張 珊，張 玥，陳祥靜，王 悅，孔令婉，申加興，王 麗，劉 承，郭鈺琪，姚成芳

[1.山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)基礎醫(yī)學院，山東 濟南 250117；2.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250399]

γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ) 是調控天然免疫和獲得性免疫的重要細胞因子，也是機體抗腫瘤、抗病毒免疫反應的主角，主要由T細胞(Th1、Tc1)、NK1、NKT1和I型固有淋巴樣細胞等淋巴細胞分泌。其中，T、NK細胞分泌的IFN-γ可占IFN-γ總體水平的80%以上。天然免疫過程中，IFN-γ可促進巨噬細胞、NK細胞活化，并促進天然免疫細胞抗腫瘤、抗病毒免疫應答[1-2]。在獲得性免疫反應過程中，IFN-γ可輔助B細胞產生抗體，加速Th1活化，促進Tc細胞激活和記憶T細胞增殖，增強抗腫瘤免疫的特異性和持久性[3-4]。此外，IFN-γ可提高腫瘤對放療的敏感性[5]。因此，輻射損傷后IFN-γ分泌性T、NK淋巴細胞的修復能力，決定了輻射后機體抗腫瘤免疫反應的整體水平。

機體正常組織遭受低劑量輻射帶來的免疫損傷是腫瘤放療病人和從業(yè)人員面臨的常見問題。特別是腫瘤病人，在腫瘤精準放療時，正常組織也可遭受低劑量輻射。腫瘤組織局部IFN-γ分泌性淋巴細胞缺失，依賴正常組織中IFN-γ分泌性淋巴細胞的填充，輻射后正常組織IFN-γ分泌性淋巴細胞快速恢復對腫瘤組織抗腫瘤能力的重建至關重要。輻射(irradiation，IR)誘發(fā)淋巴細胞減少已成定論，然而，IFN-γ分泌性淋巴細胞不同亞群對低劑量輻射的敏感性和修復能力結論不一，且現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)有限。IFN-γ分泌性T、NK細胞主要由IL-12、IL-15等細胞因子激活或維持增殖[6]，這些細胞因子可進一步激活T-bet、STAT4等轉錄信號[7]。盡管NKT細胞、活化巨噬細胞和B細胞等可產生少量IFN-γ，但占比較少。IFN-γ分泌性T、NK細胞是抗腫瘤免疫的主力軍，即使在輻射條件下也在維持有效的抗腫瘤免疫功能中發(fā)揮關鍵作用[8]。明確這些細胞應對低劑量輻照的反應狀態(tài)和修復能力，有助于有效地保護和重建機體抗腫瘤實力。

熟地(PreparedRadixRehmanniae，PRR)是經典的補陰中藥。腫瘤患者放療后多屬虛證，對于腫瘤放療后的虛證患者，熟地配伍應用可對抗骨髓抑制反應[9]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，熟地能夠促進小鼠的淋巴細胞增殖，增強免疫反應[10]。以熟地為主要成分的中藥復方可以提高淋巴細胞數(shù)量，但熟地對輻射后IFN-γ分泌性T、NK細胞的作用尚不清楚。本研究利用小鼠單次低劑量(2.5Gy)全身照射模型，分析Th1、Tc1和NK1細胞比例和數(shù)量變化，檢測這些細胞IL-12R、IL-15R等細胞因子受體的表達變化，探討熟地對這些細胞應對輻射損傷的保護作用和藥效機制。通過輻照小鼠腫瘤模型，我們發(fā)現(xiàn)輻射造成IFN-γ分泌性T、NK細胞減少，可增加腫瘤轉移風險；而熟地的治療可有效促進輻射后IFN-γ 分泌性T、NK細胞比例和數(shù)量，減少腫瘤轉移風險，這一結果為改善放射治療后IFN-γ+細胞重建提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級♀ C57BL/6小鼠(SYXK魯20180007，SCXK20190003)，6～7周齡，體質量(20±2)g，購買于濟南朋悅實驗動物繁育中心。適應性喂養(yǎng)1周，自由飲水，晝夜交替光照，溫度維持在(20～25)℃，相對濕度45%～55%。

