杜梨砧木組培擴(kuò)繁技術(shù)研究*

楊冠宇，王 斐，張艷杰，馬 力，李佳純，歐春青，姜淑苓

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧興城 125100）

梨是一種世界性的水果，在我國(guó)水果產(chǎn)業(yè)中有著舉足輕重的地位，栽培面積和產(chǎn)量?jī)H次于柑橘和蘋果，位居第三[1]。隨著我國(guó)梨產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展以及環(huán)境和氣候條件的日益變化，砧木作為梨樹的重要組成部分，對(duì)梨樹生長(zhǎng)的影響越來(lái)越大。我國(guó)梨生產(chǎn)上常用的梨砧木主要有杜梨（Pyrus betulifoliaBunge）、豆梨（Pyrus calleryanaDecne）、山梨（Pyrus ussuriensisMaxim）、川梨（Pyrus pashiaBuch.-Ham.ex D.Don）和木梨（Pyrus xerophilaT.T.Yu）等[2]，其中杜梨具有抗干旱、耐寒、分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)、結(jié)果期早、壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)[3]，是應(yīng)用最廣泛的梨砧木之一。目前，生產(chǎn)中使用的杜梨砧木多為實(shí)生種子繁殖，種子來(lái)源各不相同，生產(chǎn)的苗木參差不齊，不利于現(xiàn)代化標(biāo)準(zhǔn)化梨園的建設(shè)。梨組織培養(yǎng)具有用材少、不受季節(jié)影響、繁殖系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)的苗木整齊一致，能滿足短期大規(guī)模生產(chǎn)需要[4]，并且可以加快育種進(jìn)程[5]，在梨無(wú)性系砧木生產(chǎn)和現(xiàn)代生物育種中具有重要作用。

目前，已有關(guān)于梨組培擴(kuò)繁研究的報(bào)道，李本波[6]探究了NAA 與6-BA 等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)杜梨繼代組培苗的影響，發(fā)現(xiàn)NAA 濃度在0.1～0.5 mg/L、6-BA 濃度在0.5～2.0 mg/L 時(shí)組培苗生長(zhǎng)狀況較好。盧明艷等[7]在對(duì)梨砧木優(yōu)系1-127 的研究中發(fā)現(xiàn)，組培苗適宜的增殖培養(yǎng)基為WPM＋2.0 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA。苗冉冉等[8]研究發(fā)現(xiàn)，津香蜜梨適宜的繼代增殖培養(yǎng)基為MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L NAA，增殖系數(shù)為5.73，巴梨適宜的繼代增殖培養(yǎng)基為MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L NAA，增殖系數(shù)為3.83。劉春等[9]在對(duì)京白梨的研究中發(fā)現(xiàn)，采用MS＋3 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L NAA＋1.5 mg/L GA3作為增殖培養(yǎng)基，可有效提高京白梨優(yōu)良單株組培快繁育苗效率。李昌珠等[10]用12個(gè)基因型的歐洲梨作為試材，研究表明梨的不同基因型間離體繁殖和形態(tài)分化顯著不同。在梨組織培養(yǎng)方面，還需加大對(duì)不同品種的研究范圍，建立多品種適宜的組織培養(yǎng)快繁體系。

由于杜梨為野生類型，不同株系的組培特性、抗性和適應(yīng)性等性狀各不相同，為進(jìn)一步豐富杜梨組培資源，篩選適宜的株系進(jìn)行砧木苗繁育和生物育種研究，本試驗(yàn)以不同來(lái)源的杜梨實(shí)生種子和新梢為外植體，開展不同消毒劑和消毒時(shí)間的消毒效果以及最佳繼代增殖和生根培養(yǎng)基的篩選研究，以期為我國(guó)梨砧木規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)支持，為梨遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。

不同杜梨砧木的組培擴(kuò)繁與生根移栽情況Tissue culture propagation,rooting and transplanting of different Pyrus betulifolia rootstocks

