丁 賽，張紅霞，朱海英

(海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，上海 200433)

間充質(zhì)干細(xì)胞最早在骨髓中被發(fā)現(xiàn)和鑒定，隨后在人體胚胎及成體的多種組織中被陸續(xù)鑒定出來，這些組織主要包括成體骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊水、臍帶和臍帶血等。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞的組織來源雖然不同，但是鑒于其共同的干細(xì)胞特性和免疫調(diào)節(jié)能力，其展現(xiàn)出的臨床應(yīng)用前景受到人們的格外關(guān)注。目前，臨床應(yīng)用方面研究較多的是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，但其制備過程不容易進(jìn)行質(zhì)量控制，取材時對患者有損傷；其免疫原性強(qiáng)，不適用異體移植；還有，細(xì)胞數(shù)量、增殖能力以及分化潛能與供體的年齡均呈負(fù)相關(guān)，這都限制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。與之相比，胎盤和臍帶組織中分離出的間充質(zhì)干細(xì)胞不僅保持了間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，而且分化潛力大、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制、易于工業(yè)化制備等特征，所以有可能成為更具臨床應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞[1]。

華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞(Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells，WJ-MSCs)是一種分離自臍帶華通氏膠的間充質(zhì)干細(xì)胞，其基因表達(dá)譜符合目前對MSCs 的界定，也表達(dá)一定水平的OCT-4、SOX-2和NANOG等多能性基因，除了能分化為成骨、成脂、成軟骨細(xì)胞外，還能分化成內(nèi)胚層和外胚層衍生細(xì)胞。此外，WJ-MSCs 不表達(dá)MHC-II，免疫原性很低，并在體內(nèi)表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)特性，這使得它們成為細(xì)胞療法中同種異體和異種移植的良好替代物。因此，WJ-MSCs是一種很有臨床應(yīng)用前景的間充質(zhì)干細(xì)胞。

1 華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、建系和增殖特性

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)可以從整個臍帶獲得，但原代培養(yǎng)時可能會有血管內(nèi)皮細(xì)胞等其他細(xì)胞混雜，造成細(xì)胞系不易純化；也可以從臍帶的不同區(qū)室分離建系，這些部位包括臍靜脈的內(nèi)膜下層、臍帶內(nèi)層、華通氏膠和及其血管周圍區(qū)[2]。其中，WJMSCs 含量最為豐富。華通氏膠位于血管之間、血管與外膜之間，是一種膠狀物。

既往文獻(xiàn)報(bào)道[3]，華通氏間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法主要包括酶消化法和組織塊培養(yǎng)法。

1.1 酶消化法分離華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞

無菌條件下取剖腹產(chǎn)新鮮臍帶，用無菌PBS溶液洗去臍帶殘留血液，一直到整個組織塊變白為止。選取其中部5~7.5 cm，剪成若干臍帶小段(每段長2~3 cm)，縱行剖開每段臍帶，去除其中的動靜脈、外層羊膜，留取華通氏膠組織(即血管之間以及血管與外膜之間的凝膠狀物)。將其剪切成1 mm3以下的小塊，再以平衡鹽溶液沖洗后，浸于濃度為0.2%的Ⅰ型膠原酶溶液中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中孵育45 min~2 h，消化后的混合液用含10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打后將懸浮液移入離心管，離心收集細(xì)胞。用新培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，置37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、98%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后更換完全DMEM培養(yǎng)基溶液，以后每隔3 d 換液1 次，細(xì)胞貼壁融合后傳代培養(yǎng)。

1.2 組織塊貼壁法分離華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞

取出華通氏膠組織，剪成體積為3~5 mm3的小塊，并用無菌解剖溶液再次清洗。后將組織塊轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，平鋪，并加入DMEM/F12培養(yǎng)液中(含10% FBS、100 μg/mL鏈霉素以及100 U/ml青霉素)，靜置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況(新生細(xì)胞具有貼壁生長的特性)，待華通氏膠組織塊附著后，每2~3 d更換培養(yǎng)基。大約7~10 d后，可以分離出具有間充質(zhì)干細(xì)胞表型的細(xì)胞。顯微鏡下觀察，細(xì)胞為典型的成纖維樣細(xì)胞，為梭形或星狀，呈平行或旋渦狀排列。

