王敬亭，趙田田，趙澤浩，周長慧，李嫚琪，楊紫軒，何偉偉，常 艷

(1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201201；2. 復旦大學藥學院，上海 201203)

當前3D細胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為體外毒性檢測的一個主要的發(fā)展方向[1]。3D細胞模型可在體外模擬體內(nèi)微環(huán)境，與2D細胞相比在維持組織的形態(tài)和功能特征方面都有顯著的改善。與此同時，使用3D細胞培養(yǎng)技術(shù)符合“減少、替代、優(yōu)化”3R原則的要求。

目前已經(jīng)建立的3D肝細胞模型有多種，如肝細胞球體模型、肝微圖共培養(yǎng)模型、生物反應(yīng)器模型、生物打印、灌注肝芯片模型以及微流控芯片[2]等。80%的已發(fā)表文獻使用3D肝球狀體模型用于體外毒性篩選[3]，目前進行毒性評價的3D肝細胞球狀體是最簡單的3D體外細胞模型。3D細胞球體是細胞產(chǎn)生了包括纖維連接蛋白和膠原蛋白在內(nèi)的幾種關(guān)鍵蛋白，形成細胞間黏附，進而自組裝形成的致密聚集體。與傳統(tǒng)的2D細胞培養(yǎng)相比，3D細胞球體的優(yōu)點是具有更好地模擬與細胞生長和細胞信號轉(zhuǎn)導高度相關(guān)的細胞外微環(huán)境的能力；培養(yǎng)方式簡單并可實現(xiàn)多種細胞共培養(yǎng)；形成的球體穩(wěn)定，重復性好；可以實現(xiàn)高通量和高含量的藥物篩查。已有證據(jù)表明，無支架培養(yǎng)方式培養(yǎng)的HepG2細胞球狀體重新獲得了肝細胞功能，如糖原的儲存、膽鹽的運輸和類似膽汁小管的結(jié)構(gòu)的形成，可使白蛋白、尿素、異種生物轉(zhuǎn)錄因子、Ⅰ期和Ⅱ期藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體表達增加、細胞色素P450介導的代謝明顯高于單層培養(yǎng)的肝細胞[4]。目前，已有少量文獻應(yīng)用HepG2細胞或HepaRG細胞構(gòu)建球體模型對化合物進行遺傳毒性評價[5-7]。

本研究擬建立一種新的3D肝細胞模型，并選用研究最為充分的人源化肝細胞HepG2細胞作為該模型的細胞系，再將已建立的3D肝細胞模型與體外微核試驗及體外彗星試驗結(jié)合，采用模式化合物分別建立3D肝細胞體外微核試驗方法及3D肝細胞體外彗星試驗方法，探索3D肝細胞模型在體外遺傳毒性檢測方面的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞及主要試劑 HepG2細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。MMC(批號：AKZ80-NO)、MMS(批號：S4831975)均購自美國Sigma公司；Cyto-B(批號：654530)購自MCE公司；高糖DMEM培養(yǎng)基(貨號：11995-065)和0.25%胰酶-EDTA消化液(貨號：25200-012)購自美國Gibco公司；100×青鏈霉素混合液(貨號：15140-122)、熒光素二乙酸二酯(Fluorescein diacetate，F(xiàn)DA，貨號F1303)、碘化丙啶(propidium iodide，PI，貨號P1304MP)、SYBR Gold染液(貨號：S11494，批號：2174893)均購自美國Invitrogen公司；尿素試劑盒(貨號：DIUR-500T)、白蛋白(BCG法)試劑盒(貨號：DIAG-250T)均購自美國BioAssay Systems公司；miRNeasy Mini小型提取試劑盒(批號：163052565)購自美國QIAGEN公司；Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預混液(批號：A2A0216)、ROX Reference Dye 染液(20 μmol·L-1)(批號：A1A0850)、SYBR Green Pro Taq HS 預混型qPCR試劑盒(批號：A3A0768)均購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；引物購自美國Thermo公司；彗星試驗裂解液(批號：33489G15)、彗星試驗低熔點凝膠(批號：1548656)購自美國R&D Systems公司；CellTiter-Glo?3D Cell Viability Assay(貨號：G9681)購自美國Promega公司；Giemsa染液(貨號：G1015)購自北京索萊寶科技有限公司等。