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采集于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所梨育種試驗(yàn)園保存的來(lái)自山西、河北、遼寧等不同地區(qū)收集的實(shí)生杜梨株系，樹齡均在10 年以上。其中，選取樹體健壯、新梢發(fā)育良好的株系11 個(gè)，于春季新梢剛剛長(zhǎng)至5～8 cm 時(shí)取田間幼嫩的新梢為外植體，于秋季采集21 個(gè)株系上健康成熟果實(shí)的種子為外植體，分別開展組培試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒與初代培養(yǎng)

將采回來(lái)的枝條剪成2～3 cm 的單芽莖段，種子經(jīng)層積處理，然后依次用洗衣粉上清液浸泡30 min，用清水清理干凈洗衣粉殘留，移至無(wú)菌環(huán)境，無(wú)菌水沖洗3 遍，75%酒精浸泡30 s，再分別用0.1%HgCl2溶液處理5、8、10、12 min 或5%NaClO 溶液處理5、8、10、15 min，無(wú)菌水沖洗3～5 遍，最后將清洗干凈的外植體用無(wú)菌濾紙吸干水分，接種到MS＋6.5 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖＋0.2 mg/L ZT＋0.15 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IAA＋0.1 mg/L IBA＋0.5 mg/L GA 的初代培養(yǎng)基上，置于25 ℃、光照16 h 黑暗8 h 光周期下培養(yǎng)。分別在上述試驗(yàn)材料中各選取4個(gè)株系的種子和莖段開展上述試驗(yàn)，每處理每個(gè)株系接種種子和莖段各5 粒（個(gè)），3 次重復(fù)。每隔3～5 d 觀察1 次，及時(shí)為有污染外植體瓶中的未被污染的外植體更換培養(yǎng)基，40 d 后統(tǒng)計(jì)污染率以及成活率，篩選出最佳的消毒方法和生長(zhǎng)良好的株系。其余株系的種子和莖段以篩選出來(lái)的最佳方案處理。

1.2.2 繼代培養(yǎng)

以初代培養(yǎng)獲得的2 個(gè)生長(zhǎng)較良好的株系為試材，分別在初代培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)置0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L的6-BA 梯度處理。每個(gè)處理接種3 瓶，每瓶接種5 個(gè)外植體，3 次重復(fù)。40 d 后調(diào)查外植體擴(kuò)繁梢數(shù)和幼苗高度，并計(jì)算增殖倍數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng)和移栽

生根試驗(yàn)采用一步生根法和兩步生根法[11]2 種方法。

（1）一步生根法。取長(zhǎng)勢(shì)良好的培養(yǎng)苗，切取長(zhǎng)度3～4 cm 的無(wú)根新莖，接種到分別添加0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L IBA 的1/2MS 生根培養(yǎng)基上。每個(gè)處理接種2 瓶，每瓶接種5 個(gè)外植體，3 次重復(fù)。30 d 后統(tǒng)計(jì)生根率和生根條數(shù)。

（2）兩步生根法。取長(zhǎng)勢(shì)良好的培養(yǎng)苗，切取長(zhǎng)度3～4 cm 的無(wú)根新莖，接種到分別添加2.0、3.0、4.0 mg/L IBA 的MS 生根培養(yǎng)基上，分別暗處理2、3、4、5 d，然后轉(zhuǎn)移至不添加任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2MS 培養(yǎng)基中。每處理接種3 瓶，每瓶接種3 個(gè)外植體，3 次重復(fù)。30 d 后統(tǒng)計(jì)生根率和生根條數(shù)。

當(dāng)試管苗根長(zhǎng)3～4 cm 時(shí)，打開瓶口進(jìn)行5 d的煉苗。然后清洗試管苗根部培養(yǎng)基，移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中，覆膜保濕，培養(yǎng)基質(zhì)為草炭土∶黏土＝1∶1。15 d 后，逐漸打開薄膜繼續(xù)培養(yǎng)，待緩苗后帶土移栽至田間。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)，用SPSS 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)杜梨不同外植體消毒效果的影響

