張 琪，劉宇峻，莊喜兵，喬田奎

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院腫瘤科，上海 201508)

肺癌是我國(guó)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤[1]，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是其最常見的類型，約占肺癌的85%[2]。手術(shù)、放、化療是非小細(xì)胞肺癌的主要治療手段，放射治療對(duì)于局部晚期、不愿手術(shù)或因高齡、合并內(nèi)科疾病等原因不能手術(shù)的患者十分重要[3]。放射抗拒是影響肺癌放射治療效果的重要因素之一，因此，如何降低肺癌細(xì)胞輻射抵抗和改善放射敏感性是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。

有研究證實(shí)，放療可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死、細(xì)胞裂亡、衰老及其他形式的細(xì)胞死亡，其中，放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在過去20 年中得到了較廣泛的研究[4-5]。照射(irradiation，IR)激活由B 淋巴細(xì)胞瘤-2(B lymphocytoma-2，Bcl-2)家族成員在線粒體水平調(diào)節(jié)的內(nèi)在凋亡途徑，根據(jù)其作用，Bcl-2 家族成員分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，前者促進(jìn)細(xì)胞色素C 從線粒體釋放和隨后的Caspase 激活，而后者則阻止細(xì)胞色素C 從線粒體釋放。促凋亡和抗凋亡Bcl-2 蛋白之間的緊密控制平衡決定了細(xì)胞色素C 從線粒體釋放和凋亡誘導(dǎo)，從而參與治療反應(yīng)[6-7]。

附子作為一種中藥，在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床治療。近些年研究表明，其具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用[8-9]，因此，附子及其提取物或湯劑常被應(yīng)用于調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，改善腫瘤病人術(shù)后、化療后免疫功能，但目前附子與放射治療聯(lián)合作用的基礎(chǔ)研究較少。本研究探討附子對(duì)肺癌細(xì)胞增殖及放射敏感性的影響，以及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人肺腺癌A549 細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院，胎牛血清購(gòu)于Gibco公司。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于HyClone公司。細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于BD 公司。結(jié)晶紫染色液購(gòu)于碧云天生物公司。Bcl-2、Bax、β-actin一抗購(gòu)于南京凱基生物有限公司。Western blot 顯影液購(gòu)于Millipore 公司。附子提取物購(gòu)自南昌忠勤貿(mào)易有限公司，主要成分為附子多糖、皂苷。附子提取物粉末用3 倍體積蒸餾水在100 ℃下微沸處理30 min，溶液在相對(duì)離心力(relative centrifugal force，RCF)15 500 g下離心10 min，將上清液用0.22 μm 濾器過濾后濃縮，干燥，制備成冷凍干燥的粉末并儲(chǔ)存在4 ℃?zhèn)溆肹10-11]。

1.2 照射方法

采用高能直線加速器(瓦里安)，6 MV X射線照射A549 細(xì)胞，照射野7 cm×7 cm，源皮距100 cm，照射劑量率200 cGy/min，細(xì)胞接受照射劑量為1 000 cGy。

1.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將指數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞按每孔5 000 個(gè)接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，每孔附子濃度分別為0~80 μmol/mL。在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24和48 h[12]；每孔換成RPIM-1640培養(yǎng)基100 μL，分別加入CCK-8 試劑10 μL，再孵育60 min。采用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)共同孵育60 min時(shí)吸光度D(450)值，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率/%=[D(450)實(shí)驗(yàn)組-D(450)空白組]/[D(450)對(duì)照組-D(450)空白組]×100%

1.4 體外細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞接種于6孔板中，分為單純X射線照射組與附子處理后X射線組，于貼壁12 h后，X 射線照射組予培養(yǎng)基處理，附子處理后X 射線組予30 μg/L 附子提取物處理，24 h 后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行X射線照射，每組每孔單次照射劑量分別為0、2、4、6、8、10 Gy，照射后將細(xì)胞用胰酶消化，使貼壁細(xì)胞脫落，后將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，分別計(jì)數(shù)50、100、200、500、800、1 500 個(gè)細(xì)胞，接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，共計(jì)12個(gè)培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)14 d，約第7 天時(shí)換液1 次。取培養(yǎng)皿，用4%多聚甲醛固定，清洗后結(jié)晶紫染色。計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(survival fraction，SF)，SF=(PE處理組/PE對(duì)照組)×100%[13]。應(yīng)用Graphpad Prim 5版軟件，單擊多靶模型擬合兩組細(xì)胞存活曲線，并計(jì)算兩組細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù)：平均致死劑量D0，外推值N，及準(zhǔn)閾劑量Dq。