比較兩種方法，組織塊貼壁法在分離WJ-MSCs 時可以作為首選的方法。雖然其首次傳代所用時間較長，但分離方法更易于保持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的活性，且獲得的細(xì)胞純度高、細(xì)胞活力好，同時費(fèi)用低，生物污染的可能性低[4]。酶消化法雖然首次傳代所用時間較短，獲得的細(xì)胞量更多，但費(fèi)用高，細(xì)胞純度不高，對細(xì)胞質(zhì)量影響較大[5]。另外，兩種方法所獲得的WI-MSCs的免疫表型和多系分化能力無顯著差異[6]。

有研究小組將人臍帶分為不同的區(qū)室，如羊膜上皮膜(amnion，AM)、臍 帶 內(nèi) 膜(subamnion，SA)、華 通 氏 膠(Wharton's jelly，WJ)和臍血管周圍區(qū)域(perivascular，PV)。對比從臍帶不同區(qū)室分離的細(xì)胞數(shù)量，華通氏膠中獲得的MSCs是最高的，每厘米臍帶的華通氏膠中可分離的活細(xì)胞數(shù)可達(dá)4.7×106個[7]。與其他區(qū)室相比，華通氏膠具有最大的表面積和體積，且細(xì)胞松散地位于華通氏膠內(nèi)，所以無需酶處理就可快速分離細(xì)胞。由于其較短的群體倍增時間，因此僅需短期培養(yǎng)即可產(chǎn)生足夠數(shù)量的細(xì)胞。

2 華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能

根據(jù)國際細(xì)胞治療協(xié)會(International Society for Cellular Therapy，ISCT)的定義，WJ-MSCs 符合目前定義間充質(zhì)干細(xì)胞的最低標(biāo)準(zhǔn)，即在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下貼壁生長，特異性表面抗原 CD105、CD73 和CD90 陽 性，且CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19 和HLA-II 陰性的細(xì)胞占群體的95%[8]，同時具有分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞譜系。已經(jīng)有較多實(shí)驗(yàn)證明WJ-MSCs具有MSCs共同的三向分化潛能[7，9]。但另一方面，與其他組織來源的MSCs 相比，WJ-MSCs 的三向分化潛能又有其特點(diǎn)，比如Karahuseyinoglu 等[10]所證明，與骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，WJ-MSCs具有更大的向軟骨和成骨譜系分化的潛力，但向脂肪細(xì)胞分化的能力稍弱。與來自于臍帶不同區(qū)室的MSCs 相比，WJ-MSCs 向脂肪分化的能力無差異，但是卻顯示出較強(qiáng)的骨和軟骨分化能力。研究結(jié)果顯示，與臍帶PV、SA和AM來源的MSCs相比，暴露于骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基的WJ-MSCs 顯示出最多數(shù)量的馮庫薩(Von Kossa)染色細(xì)胞和最大的結(jié)節(jié)染色強(qiáng)度。與臍帶SA 和AM 來源的MSCs 相比，暴露于軟骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基的WJ-MSCs 和PV 來源的MSCs 顯示出更多阿利新藍(lán)(Alcian blue)染色陽性細(xì)胞。骨細(xì)胞標(biāo)記基因骨鈣素、骨橋蛋白、堿性磷酸酶和骨涎蛋白在WJ-MSCs 中的表達(dá)水平顯著高于PV、SA 和AM 來源的MSCs。類似地，與臍帶PV、SA和AM來源的MSCs相比，WJ-MSCs中軟骨細(xì)胞標(biāo)記基因II型膠原、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白、纖維調(diào)節(jié)蛋白和性別決定區(qū)Y 框蛋白9 的表達(dá)水平顯著高于PV、SA 和AM 來源的MSCs(表1)[7，11]。

表1 人臍帶不同區(qū)室的MSCs的成脂、成骨和成軟骨分化評分

從胚胎發(fā)育上看，華通氏膠中的基質(zhì)細(xì)胞來自胚外中胚層[12]，但目前的研究結(jié)果表明除了具有向中胚層衍生細(xì)胞分化外，WJ-MSCs還具有更廣泛的分化潛能，能夠向內(nèi)、外胚層細(xì)胞及其衍生細(xì)胞分化。