1.1.2主要儀器 細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific FORMA STERI CYCLE CO2Incubator)、熒光定量PCR儀(AB/stepone)、生物安全柜(AIRTECH蘇凈安泰/BSC-1600 A2)、熒光酶標儀(Molecular Devices，IX6)、酶標儀(Molecular Devices，SpectraMax i3)；光學顯微鏡(Olympus，CX21和BX51)；彗星電泳儀(Trevigen)。

1.2 實驗方法

1.2.12D和3D細胞培養(yǎng)方法 復蘇HepG2細胞，培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的細胞以20 μL/滴、分別以5×107、1.25×108、2.5×108個·L-1的密度，接種至倒置培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)，皿底加PBS，單層置于培養(yǎng)箱。d 3轉(zhuǎn)移至超低吸附96孔U形底板中，培養(yǎng)14 d，得到3D肝細胞。

1.2.23D肝細胞模型的建立 當細胞單層匯合度達到80%～90%時，將平鋪生長的HepG2細胞消化后制成細胞懸液至15 mL的EP管中備用，并稀釋到相應(yīng)密度5×107、1.25×108、2.5×108L-1。預先在100 mm細胞培養(yǎng)皿底加入10 mL PBS緩沖液。使用多通道移液器，將上述細胞密度的細胞懸液以20 μL/滴接種至倒置的100 mm培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)，每個皿蓋可接種50滴。輕輕翻轉(zhuǎn)皿蓋置于皿底，并將含有懸滴的皿轉(zhuǎn)移至二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，單層水平放置。培養(yǎng)3 d后，懸滴內(nèi)部形成初始接種數(shù)為1×103、2.5×103、5×103個/滴的細胞球體。d 3時，將懸滴內(nèi)球體轉(zhuǎn)移至超低吸附U形底96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天更換一半培養(yǎng)基，直至d 14。

1.2.2.1 球體形態(tài)觀察 收集適當數(shù)目球體(n=8)，吸去上清液，用HBSS清洗2次；室溫下加入40 mg·L-1PI和20 mg·L-1FDA染液染色5 min；隨后吸去染液，用HBSS洗滌球體。熒光顯微鏡下觀察球體生長及隨時間的變化，使用DP2-BSW軟件測量球體直徑及面積。

1.2.2.2 上清液尿素和白蛋白含量測定 上清液尿素和白蛋白濃度按檢測試劑盒說明書進行檢測，分別在430 nm、620 nm測定吸光度值，計算得到尿素和白蛋白濃度。

1.2.2.3 Ⅰ 相及 Ⅱ相代謝酶基因表達量測定 將2D HepG2細胞及d 3、d 7的3D細胞球進行消化，測定細胞數(shù)量，提取RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄(37 ℃ 15 min ；85 ℃ 5 s；4 ℃)；使用SYBR Green?Premix Pro Taq HS qPCR Kit試劑與引物(Tab 1)及上步反應(yīng)制得的cDNA產(chǎn)物按比例預混，在Step One熒光定量PCR儀95 ℃ 30 s,1次循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s,40次循環(huán)，每樣本檢測3個復孔。根據(jù)RT- PCR檢測結(jié)果，以2D細胞樣品的基因表達作為對照，采用ΔΔCT法計算出各待測物的待測基因相對于內(nèi)參基因β-actin的相對表達量。

Tab 1 Primer sequences of Ⅰ phase and Ⅱ phase metabolic enzymes

1.2.33D肝細胞模型微核組學試驗方法的建立 CBMN-cyt的測定按照體外哺乳動物細胞微核試驗(OECD TG487, 2016)指南推薦的方法進行[8]。

1.2.3.1 陽性細胞模型的建立

1.2.3.1.1 2D細胞模型建立 每孔接種1×105個HepG2細胞于細胞培養(yǎng)板中，24 h后調(diào)整為含陽性對照(MMC)及終濃度為5 mg·L-1cyto-B的培養(yǎng)液。0、0.012 5、0.025、0.05、0.1和0.2 mg·L-1MMC均平行處理2孔。