Dq的計(jì)算公式為：Dq=D0×lnN。放射增敏比(sensitive enhancement ratio，SER)計(jì)算公式為：SER=

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

實(shí)驗(yàn)分4 組，分別為：①對(duì)照組，未經(jīng)處理的腫瘤細(xì)胞；②X 射線照射組，X 射線照射，細(xì)胞貼壁后48 h 進(jìn)行X 射線照射，細(xì)胞接受照射劑量為1 000 cGy 照射野7 cm×7 cm，源皮距100 cm，吸收劑量率200 cGy/min；③附子組，細(xì)胞貼 壁后24 h 后使用附子處理，附子最終作用濃度為30 μg/mL，孵育24 h；④附子處理后X 射線照射組，細(xì)胞貼壁后24 h 后使用附子處理，附子最終作用濃度為30 μg/mL，孵育24 h 后進(jìn)行X 射線照射，細(xì)胞接受照射劑量為1 000 cGy。上述細(xì)胞貼壁72 h 后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，用吸管反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液，取2×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞采用Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)記法染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western blot 法 檢測(cè)A549 細(xì) 胞Bcl-2 及Bax 蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分組和處理同1.5。細(xì)胞貼壁72 h 后，各組細(xì)胞預(yù)冷PBS 沖洗3 遍，加入10% SDS 細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，刮取細(xì)胞蛋白，離心后取上清，金屬浴100 ℃加熱8 min，冷卻后每個(gè)孔道加入含50 μg蛋白樣品，共4 組，另取4 μL 上樣Marker 加樣。80 V電泳120 min后，濕轉(zhuǎn)法將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA、50 min，轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用封閉液(10%脫脂牛奶)室溫封閉1 h。封閉完成后，膜分別由特異抗Bcl-2、Bax、β-actin 抗體孵育(1∶500 稀釋，5%的封閉液)。β-actin 被用作內(nèi)參(1∶1 500 稀釋，5%的封閉液)。洗完膜后，在5%的緩沖液中由二抗孵育(1∶2 000 稀釋)。將Millipore 顯影液按1∶1比例配制成發(fā)光液，于上海Tanon 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)并分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以xˉ±s表示，組間比較采用方差分析；應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖形制作，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度附子對(duì)細(xì)胞存活率的影響

如圖1 所示，A549 細(xì)胞附子孵育后24 與48 h后，低濃度附子(20 μg/mL)孵育后的A549細(xì)胞增殖活力升高，表明20 μg/mL 濃度附子對(duì)細(xì)胞存活率有一定提高作用；當(dāng)濃度＞30 μg/mL，A549細(xì)胞存活率明顯下降，且隨著附子濃度的增加，對(duì)細(xì)胞活力的抑制程度加強(qiáng)。根據(jù)不同濃度的附子及作用時(shí)間下A549細(xì)胞的存活率，計(jì)算出附子提取物的IC20為27.867 μg/mL，IC50為65.949 μg/mL，放射增敏實(shí)驗(yàn)選擇附子終濃度為30 μg/mL。

圖1 不同濃度附子及作用時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

2.2 放射敏感性檢測(cè)

本研究以SER作為評(píng)價(jià)輻射增敏劑增敏效果的主要指標(biāo)。如圖2 所示，附子處理后X 射線照射組細(xì)胞起始處肩部稍窄，X 線照射組和附子處理后X 射線照射組平均致死劑量D0分別為1.83 和1.48 Gy，SER 為1.24 倍。兩組細(xì)胞在不同劑量照射時(shí)的放射生物學(xué)參數(shù)D0值(平均致死劑量)、Dq值(準(zhǔn)閾劑量)和外推N值見表1，結(jié)果顯示，30 μg/mL附子提取物對(duì)人肺癌A549細(xì)胞有明顯放射增敏作用。

圖2 不同處理組肺癌細(xì)胞存活曲線

表1 各組A549細(xì)胞放射增敏比的比較

2.3 各組A549細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見圖3，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為3.2%，附子組為5.9%，X射線照射組為13.2%，附子處理后X 射線照射組為18.8%，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且附子處理后X射線照射組細(xì)胞凋亡率高于附子組和X線照射組(P＜0.05)，表明一定濃度的附子可增加A549細(xì)胞的凋亡率，且與X射線照射聯(lián)合后，能夠進(jìn)一步增加細(xì)胞凋亡率。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡情況