2.1 WJ-MSCs向內(nèi)胚層及衍生細(xì)胞分化

誘導(dǎo)WJ-MSCs 向內(nèi)胚層衍生細(xì)胞分化，是一種跨胚層的分化方向。到目前為止，已經(jīng)有較多的報(bào)道證明WJ-MSCs 具有肝向和胰腺細(xì)胞分化的潛能[13]。其中Zhang等[14]報(bào)道了使用肝細(xì)胞生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子4 誘導(dǎo)WJ-MSCs 向肝分化，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如白蛋白、人甲胎蛋白和細(xì)胞角蛋白18，同時糖原染色呈現(xiàn)陽性，表明這些細(xì)胞能夠儲存糖原。Zheng 等[15]報(bào)道了，通過肝源性分化方案將WJ-MSCs 誘導(dǎo)分化為功能性肝樣細(xì)胞，經(jīng)檢測，誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)肝血清蛋白，如總蛋白、白蛋白、球蛋白和甲胎蛋白，同時糖原高碘酸—希夫染色陽性，而且細(xì)胞可攝取低密度脂蛋白。Bharti等[9]還證明了向肝細(xì)胞分化后，獲得的細(xì)胞具備了氨代謝和產(chǎn)生尿素的能力。

WJ-MSCs 向胰腺細(xì)胞方向分化也獲得了成功。WJ-MSCs細(xì)胞在神經(jīng)元條件培養(yǎng)基和干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細(xì)胞由長梭形逐漸變圓，并聚集成團(tuán)。經(jīng)檢測，誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)胰島及胰腺β細(xì)胞相關(guān)基因，如PDX1、HLXB9、NKX2.2、NKX6.1和GLUT-2等，將這些分化的細(xì)胞移植入糖尿病大鼠模型，可明顯降低血糖水平，有效改善體質(zhì)量減輕癥狀，并且不會發(fā)生移植排斥反應(yīng)，表明WJ-MSCs 可分化成成熟的胰島β樣細(xì)胞，該細(xì)胞含有胰島素原的C肽，能對血糖變化作出反應(yīng)并釋放胰島素[16]。

2.2 WJ-MSCs向中胚層及衍生細(xì)胞分化

由于WJ-MSCs 來自于中胚層，所以體外誘導(dǎo)WJ-MSCs 向中胚層譜系的細(xì)胞分化，到目前已經(jīng)有了很多成功的例子。除了成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞外，心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞也有較多成功的報(bào)道。

使用5-氮胞苷或心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)WJ-MSCs，檢測到心肌肌鈣蛋白I和N-鈣黏蛋白的表達(dá)，可以觀察到誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞產(chǎn)生自律性搏動，由此證明了WJ-MSCs能分化成心肌細(xì)胞，并認(rèn)為WJ-MSCs可作為心肌細(xì)胞的候選種子細(xì)胞[17]。

Conconi等[18]分選了CD105+/CD31-/KDR-WJ-MSCs，在培養(yǎng)基中添加馬血清和雞胚提取液，證明了WJ-MSCs 中的CD105+細(xì)胞能夠在體外分化成表達(dá)肌源性因子5和成肌調(diào)節(jié)因子的骨骼肌細(xì)胞，而且能在動物體內(nèi)參與到骨骼肌修復(fù)當(dāng)中。

Wu等[19]進(jìn)行的研究表明，在血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子存在下，WJ-MSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞并表達(dá)成熟的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，如CD31或CD34。分化后的細(xì)胞還獲得了內(nèi)皮細(xì)胞功能，能夠攝取乙酰化低密度脂蛋白。

2.3 WJ-MSCs向外胚層及衍生細(xì)胞分化

多項(xiàng)研究中均檢測到了WJ-MSCs 表達(dá)神經(jīng)元特異性核蛋白，這提示了WJ-MSCs具有神經(jīng)方向分化的內(nèi)在潛力[20-21]。許多研究也證明了不同的誘導(dǎo)條件能成功誘導(dǎo)WJ-MSCs 向神經(jīng)方向分化。