1.2.3.1.2 陽性3D肝細胞模型建立 后續(xù)試驗使用3D細胞均為5 000個細胞/20 μL/滴，培養(yǎng)7 d 3D細胞球，盡可能吸去ULA96孔板原培養(yǎng)基，每孔分別加入0、0.012 5、0.025、0.05、0.1和0.2 mg·L-1MMC及終濃度為5 mg·L-1cyto-B的培養(yǎng)液，平行處理2孔。2D和3D肝細胞模型處理約48 h(>1.5個倍增周期)后棄去培養(yǎng)液。

1.2.3.2 制片及染色 收獲各個處理組的細胞，用37 ℃預熱0.56%氯化鉀室溫低滲細胞3～5 min，逐滴緩慢加入甲醇：冰醋酸(V/V=3 ∶1)3 mL固定，固定結(jié)束后離心，固定步驟重復2次。用離心管剩余少量固定液輕輕重懸細胞，以備滴片，室溫干燥。最后用Giemsa染液染色，封片保存。

1.2.3.3 顯微鏡檢指標 每張玻片計數(shù)每1 000個雙核細胞中微核(micronucleus，MN)、核芽(nuclear buds，Nbud)和核質(zhì)橋(nucleoplasmic bridges，NPB)，將同組兩張玻片(共2 000個雙核細胞)相加，計算雙核細胞MN、Nbud和NPB出現(xiàn)的千分率，并根據(jù)Fenech方法評分[9]。同時計數(shù)500個細胞中單核細胞、雙核細胞及多核細胞數(shù)，計算胞質(zhì)分裂阻滯增殖指數(shù)(cytokinesis-block proliferation index，CBPI)和復制指數(shù)(replicative index，RI)。

1.2.43D肝細胞模型彗星試驗方法的建立

1.2.4.1 細胞活力檢測 2D HepG2細胞在白色不透明底96孔平板中以1×104個/孔的密度接種后，培養(yǎng)24 h。2D和3D細胞使用不同濃度MMS(0、2.75、5.5、11、22 mg·L-1)處理24 h后，按照CellTiter-Glo 3D試劑盒步驟進行細胞活力檢測，測得相對發(fā)光值(elative light unit, RLU)并計算細胞活力。

1.2.4.2 制片、裂解、解旋、電泳、染色和觀察 在2D和3D肝細胞模型中分別加入含不同濃度MMS(0、2.75、5.5、11、22 mg·L-1)的培養(yǎng)液。含溶媒的完全DMEM培養(yǎng)基為溶媒對照組，作用約24 h后棄去培養(yǎng)液并收集細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，加入預冷DPBS并調(diào)整細胞密度至(4～6)×108·L-1。

將適量細胞懸液與預溫至37 ℃的低熔點膠混合，涂片，每組設(shè)4個復孔。隨后浸入預冷的裂解液中于2～8 ℃過夜裂解(16 h)隨后解旋20～30 min，電泳20 min，電泳條件為15 V，(300±10) mA。電泳后的玻片經(jīng)中和、無水乙醇脫水、干燥和熒光染色后采用Comet assay IV彗星分析軟件分析各濃度彗星尾DNA%。

1.3 統(tǒng)計學分析尿素、白蛋白、RT-PCR的結(jié)果均采用獨立樣本t檢驗的方法，3D肝細胞模型微核組學試驗采用Fisher精確檢驗；3D肝細胞模型彗星試驗細胞活力測定中，將RLU值根據(jù)公式換算成細胞活力，采用單因素方差分析(ANOVA)方法將各組數(shù)據(jù)與陰性對照組進行比較；彗星試驗結(jié)果計算每孔75個細胞的彗星尾DNA%的中位數(shù)，將受試物各劑量組的尾DNA%與溶媒對照組的尾DNA%進行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 3D肝細胞模型建立3D肝細胞球體及常規(guī)培養(yǎng)細胞的顯微鏡觀察結(jié)果顯示懸滴培養(yǎng)3 d的HepG2細胞在重力的作用下，自聚集形成了一個質(zhì)地緊密的細胞球體(Fig 1)。不同初始接種細胞密度的細胞球體在d 1～14均能保持良好的球體形態(tài)(Fig 2)。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞球體的直徑和面積迅速增大，d 7時增長逐漸緩慢，細胞球趨于穩(wěn)定(Fig 3A，B)。