1.1.2實驗試劑與儀器 佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA，貨號：16561-29-8) 、離子霉素(ionomycin，貨號：56092-81-0)、Dispase酶Ⅱ(貨號：42613-33-2)均購自Sigma 公司,蛋白轉運抑制劑(美國Thermo公司，貨號：2330518),流式抗體CD3-BV421(貨號：562600)、CD8-V500(貨號：560778)、NK1.1-PerCP-cy5.5(貨號：551114)、CD212-PE(貨號：551974)、IFN-γ-APC(貨號：562018)均購自美國BD公司,CD4-APC-cy7(美國eBioscience公司，貨號：A15384),CD215-Alexa Flour 488(美國R&D system公司，貨號：FAB5511G),PRR(購于山東省建聯(lián)中藥股份有限公司，產地，河北),乙二胺四乙酸(EDTA)(北京索萊寶科技有限公司，貨號：E1170)，膠原酶D(瑞士Roche公司，貨號：11088858001)，新生胎牛血清(美國Gibco公司，貨號：16010159)和RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司，貨號：2286515)，破膜液(美國BD公司，貨號：554714)，TRIzol(美國Invitrogen公司，貨號：15596018)，RevertAid逆轉錄酶(美國Thermo公司，貨號：EP0442)，RNA酶抑制劑(碧云天公司，貨號：R0102-2kU)，脫氧核糖核苷(dNTP)(北京康為世紀公司，貨號：CW0941)，SYBR Green master(ROX)(美國Bio-Rad公司，貨號：1725124),PCR擴增儀(德國Whatman Biometra公司)，F(xiàn)ACSAria III流式細胞儀(美國BD公司)，熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司),RS2000 Pro225生物學X射線輻照儀(美國，Rad Source)。

1.2 方法

1.2.1熟地的提取及含量測定 稱取中藥熟地200 g，按中國藥典方法進行水提、醇沉，生藥提取率為2 kg·L-1(地黃苷D含量為2.64 g·L-1)。

1.2.2X線輻照 使用RS2000 Pro225生物學X射線輻照儀，對小鼠進行全身照射，總照射劑量2.5Gy(劑量率，1.3 Gy/min)，輻照距離為170 mm。

1.2.3動物模型構建、分組處理方法 C57BL/6小鼠60只，分為正常對照組、輻照模型組、輻照PRR治療組、腫瘤輻照PRR治療組、腫瘤模型組和輻照后腫瘤模型組等6組，自由飲水、攝食1周后，除正常組小鼠外，其余各組小鼠均給予X線輻照；腫瘤輻照+PRR治療組、腫瘤模型組和輻照后腫瘤模型組小鼠尾靜脈注射B16黑色素瘤細胞(2×105)，建立對照腫瘤模型和輻照后腫瘤模型；PRR給藥劑量經預實驗(10、20、40 g·kg-1)處理后，基于IFN-γ表達水平的變化，選擇療效最佳濃度20 g·kg-1(結果未展示)。輻照PRR治療組和腫瘤輻照PRR治療組小鼠進行PRR灌胃治療(20 g·kg-1)，連續(xù)灌胃8 d，至實驗前12 h。實驗前小鼠禁食12 h，自由飲水。

1.2.4流式細胞術檢測IFN-γ分泌性T、NK細胞 在輻照后d 2、4、8，分別處理5只輻照小鼠和5只對照小鼠；腫瘤模型小鼠在造模后d 8處理。取小鼠脾臟，制備單細胞懸液，將淋巴細胞按照每孔2×106個細胞接種于24孔板，加入PMA (30 μg·L-1)、離子霉素(1 mg·L-1)和蛋白轉運抑制劑(1 mL·L-1)，置37 ℃、5%CO2刺激培養(yǎng)5 h后，收集細胞，1×PBS洗2遍，F(xiàn)c Block阻斷非特異性結合后，再次洗滌，加入外標抗體(CD3-BV421、CD4-APC-cy7、CD8-V500、NK1.1-PerCP-cy5.5、CD212-PE、CD215-Alexa Flour 488)，4 ℃避光孵育1 h。PBS洗滌后加入破膜液破膜40 min，再次洗滌后加入內標抗體(IFN-γ-APC)4 ℃避光孵育1 h，洗滌后，上機檢測。

1.2.5RT-qPCR檢測細胞因子IL-12、IL-15及轉錄因子T-bet、STAT4的mRNA水平 分離小鼠脾臟淋巴細胞，制備單細胞懸液，1×PBS洗2遍后，加入TRIzol，提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。將RNA反轉錄合成cDNA，進行實時熒光定量PCR。RT反應條件：總反應體系30 μL，2 μg總RNA，以oligo dT為RT反應引物，70 ℃，5 min；5×RT buffer 6 μL、dNTP 3 μL、RNA酶抑制1.5 μL、RevertAid逆轉錄酶1.5 μL，42 ℃，60 min。RT-qPCR反應體系為：總反應體系20 μL，包括cDNA 1 μL，無RNase水7 μL，上下游引物各1 μL，SYBR?Green master(ROX)10 μL，反應條件為：94 ℃，10 min；95 ℃，10 s；60 ℃，40 s；72 ℃，5 min；40個循環(huán)，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt計算基因相對表達量。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Sequence of PCR primer