2.1.1 不同消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)杜梨種子消毒效果的影響

杜梨砧木種子經(jīng)過滅菌后接種到初代培養(yǎng)基上，5 d 后出現(xiàn)不同程度的污染。如表1 所示，在2種不同的消毒劑處理下，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體的污染率均呈逐漸下降的趨勢(shì)，存活率均呈先上升后下降的趨勢(shì)。0.1%HgCl2處理10 min，雖然污染率（13.33%）略高于12 min 處理（10.00%），但外植體存活率最高（66.67%），消毒效果最好。5%NaClO 處理10 min 也具有較好的消毒效果，但存活率只有53.33%，低于0.1%HgCl2處理。綜合污染率和存活率，最適合杜梨種子外植體的消毒方式為0.1%HgCl2處理10 min。上述處理共獲得了14 份杜梨組培株系（圖版2-A），其中，株系7-4 長(zhǎng)勢(shì)良好，用于下一步的繼代增殖研究。

表1 不同消毒劑及消毒時(shí)間對(duì)杜梨種子消毒效果的影響

2.1.2 不同消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)杜梨砧木莖段消毒效果的影響

杜梨莖段經(jīng)過滅菌后接種到初代培養(yǎng)基上，3 d后出現(xiàn)污染，不同消毒時(shí)間和消毒劑處理下其污染率、存活率均有差異。如表2 所示，在2 種不同的消毒劑處理下，外植體的污染率和存活率也隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng)分別呈逐漸下降和先上升后下降的趨勢(shì)，2 種消毒劑分別在處理12 min 和15 min 時(shí)，污染率均降到了0，但存活率均較低。綜合考慮污染率和存活率，以5%NaClO 處理10 min 效果最好，外植體存活率可達(dá)77.78%。上述處理共獲得了7 份杜梨組培株系（圖版2-B），其中，株系11-2 長(zhǎng)勢(shì)較好，用于下一步的繼代增殖研究。

表2 不同消毒劑及消毒時(shí)間對(duì)杜梨莖段消毒效果的影響

2.2 不同濃度6-BA 對(duì)杜梨株系生長(zhǎng)和增殖的影響

2.2.1 不同濃度6-BA 對(duì)杜梨株系7-4 生長(zhǎng)和增殖的影響

由圖版2-C 和表3 可以看出，杜梨株系7-4 組培苗在6-BA 濃度較低時(shí)，增殖系數(shù)較低，但株高較高，其中，6-BA 濃度為0.15 mg/L 時(shí)，株高最高，且葉片較大，枝條更為粗壯，適合進(jìn)一步進(jìn)行移栽、生根、再生等試驗(yàn)。隨著6-BA 濃度的升高，7-4組培苗的增殖系數(shù)呈上升趨勢(shì)，但濃度過高，會(huì)產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象且株高降低。其中，在6-BA 濃度為2.5 mg/L 時(shí)，增殖系數(shù)最高，達(dá)到6.33，但是組培苗有玻璃化現(xiàn)象。因此，綜合考慮組培苗的生長(zhǎng)狀態(tài)，0.3～1.5 mg/L 的6-BA 濃度均可取得較好的增殖效果。

表3 不同濃度6-BA 對(duì)7-4 生長(zhǎng)和增殖的影響

2.2.2 不同濃度6-BA 對(duì)杜梨株系11-2 生長(zhǎng)和增殖的影響

如圖版2-D、表4 所示，杜梨株系11-2 組培苗在不同6-BA 濃度處理下，整體株高和增殖系數(shù)均低于株系7-4，說(shuō)明基因型對(duì)其組培苗的生長(zhǎng)影響較大。當(dāng)6-BA 濃度為0.1 mg/L 時(shí)，11-2 的株高最高，為2.32 cm，適合進(jìn)一步進(jìn)行移栽、生根、再生等試驗(yàn)。在各6-BA 濃度處理下，11-2 的增殖系數(shù)均較低，甚至不增殖，在濃度為2.0 mg/L 時(shí)，增殖系數(shù)最高，為1.88，此時(shí)的株高也較高，可作為株系11-2 增殖培養(yǎng)適宜的6-BA 濃度。

