸鹽溶磷能力排序?yàn)锳lPO 4>Ca 3（PO 4） 2>FePO 4，這可能是由于北方鹽堿土壤中難溶磷的主要形態(tài)為磷酸鈣，強(qiáng)酸性紅壤中以磷酸鋁鐵形態(tài)存在，微生物對(duì)土壤環(huán)境表現(xiàn)出高度的生理響應(yīng)特性，進(jìn)而不同菌株的溶磷機(jī)制不同，因此篩選土著溶磷菌具有重要意義。經(jīng)過(guò)對(duì)菌株YJC19在不同NaCl濃度下的耐鹽性和溶磷能力分析得知，菌株YJC19在 0～7.5% NaCl濃度范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，溶磷量隨著NaCl濃度的增加而減少。2.5%鹽濃度處理組與無(wú)鹽對(duì)照組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明該菌有較強(qiáng)的耐鹽性，為其在鹽堿化土壤中的生長(zhǎng)定殖提供了基本保障，提高鹽堿地磷素利用率潛力巨大，但鹽堿化程度高的土壤中該菌的溶磷能力降低。

pH值會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)和代謝。微生物溶解磷的方式多種多樣，一般認(rèn)為有機(jī)酸分泌是微生物溶解磷的主要途徑[1]。王呈玉等研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉菌株An510的溶磷能力可能來(lái)自于有機(jī)酸的產(chǎn)生，發(fā)酵液中有機(jī)酸的含量和種類隨培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基質(zhì)的不同而變化[8]。劉曉芳等研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉菌株ML4發(fā)酵液中含有多種有機(jī)酸[22]。本試驗(yàn)中菌株YJC19在初始pH值為5.5～8.5的培養(yǎng)液中均可正常生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中可溶磷含量基本表現(xiàn)為先升后降再趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，pH 值在培養(yǎng) 7 d內(nèi)呈下降趨勢(shì)，不同環(huán)境的無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)中溶磷量與pH值均呈顯著負(fù)相關(guān)，因此推測(cè)菌株YJC19的溶磷能力主要源自其分泌的有機(jī)酸物質(zhì)，也可能與菌株代謝有關(guān)，其溶磷機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

鹽堿地改良是急需解決的問題，微生物改良鹽堿地是一種環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、高效的生物措施。本研究中的溶磷黑曲霉菌株YJC19兼具較強(qiáng)的耐鹽性和溶磷能力，最高溶磷量可達(dá)1 741.59 mg/L，為其應(yīng)用于鹽堿土壤改良提供了保證，具有良好的開發(fā)與應(yīng)用潛力。

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