2.4 不同處理組A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot 檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，顯示X射線及附子提取物均能促進(jìn)A549細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)，抑制Bcl-2 蛋白的表達(dá)。比較各組細(xì)胞的Bcl-2/Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)附子處理后X射線照射組不僅低于對(duì)照組，也低于附子以及X射線單獨(dú)處理組(P＜0.05或0.01)。

圖4 A549細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為中醫(yī)體質(zhì)與惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展以及轉(zhuǎn)移均有相關(guān)性[15]，有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者以陽虛體質(zhì)居多[16]。在中醫(yī)臨床治療腫瘤中多使用大劑量附子、干姜峻補(bǔ)真陽，提高患者抗癌能力[17]，但其治療腫瘤的具體機(jī)制尚不明確。

現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，附子對(duì)多種腫瘤有殺傷作用。有研究表明，附子能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤及胃癌細(xì)胞的凋亡[18-19]，以及通過改善機(jī)體的免疫應(yīng)答抑制機(jī)體腫瘤的生長(zhǎng)[8-9]。附子中的主要生物活性成分之一的烏頭堿被證明能特異性抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并呈劑量依賴性，其主要作用機(jī)制是激活活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞色素C 從線粒體釋放增加和細(xì)胞凋亡的激活，表現(xiàn)在癌細(xì)胞中Caspase-3 和Caspase-7 的裂解增加，以及Bax蛋白水平增加和Bcl-2水平降低[20]。此外，另外的有效成分之一的烏頭多糖硫酸鹽衍生物通過NF-κB/Bcl-2 細(xì)胞凋亡信號(hào)通路誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞系凋亡[21]。本研究證實(shí)，當(dāng)附子提取物作用A549細(xì)胞24及48 h后，能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，且有時(shí)間及劑量依賴性。以上藥理作用是本研究選擇附子提取物作為放療增敏劑的重要理論依據(jù)。

放射治療是肺癌的重要治療方式之一，而肺癌細(xì)胞對(duì)放射線的抗拒性往往導(dǎo)致放療失敗，因此，探索合適的放射增敏劑是提高肺癌療效的重要途徑之一。本實(shí)驗(yàn)選擇IC20作為附子實(shí)驗(yàn)濃度，約30 μg/mL。集落形成實(shí)驗(yàn)可發(fā)現(xiàn)，給予附子處理后肺癌A549 細(xì)胞存活曲線肩部明顯變窄，D0、Dq和N均降低，放射增敏比＞1，顯示附子提取物能夠提高肺癌A549 細(xì)胞的放射敏感性。

凋亡是腫瘤細(xì)胞受電離輻射后產(chǎn)生的主要生物效應(yīng)，在線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中，細(xì)胞在生存信號(hào)缺失、DNA嚴(yán)重受損、生長(zhǎng)因子缺乏等情況下，可通過Bcl 家族的促凋亡成員(Bax 等)與抗凋亡成員(如Bcl-2等)調(diào)控線粒體膜通透性，釋放凋亡活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，引起Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，30 μg/mL 的附子提取物明顯促進(jìn)肺A549細(xì)胞凋亡，且在相同劑量X射線照射下，聯(lián)合附子提取物的肺癌細(xì)胞凋亡率顯著增加。

Bax 與Bcl-2 蛋白可形成異源二聚體抑制凋亡，Bax間可形成同源二聚體促進(jìn)凋亡，即在Bax/Bcl-2途徑中Bax促進(jìn)凋亡而Bcl-2抑制凋亡，并進(jìn)一步通過細(xì)胞色素C 及Caspase-9 等因子激活下游Caspase-3 蛋白，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23-24]。本研究證實(shí)，附子提取物和X 射線照射均可一定程度降低肺癌A549 細(xì)胞中Bcl-2/Bax的比值，但兩者聯(lián)合處理后，肺癌細(xì)胞Bcl-2、Bax 的表達(dá)量和Bcl-2/Bax 比值變化更為明顯。由此推測(cè)，附子對(duì)肺癌細(xì)胞的放療射增敏作用可能與上調(diào)抑癌基因Bax，下調(diào)癌基因Bcl-2的蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，附子提取物聯(lián)合放療可提高非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的放射敏感性，可能有助于克服NSCLC患者的放療抵抗，減少放療劑量，減輕放療相關(guān)副反應(yīng)，可能是一種有前景的NSCLC治療方法，為NSCLC患者提供了一種新的治療策略。