Fig 1 2D HepG2 cells and 3D HepG2 spheres cultured for three days

Fig 2 Effect of initial seeding cell density on spherical growth and morphology

Fig 3 Change of diameter and area of sphere with incubation time

將大小相近但培養(yǎng)天數(shù)不同的兩個細胞球體進行對比，d 3和d 14的FDA染色結(jié)果相近(Fig 4A，C)，提示隨著培養(yǎng)時間的延長，球體內(nèi)細胞仍然存活；d 3的PI染色的紅色熒光較暗(Fig 4B)，而d 14的紅色熒光較強； 提示隨著培養(yǎng)時間的延長，球體內(nèi)部會逐漸形成壞死核心(Fig 4D)。

Fig 4 Cell survival rate and internal growth of 3D spheroids

使用白蛋白產(chǎn)生及尿素水平為檢測指標，比較不同培養(yǎng)方式的HepG2細胞的肝臟特異性功能的區(qū)別，數(shù)值歸一化為1×106個細胞。通過對d 3～14上清液樣本的測量，與2D細胞相比，3D培養(yǎng)的細胞上清白蛋白濃度顯著升高，d 7為最高值(Fig 5)。同時，3D球體上清的尿素含量在d 7達到最高值(Fig 5)。由于d 3、d 7的3D細胞球顯示出了更好的細胞功能，且培養(yǎng)時間較短，因此進一步選擇d 3、d 7的3D細胞球與2D細胞Ⅰ、Ⅱ期代謝酶基因表達量對比，選擇合適的3D細胞培養(yǎng)時間。

Fig 5 Comparison of urea and albumin concentration in supernatant between 2D cell model and 3D cell model with different culture time

實時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，3D HepG2球狀體中不同Ⅰ、Ⅱ期代謝酶的表達水平普遍高于2D培養(yǎng)的HepG2細胞(Fig 6)。系統(tǒng)分析球形體培養(yǎng)過程中I相代謝酶mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。培養(yǎng)天數(shù)為7 d的3D HepG2細胞的CYP1A1、CYP2C9、CYP2D6 、UGT1A6表達水平與2D細胞相比顯著性升高。

Fig 6 Real-time fluorescence quantitative PCR analysis of metabolic enzymes in 2D and 3D cultures

3D細胞最佳培養(yǎng)條件為5 000個細胞/20 μL/滴接種，培養(yǎng)7 d，作為接下來方法建立階段的3D細胞培養(yǎng)條件。

2.2 微核組學實驗結(jié)果2D模型組4個處理濃度下的MN‰、0.05、0.1 mg·L-1濃度組的Nbud‰顯著升高(P<0.05)，具有濃度相關(guān)性，NPB‰在0.025～0.1 mg·L-1有顯著性差異，但沒有濃度相關(guān)性(Tab 2)。3D肝細胞微核細胞組學各濃度的Cytostasis及RI與2D肝細胞模型組相當。3D肝細胞模型組4個MMC處理濃度下的MN‰與Nbud‰均見顯著升高(P<0.05)，NPB‰各濃度組均未見顯著升高(Tab 3)。3D模型組MMC的MN‰及Nbud‰最低檢出濃度為0.012 5 mg·L-1，而2D模型組最低檢出濃度為0.025 mg·L-1。

Tab 2 2D hepatocyte CBMN-cyt assay results of MMC

Tab 3 3D hepatocyte CBMN-cyt assay results of MMC

2.3 彗星實驗結(jié)果2D與3D肝細胞模型經(jīng)MMS處理24 h后同時進行細胞活力和DNA損傷檢測。0～22 mg·L-1各濃度 MMC同時作用于2D與3D細胞模型24 h后，2D和3D肝細胞模型組均未出現(xiàn)明顯的細胞毒性(Fig 7)。

Fig 7 Effect of MMS on 2D and 3D hepatocyte models’ cell viability

HepG2單層和球形細胞經(jīng)MMS處理24 h后經(jīng)DNA損傷檢測結(jié)果顯示。2D和3D培養(yǎng)物的溶劑對照的尾DNA%背景水平在相同的范圍內(nèi)。在2D模型組中，22.0 mg·L-1MMS組的DNA損傷相對于對照組明顯增加(P<0.05)。在3D模型組中，5.5 mg·L-1MMS組的DNA損傷相對于對照組明顯增加(P<0.01)(Fig 8)。

Fig 8 DNA damage in MMS exposed 2D and 3D hepatocyte models measured by comet assay n=4)