Fu 等[20]通過使用神經(jīng)元條件培養(yǎng)基培養(yǎng)WJ-MSC，在誘導(dǎo)后第9天檢測到神經(jīng)元特異性標(biāo)記物的高表達(dá)和隨后的形態(tài)學(xué)變化，表達(dá)神經(jīng)纖維蛋白等神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白的細(xì)胞比例達(dá)到87%。Mitchell等[21]利用堿性成纖維生長因子、丁基化羥基茴香醚和二甲基亞砜進(jìn)行多步驟神經(jīng)方向誘導(dǎo)，使WJ-MSCs 轉(zhuǎn)分化為具有神經(jīng)元的形態(tài)，并且表達(dá)β-III微管蛋白、神經(jīng)絲、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和酪氨酸羥化酶等兒茶酚胺能神經(jīng)元的標(biāo)志。

利用小分子化合物也能誘導(dǎo)WJ-MSCs 的神經(jīng)方向分化。Nan 等[22]利用優(yōu)化濃度的川芎嗪在6 h 內(nèi)將WJ-MSCs 誘導(dǎo)分化為表達(dá)神經(jīng)特異性蛋白的神經(jīng)元樣細(xì)胞。這些神經(jīng)特異性蛋白包括比如烯醇(化)酶，神經(jīng)纖維蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白，形態(tài)也有顯著變化，呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞體外生長的典型特征。另一方面，Liang 等[23]報(bào)道了WJ-MSCs 可以在體外快速分化為膽堿能樣神經(jīng)元。

另外，Hu 等[24]報(bào)道了WJ-MSCs 能夠在體外分化為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。視網(wǎng)膜祖細(xì)胞胚胎發(fā)育上起源于神經(jīng)外胚層細(xì)胞。Hu等在無血清神經(jīng)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中添加了Dkk-1 和LeftyA，前者是Wnt/β-catenin 途徑拮抗劑，后者是Nodal 信號通路拮抗劑。誘導(dǎo)后的WJ-MSCs 由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂斜姸嗤黄鸬那驙罴?xì)胞，表達(dá)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞標(biāo)志物Pax6和Rx，巢蛋白表達(dá)下調(diào)。

精子樣細(xì)胞在胚胎發(fā)育中也屬于外胚層衍生細(xì)胞。Huang等[25]用全反式維甲酸、睪酮和睪丸細(xì)胞條件培養(yǎng)基將WJ-MSCs誘導(dǎo)分化為具有蝌蚪形態(tài)的精子樣細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記物Oct4、CD117(C-kit)、CD49f、Stella(DDPA3)或Vasa(DDX4)。

3 WJ-MSCs的應(yīng)用展望

作為間充質(zhì)干細(xì)胞家族的一個成員，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，WJ-MSCs的研究雖然仍處于起步階段，但已有的研究表明其具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。相信隨著研究的深入，WJ-MSCs在將來會有更廣泛的臨床應(yīng)用。另外，WJ-MSCs不表達(dá)MHCII，并具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特性[26]，這使得它們非常適合同種異體和異種移植。不僅如此，目前已經(jīng)使用WJ-MSCs 進(jìn)行了許多臨床前和臨床研究[27]，也已經(jīng)有研究表明WJ-MSCs可以改善心血管疾病、免疫相關(guān)疾病或神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的狀況。動物研究表明，WJ-MSCs可以改善帕金森氏病、組織纖維化、癌癥和脊髓損傷等臨床癥狀，其機(jī)制可能在于其多向分化潛能，能夠分化成受損組織的細(xì)胞，也可能是進(jìn)入體內(nèi)后，其獨(dú)特的旁分泌機(jī)制起到重要作用[28]。再者，對臨床應(yīng)用而言，最重要的是其安全性。Gauthaman 等[29]的研究證明，WJ-MSCs 在移植到體內(nèi)后不誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生或機(jī)體的炎癥反應(yīng)，這說明在將來臨床應(yīng)用的安全性方面，WJ-MSCs比胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞更有優(yōu)勢。因此，WJ-MSCs是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的又一個具有應(yīng)用潛力的間充質(zhì)干細(xì)胞。當(dāng)然，Paladino 等[30]的研究結(jié)果也提出了一個值得關(guān)注的問題，WJ-MSCs的衰老會影響其在體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用，Luo 等[31]的研究結(jié)果也提示衰老的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞肝向分化效率也會下降，所以應(yīng)用到臨床前仍要對細(xì)胞的生理狀態(tài)進(jìn)行全面評估。