表4 不同濃度6-BA 對(duì)11-2 生長(zhǎng)和增殖的影響

2.3 不同方法和不同濃度IBA 處理對(duì)杜梨株系7-4 生根的影響

前期試驗(yàn)得出11-2 苗矮，生長(zhǎng)緩慢，不適宜進(jìn)行生根試驗(yàn)；杜梨株系7-4 組培苗生長(zhǎng)健壯，株高和繁殖系數(shù)均較高，對(duì)其進(jìn)行了生根培養(yǎng)試驗(yàn)。如表5 所示，不同方法和不同濃度的IBA 處理對(duì)杜梨株系7-4 的生根影響較大，其中，一步生根法中不同濃度IBA 處理均能誘導(dǎo)其生根，但低濃度下生根率較低，濃度在0.3 mg/L 以下時(shí)，生根率在5.00%以下，當(dāng)IBA 濃度增加到2.0 mg/L 時(shí)，其生根率達(dá)到最高，為85.00%，且顯著高于其他處理，此時(shí)的平均生根數(shù)為3.82 條，也是所有處理中最高的。兩步生根法中，前期IBA 處理天數(shù)對(duì)7-4 的生根影響較大，其中以4.0 mg/L IBA 處理3 d 效果最好，生根率（55.56%）和平均生根數(shù)（2.67 條）均較高，但低于一步生根法中的最佳濃度。因此，IBA 濃度為2.0 mg/L 的一步生根法最有利于杜梨株系7-4 的生根，將以此方法生根的7-4 組培苗進(jìn)行了移栽，移栽成活率在90%以上（圖版2-E）。