3 討論

3.1 3D肝細胞模型的建立目前體外哺乳動物細胞模型的主要缺陷是未能充分反映人體內(nèi)的毒性反應(yīng)。本研究中，采用人肝癌細胞系HepG2細胞作為材料，使用懸滴與超低吸附培養(yǎng)結(jié)合的無支架培養(yǎng)方式構(gòu)建了3D細胞模型。該方法與標準96孔試驗板和自動化設(shè)備的兼容性使其適合于高通量的毒性篩選。建立3D肝細胞模型的影響因素包括以下幾個方面：(1)細胞：細胞自身代謝能力與培養(yǎng)成本影響后續(xù)實驗模型的可用性。HepG2細胞是研究最為充分的人源化肝細胞，具有一定自身代謝活化能力與低培養(yǎng)成本的優(yōu)點。(2)培養(yǎng)基：培養(yǎng)基成分的改變會影響實驗重復性，3D細胞培養(yǎng)選用與常規(guī)2D培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基。(3)培養(yǎng)方式：已有的建立3D肝細胞遺傳毒性檢測模型采用懸滴法進行培養(yǎng)[6]，但由于營養(yǎng)物質(zhì)減少且無法更換培養(yǎng)基，不適用于長期培養(yǎng)及后續(xù)添加試劑進行細胞活力和遺傳毒性檢測[10]。在本研究中，將懸滴培養(yǎng)至3 d的細胞球體接種至ULA超低吸附96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，可以實現(xiàn)延長培養(yǎng)時間。(4)初始細胞接種數(shù)：初始細胞接種數(shù)影響球體大小及細胞團內(nèi)外的物質(zhì)運輸?shù)哪芰?。以現(xiàn)研究數(shù)據(jù)為依據(jù)[6,10]，本研究選擇(1～5)×103個細胞/20 μL/滴作為細胞接種條件，使用顯微鏡觀察及免疫熒光染色法來觀察細胞球的生長規(guī)律及內(nèi)部細胞壞死情況，選擇最佳的接種數(shù)。對同時接種的HepG2球體進行連續(xù)觀測拍照記錄3、5、7、10、14 d的細胞球面積及直徑發(fā)現(xiàn)，細胞球體的直徑和面積隨培養(yǎng)時間延長迅速增大，在d 7時增長逐漸緩慢，細胞球趨于穩(wěn)定。5×103個/滴的球體增長平穩(wěn)，球體形態(tài)在培養(yǎng)過程中更為為穩(wěn)定。用FDA和PI染色對活細胞(綠色)和死細胞(紅色)染色，在熒光顯微鏡下進行觀察，可以看到隨著培養(yǎng)時間的延長，球體內(nèi)部由于物質(zhì)轉(zhuǎn)運受阻逐漸形成壞死核心。綜合對3D細胞球體長期生長狀態(tài)及活死細胞的觀察，最終選擇初始接種條件為5×103個細胞/20 μL/滴進行后續(xù)實驗。該培養(yǎng)條件下球體直徑控制在500～700 μm，在已有研究對于3D細胞球體的參考直徑范圍內(nèi)[11-12]。球體形態(tài)穩(wěn)定，且可實現(xiàn)長期培養(yǎng)，滿足后續(xù)彗星和微核試驗所需細胞數(shù)。(5)培養(yǎng)時間：肝細胞球體的形成、維持和成熟需要一定的培養(yǎng)時間，可使細胞產(chǎn)生與人體細胞更為接近的生理功能。本實驗中，同一球狀體的形態(tài)變化是從質(zhì)地松散的不規(guī)則球體逐漸壓實成質(zhì)地緊密形狀規(guī)則的橢球體，7 d后球體增長趨勢變緩，與文獻中的描述一致[13]。由于球體微結(jié)構(gòu)和功能的進一步分化會改變物質(zhì)向球體內(nèi)部擴散的效率和影響藥物代謝，因此球體的生長會直接影響藥物的作用。白蛋白的產(chǎn)生、尿素的分泌是肝臟代謝活動的一個指標，結(jié)合尿素及白蛋白的測量結(jié)果，d 7為肝特異性產(chǎn)物表達最高的培養(yǎng)時間，提示HepG2細胞在3D培養(yǎng)環(huán)境中發(fā)生了聚集與分化，具備了一定的代謝功能，3D環(huán)境更有利于細胞功能的產(chǎn)生。通過Ⅰ相及Ⅱ相藥物代謝酶基因RT-PCR結(jié)果分析，培養(yǎng)7 d的3D HepG2細胞的CYP1A1、CYP2C9、CYP2D6表達水平與2D細胞相比顯著性增加。