2 結果

2.1 X線輻照后不同時間點T、NK等淋巴細胞的修復狀態(tài)與對照組相比，輻照后d 2，脾臟總淋巴細胞數(shù)量和T淋巴細胞亞群CD3+CD4+(Th)、CD3+CD8+(Tc)細胞數(shù)量和比例明顯下降(P<0.05,P<0.01)，從d 4開始逐漸恢復，到d 8恢復到基礎水平。而NK細胞比例在d 2明顯增加(P<0.01)，但其細胞數(shù)量下降(P<0.05)，d 4細胞比例和數(shù)量均恢復到基礎水平。結果顯示T淋巴細胞對輻照損傷更為敏感(Tab 2)。

Tab 2 Difference in number and proportion of splenic lymphocyte subsets at different time after irradiation in mice

2.2 X線輻照后IFN-γ分泌性T、NK細胞的免疫修復能力差異T細胞和NK細胞是IFN-γ的主要生成細胞。流式細胞術分析IFN-γ+Th(Th1)、Tc(Tc1)、NK(NK1)細胞在輻照損傷后的修復情況，發(fā)現(xiàn)輻照后d 2，小鼠脾臟中IFN-γ+細胞(Fig 1B，P<0.01)和Th1、Tc1、NK1細胞比例和數(shù)量均下降(Fig 1C，P<0.05，P<0.01)。Tc1和NK1細胞在輻照后d 4逐漸恢復，其中Tc1到d 8恢復到正常水平，NK1細胞的比例和數(shù)量則在d 8高于對照組(Fig 1C，P<0.05，P<0.01)；而Th1細胞在輻照后4～8 d細胞比例和數(shù)量仍然低于對照組(Fig 1C，P<0.01，P<0.05)。結果表明：Th1細胞較Tc1和NK1細胞對輻照的敏感性更強，免疫修復能力較弱。

Fig 1 Proliferation of IFN-γ-secreting Th1，Tc1 and NK1 cells measured by flow cytometry in spleen after X-ray

2.3 X線輻照后IL-12和IL-15及其受體和轉錄因子的變化特點IL-12和IL-15是調控IFN-γ分泌性T、NK細胞增殖分化的重要細胞因子。RT-qPCR結果顯示，輻照后，IL-12和IL-15mRNA水平呈現(xiàn)動態(tài)性變化特點。在輻照后d 2，IL-12和IL-15 mRNA的表達量明顯升高(Fig 2A，P<0.01)，而在4 d后的恢復階段逐漸降低。IFN-γ特異性轉錄因子T-bet和STAT4 mRNA的表達水平在輻照后降低(Fig 2A，P<0.05，P<0.01)。流式結果顯示，輻照后，Th1細胞IL-12R(CD212)和IL-15R(CD215)等細胞因子受體表達水平明顯低于基礎水平；而Tc1和NK1細胞在輻照后d 4～8修復期，明顯高于基礎水平(Fig 2B，P<0.05，P<0.01)。結果表明：輻照后，微環(huán)境中IL-12、IL-15表達水平下降和Th1細胞IL-12R、IL-15R的低表達狀態(tài)，使Th1對細胞因子的利用能力明顯下降，阻礙Th1的快速修復。

Fig 2 Cytokine，receptor and specific transcription factors related to IFN-γ producing T and NK cells after X-ray

2.4 中藥PRR調節(jié)IFN-γ分泌性T、NK細胞輻照后免疫重建作用與輻照模型相比，PRR處理組小鼠IFN-γ+細胞比例和數(shù)量明顯增多，IFN-γ分泌性Th1、Tc1和NK1的細胞比例和數(shù)量也明顯增加(Fig 3A，P<0.05，P<0.01)，表明PRR能夠有效促進輻照后IFN-γ分泌性Th1、Tc1和NK1細胞的增殖。與B16黑色素瘤肺癌小鼠相比，輻照小鼠的肺腫瘤克隆數(shù)明顯增多(Fig 3B，P<0.01)，而經過PRR處理的輻照小鼠肺腫瘤克隆數(shù)明顯減少(Fig 3B，P<0.05)。結果表明：PRR可有效促進輻照后IFN-γ分泌性T、NK細胞的免疫重建。