表5 不同生根方法對(duì)7-4 生根的影響

3 討論與結(jié)論

氯化汞是一種劇毒的重金屬消毒劑，次氯酸鈉是一種氧化還原消毒劑，常用于植物組織培養(yǎng)的外植體消毒，殺菌時(shí)間過長(zhǎng)，植物組織會(huì)中毒，生長(zhǎng)點(diǎn)會(huì)被殺死，進(jìn)而影響成活率；殺菌時(shí)間太短，將導(dǎo)致外源菌不能被完全殺死，增加污染率，合理的滅菌時(shí)間對(duì)于外植體的接種非常重要[12]。本研究中杜梨種子和幼嫩莖段分別以0.1%HgCl2消毒10 min和5%NaClO 消毒10 min 效果最好，這是由于種子具有種皮，而種皮較厚，可以使用更加強(qiáng)力的消毒劑，而莖段組織較為幼嫩，毒性過強(qiáng)的消毒劑在滅殺外源菌的同時(shí)，也提高了外植體的致死率，所以2 種外植體選用的最佳消毒劑有所不同。這與王瑩等[13]對(duì)耐鹽彩葉杜梨莖尖消毒試驗(yàn)的研究結(jié)果不同，其原因可能是選用的材料品種和試驗(yàn)部位不同。而本試驗(yàn)中種子材料采用5%NaClO 消毒10 min 也獲得了53.33%的外植體存活率，雖然低于HgCl2處理，從環(huán)保的角度來(lái)看，該消毒方法也是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素是影響試管苗器官形成的主要因素[14]。前人研究表明，同一品種在不同培養(yǎng)基上的表現(xiàn)不同，不同品種在同一培養(yǎng)條件下表現(xiàn)也有所不同[15]。本試驗(yàn)中杜梨砧木莖段的增殖分化與細(xì)胞分裂素6-BA 濃度有關(guān)，在一定濃度范圍內(nèi)，莖段的增殖系數(shù)隨著6-BA 濃度的升高而升高，但是當(dāng)6-BA 超過一定濃度后，組培苗的生長(zhǎng)狀態(tài)出現(xiàn)異常。對(duì)于杜梨株系7-4 而言，當(dāng)6-BA 濃度達(dá)到2.5 mg/L 時(shí)，組培苗開始出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，并且開始變矮，雖然增殖系數(shù)有所增高，但是苗的狀態(tài)已經(jīng)不利于進(jìn)一步的培養(yǎng)，植株纖細(xì)，有效莖少，多為簇狀的無(wú)效莖；當(dāng)6-BA 的濃度達(dá)到3.0 mg/L時(shí)，莖的增殖開始被抑制，增殖系數(shù)降低并且生成的無(wú)效莖多，不適宜進(jìn)行增殖；當(dāng)6-BA 的濃度為0.3、0.5、1.0、1.5 mg/L 時(shí)，其植株生長(zhǎng)正常，其增殖系數(shù)均在3.9 以上。因此，本試驗(yàn)中確定7-4 株系增殖培養(yǎng)的最佳6-BA 濃度為0.3～1.5 mg/L。由此可知，想要進(jìn)行有效的增殖，需要適當(dāng)?shù)?-BA濃度，過高或過低的6-BA 濃度都不利于增殖，6-BA的用量?jī)H能在一定的范圍內(nèi)提高增殖率，這與王蘇珂等[4]、湯紹虎等[16]和金青等[17]在6-BA 對(duì)梨組織培養(yǎng)影響的研究結(jié)果相一致。對(duì)于株系11-2 來(lái)說(shuō)，在不同6-BA 濃度處理下，莖的增殖系數(shù)均較低，這可能與品種本身的基因型有關(guān)，然而除了6-BA，生長(zhǎng)素和其他類型細(xì)胞分裂素組合也可能對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生重要影響。如在邱玉賓等[18]和方明等[19]的研究中，生長(zhǎng)素就分別對(duì)北美豆梨和杜梨的增殖產(chǎn)生了重要影響。本研究中僅對(duì)單一水平的生長(zhǎng)素與不同濃度的6-BA 組合進(jìn)行了試驗(yàn)，其他生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合能否提高11-2 株系的增殖系數(shù)，還需要做進(jìn)一步研究。

不定根誘導(dǎo)是組培過程中關(guān)鍵的一步[20]，不定根的生長(zhǎng)對(duì)組培苗在生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用有著重要的意義，為組培苗的移栽和生長(zhǎng)提供了良好的基礎(chǔ)。生長(zhǎng)素是誘導(dǎo)組培苗生根的重要因素，但生長(zhǎng)素的種類和濃度都會(huì)對(duì)生根率和平均生根數(shù)有影響，濃度過高或過低都不利于組培苗的生根。目前，應(yīng)用最多的生根誘導(dǎo)劑主要是IBA。前人研究表明，低糖低鹽培養(yǎng)基有利于多數(shù)植物試管苗生根[21-22]，而IBA 可以刺激嫩葉和嫩芽形成的IAA 的運(yùn)輸，從而促進(jìn)生根，也可以在輔酶的作用下轉(zhuǎn)化成IAA 發(fā)揮作用[23-24]。本研究以2.0 mg/L IBA 的一步生根法，在杜梨株系7-4 的生根研究中取得了良好效果，這與羅嘉亮等[25]研究的杜梨不定芽生根最理想的IBA 濃度為0.5 mg/L 的結(jié)果不同，可能是選用的杜梨株系和生長(zhǎng)狀態(tài)不同導(dǎo)致，但生根率與其比較有明顯的提高，該結(jié)果可為7-4 株系的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用提供有效的技術(shù)支撐。