綜合建立3D肝細胞模型的影響因素，3D肝細胞模型的最佳培養(yǎng)條件為5 000個細胞/20 μL/滴接種，培養(yǎng)7 d?；趧游飩惱韺W “減少、替代、優(yōu)化”3R原則，3D細胞培養(yǎng)技術(shù)有望發(fā)展成為替代動物實驗的體外實驗方法。

3.2 3D肝細胞微核組學試驗方法MMC作用于2種細胞模型，細胞毒性指標100-RI與Cytostasis都出現(xiàn)濃度相關(guān)性上升，2種細胞模型均出現(xiàn)相似程度的細胞損傷。3D模型組MMC的MN‰及Nbud‰最低檢出濃度為0.012 5 mg·L-1，而2D模型組最低檢出濃度為0.025 mg·L-1，提示3D細胞模型在檢測MMC時，MN及Nbud靈敏度高于2D細胞模型。NPB‰未在3D細胞模型該濃度范圍內(nèi)有顯著性差異，在2D細胞模型中檢出但不具有劑量相關(guān)性，且NPB的值落在外周血淋巴細胞CBMN-cyt試驗0～10‰的陰性參考范圍內(nèi)[14]。提示MMC可能在HepG2細胞中未通過誘導DNA鏈斷裂錯誤和端粒末端融合造成遺傳毒性損傷。與已有HepG2及衍生細胞系的微核細胞組學研究結(jié)果相似[9,15]。即2D及3D培養(yǎng)的HepG2細胞模型經(jīng)MMC處理后可于一定細胞毒性范圍內(nèi)檢測到微核細胞組學指標明顯升高。

本研究使用MMC同時作用于2D和3D肝細胞模型，成功建立了3D肝細胞微核組學試驗方法。MMC是一種抗腫瘤藥物，體外微核試驗為陽性。它作為一種烷基化劑可以交聯(lián)互補的DNA復制體，從而影響核酸的合成和功能。MN、NPB和Nbud是癌癥中常見的核異?，F(xiàn)象，代表一種常見的染色體不穩(wěn)定的細胞表型。染色體不穩(wěn)定會導致細胞的基因量改變，并具有迅速進化和突變的潛力，從而形成各種異常的基因型[16]。

3.3 3D肝細胞彗星試驗方法在非細胞毒性濃度下，MMS能夠誘導2D和3D HepG2培養(yǎng)物的尾DNA%增加，并具有濃度相關(guān)性。2D模型22 mg·L-1MMS組與3D模型 5.5 mg·L-1MMS組與對照組相比尾DNA%差異均有顯著性。3D肝細胞模型對MMS遺傳毒性檢測靈敏度高于2D細胞。同時發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的二維單層細胞培養(yǎng)相比，3D肝細胞彗星尾DNA%具有更高的離散度(Fig 9)。這是由于3D細胞球體作為一個整體暴露于化合物時，不同部分細胞的化合物暴露水平不一，因此受到的DNA損傷水平不一。

Fig 9 2D and 3D hepatocyte comet assay tail DNA% scatter distribution diagram(MMS 22 mg·L-1, n=75, median and range)

本研究使用MMS同時作用于2D和3D肝細胞模型，成功建立了3D肝細胞彗星試驗方法。MMS是一種甲基化DNA堿基的誘變化合物，可導致DNA單鏈斷裂、染色體斷裂、微核形成，最終導致細胞死亡[17]。3D肝細胞模型應(yīng)用于彗星實驗，減少了體內(nèi)研究和基于2D細胞培養(yǎng)的體外彗星試驗數(shù)據(jù)之間的差距。

3.4 總結(jié)本文初步建立了懸滴法與超低吸附培養(yǎng)相結(jié)合的3D HepG2細胞模型，基于3D肝細胞模型的微核細胞組學和彗星試驗方法也表現(xiàn)出較高靈敏度。與標準96孔試驗板和自動化設(shè)備的兼容性使其適合于高通量的毒性篩選，提高了其安全性評估研究的總體適宜性。