Fig 3 Effects of PRR on IFN-γ-secreting T and NK cells in irradiated and B16 melanoma metastatic mice

3 討論

T細胞和NK細胞分別是獲得性免疫和天然免疫的重要細胞群，也是機體抗癌免疫的主體細胞，特別是IFN-γ分泌性T細胞和NK細胞，發(fā)揮著重要的抗腫瘤作用[11-12]。輻射后，T細胞和NK細胞IFN-γ的分泌能力直接影響抗腫瘤免疫功能。正常組織中分布著大量的淋巴細胞，這些細胞對輻射損傷的反應狀態(tài)和修復能力，決定了機體的整體免疫功能，同時也影響正常組織免疫細胞對病變組織的補充和調控能力。我們發(fā)現(xiàn)，淋巴細胞對輻照損傷表現(xiàn)出極強的敏感性(Tab 1)。雖然，輻射損傷后d 8，淋巴細胞總數(shù)恢復到正常水平，但IFN-γ+T細胞亞群和NK細胞輻射損傷后的修復能力明顯不同。在IFN-γ+細胞中，T細胞對輻射損傷更為敏感；與Tc1和NK1細胞相比，Th1細胞在輻照損傷后恢復能力較低，這一現(xiàn)象雖然與Th1活化的第一信號(TCR-MHC-Ⅱ)和第二信號(CD80/86)等有關，但細胞因子第三信號(IL-12，IL-15)也起到了關鍵作用。Tc1與NK1高表達IL-12R和IL-15R，特別是在輻射損傷修復階段(4～8 d)，是Th1的3～7倍(Fig 2B)，使Tc1與NK1可優(yōu)勢利用環(huán)境中低轉錄水平的IL-12和IL-15，而Th1缺少這一優(yōu)勢，不能充分利用輻射后有限的細胞因子資源，導致修復能力低下。這一結果，使機體抗腫瘤免疫反應缺少了特異性和長效性，輻射后肺轉移克隆數(shù)的明顯升高(Fig 3B)，為這一結果提供了有力證據(jù)。Tc1與NK1在修復期的相對優(yōu)勢，并不能逆轉腫瘤肺轉移的升高，從另一方面證明了Th1抗腫瘤特異性免疫的重要性。有關中藥抗輻射研究報道較少，雖有研究顯示中藥川芎提取物對輻射損傷的保護作用，也只是觀察該提取物對γ射線損傷的小鼠可能通過上調Bcl-2蛋白，下調p53蛋白的表達起到輻射保護作用，沒有針對IFN-γ+細胞的相關研究結果[13]。我們之前的研究也發(fā)現(xiàn)肉桂可以提高輻照后IFNγ的分泌，上調Th1，修復輻射損傷后Th1、Th2、Treg和Th17等T細胞亞群的平衡，與熟地作用相似，可以減少輻射后B16黑色素瘤的肺臟轉移[12]，但熟地作用更強(結果未展示)。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，熟地在增強輻射后Th1修復能力的同時，也可上調Tc1和NK1對IFN-γ的分泌能力，全面提高機體抗腫瘤的天然免疫和獲得性免疫的能力，明顯減少輻射后的肺轉移克隆形成，進一步證實了輻射后IFN-γ分泌性T、NK細胞修復能力的重要性。

越來越多的證據(jù)表明，Th2、Treg和Th17等T細胞亞群在共同的環(huán)境刺激下表現(xiàn)出不同的特征，包括凋亡、增殖和執(zhí)行特定生物學功能[14-15]。T細胞亞群之間的競爭進一步削弱了Th1細胞的早期發(fā)育。有報道發(fā)現(xiàn)，輻射后增加的Treg和Th17亞群，也限制Th1的恢復，破壞T細胞亞群的穩(wěn)態(tài)[16-17]。也是機體抗腫瘤能力下降的重要原因。這些研究與我們的研究結果一致，強調了輻射后Th1在抗腫瘤特異性免疫中的關鍵作用。

中醫(yī)藥在生命健康保障中做出了巨大貢獻，積累了豐富的臨床實踐經驗。在輻射損傷中，補益類中藥得到了廣泛應用，多用于淋巴細胞輻射性損傷后的快速修復[18]。熟地是經典的滋補腎陰類藥物，常與其他藥物配伍，用于輻射后免疫修復。本研究結果證明，促進IFN-γ分泌性T和NK輻射后的快速修復、提高是熟地發(fā)揮藥效的重要免疫藥理基礎。但其藥效物質基礎和中藥藥效靶點，還有待進一步研究。