內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝與病理性血管生成

李 洋，周媛媛，夏思偉，陳 利，楊 婷，張 峰，鄭仕中

(南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥藥效與安全性評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

1 血管生成概述

血管是生物運(yùn)送血液的管道，在為機(jī)體提供氧氣和營養(yǎng)的同時，也為免疫監(jiān)視提供通道。血管遍布所有組織器官，其結(jié)構(gòu)或功能性血管異常將會引發(fā)多種疾病。血管維持或生長不足會導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病、心肌梗死或局部缺血性疾病，血管的過度生長或結(jié)構(gòu)異常也會導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，包括癌癥、炎癥性疾病和動脈高壓等[1]。近年來，血管生成越來越多地被描述為原始血管網(wǎng)生長和再塑形成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的過程，該過程包括基底膜被蛋白溶解，細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、血管管腔形成以及新生血管吻合成網(wǎng)等關(guān)鍵步驟[2]。其復(fù)雜的形成過程導(dǎo)致血管的形成與發(fā)展易受多種因素的影響，包括促血管生成因子：血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素(angiopoietins)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)和成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)等[3]，血管生成抑制因子如內(nèi)皮抑素、血管抑制素和TNP-470(煙曲霉素的類似物，一種抗血管生成藥物)等，除此外還包括炎癥因子、內(nèi)皮代謝[4]等。內(nèi)皮代謝在血管生成中的作用舉足輕重，內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)需協(xié)調(diào)細(xì)胞新陳代謝，使代謝通量適應(yīng)分支血管不斷增加的能量和生物量需求[4]。因此，從內(nèi)皮能量代謝入手尋找病理性血管生成的解決方法具有重要意義。

2 內(nèi)皮代謝與病理性血管生成

2.1 內(nèi)皮糖代謝與病理性血管生成ECs單層覆蓋于血管內(nèi)壁上，是血流和周圍組織間營養(yǎng)和氧氣交換所必需的。在病理性血管生成的刺激反應(yīng)中，內(nèi)皮細(xì)胞將從靜止?fàn)顟B(tài)迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋澈瓦w移狀態(tài)，而內(nèi)皮細(xì)胞獨(dú)特的糖酵解特性對細(xì)胞增殖、遷移和對環(huán)境變化的反應(yīng)至關(guān)重要[5]。糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)是內(nèi)皮細(xì)胞的兩個主要能量產(chǎn)生途徑，但通常情況下，在血管新生期間，約85%的三磷酸腺苷(ATP)是通過人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的糖酵解途徑產(chǎn)生的[6]。與無氧糖酵解(即在缺氧下發(fā)生的糖酵解)不同，有氧糖酵解可繞過線粒體OXPHOS，促進(jìn)葡萄糖水解速率的增加，加快供能速率，因此病理性的血管生成更依賴于有氧糖酵解提供能量。

有氧糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸可以通過介導(dǎo)VEGF和纖溶酶原激活物抑制劑-1在肝癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄來誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)并加速血管生成過程[7]。丙酮酸激酶M2(PKM2)是調(diào)節(jié)有氧糖酵解最后一步的關(guān)鍵酶，Ren等[8]通過管形成試驗(yàn)、傷口愈合試驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)評估PKM2對血管生成的作用，并通過蛋白質(zhì)印跡分析、流式細(xì)胞術(shù)、線粒體膜電位檢測、活性氧檢測、免疫熒光染色和定量實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)來研究PKM2調(diào)節(jié)血管駐留內(nèi)皮祖細(xì)胞血管生成的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)PKM2的激活可以通過調(diào)節(jié)糖酵解、線粒體裂變和融合來促進(jìn)血管駐留內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和血管生成分化。Den等[9]通過IHC染色檢測皮下腫瘤中Dickkopf相關(guān)蛋白2(DKK2)和內(nèi)皮轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮轉(zhuǎn)錄因子和微血管的形成與DKK2的表達(dá)呈正相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DKK2通過有氧糖酵解從葡萄糖中產(chǎn)生乳酸并在腫瘤微環(huán)境中積累，并且可以與葡萄糖攝取所需的脂蛋白受體相關(guān)蛋白6協(xié)同作用，激活下游的mTOR信號通路，進(jìn)一步加速乳酸分泌，而乳酸作為DDK2的最終執(zhí)行者刺激內(nèi)皮細(xì)胞的管形成從而促進(jìn)腫瘤的血管生成。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶(PFKFB3)是內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解的關(guān)鍵酶，其能夠?qū)Cs的多種細(xì)胞發(fā)生過程產(chǎn)生影響并最終影響血管生成：PFKFB3能夠更快地產(chǎn)生ECs增殖所需的能量并促進(jìn)葡萄糖的吸收，從而為血管的發(fā)芽行為實(shí)現(xiàn)更多的能量產(chǎn)生；高水平的核PFKFB3促進(jìn)ECs的生長，對維持ECs的細(xì)胞狀態(tài)具有重要的幫助作用；PFKFB3的沉默會降低糖酵解通量，損害尖端細(xì)胞的競爭力和莖細(xì)胞增殖，ECs中絲狀偽足和片狀偽足的形成也會受到損傷等[10]。

許多藥物治療血管生成相關(guān)疾病的機(jī)制也與有氧糖酵解緊密相關(guān)。白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)ERK介導(dǎo)的PKM2核易位降低葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、磷酸果糖激酶-1、己糖激酶2和PKM2等有氧糖酵解關(guān)鍵酶活性來抑制人內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成[11]。斑蝥素通過降低細(xì)胞外酸化率，增加高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的耗氧率抑制有氧糖酵解，從而顯著抑制了血管生成的侵襲[12]。以上結(jié)果均表明，有氧糖酵解在病理性血管生成發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，并且通過藥理學(xué)手段削弱有氧糖酵解過程相關(guān)因子的表達(dá)，對血管生成相關(guān)疾病起到明顯的治療作用。因此，進(jìn)一步以有氧糖酵解為切入點(diǎn)探究病理性血管生成治療藥物具有重要意義。

2.2 內(nèi)皮氨基酸代謝與病理性血管生成內(nèi)皮細(xì)胞的代謝被認(rèn)為是血管生成的驅(qū)動力，盡管有氧糖酵解在血管生成過程中至關(guān)重要，但它不是唯一的代謝決定因素，最近的研究表明，除了糖酵解和脂肪酸氧化外，內(nèi)皮細(xì)胞還依賴特定的氨基酸來增殖、遷移和存活，因此氨基酸代謝在調(diào)節(jié)和維持血管功能方面也發(fā)揮著重要作用[13]。高水平的不對稱二甲基精氨酸(ADMA)是損害血管生成的重要因素。據(jù)報(bào)道，小鼠體內(nèi)ADMA的缺乏強(qiáng)烈誘導(dǎo)了血管生成，而心肌營養(yǎng)素-1的過度表達(dá)對ADMA的抑制導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖以及血管形成的增加[14]。羥脯氨酸是動物體內(nèi)結(jié)構(gòu)和生理上重要的亞氨基酸，其轉(zhuǎn)化生成的甘氨酸除了促進(jìn)谷胱甘肽、DNA、血紅素和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生外，還能夠抑制血管內(nèi)皮生長因子介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，對血管生成產(chǎn)生負(fù)面作用[13，15]。L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(LAT1)介導(dǎo)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)是支持體外內(nèi)皮細(xì)胞增殖和翻譯起始的基礎(chǔ)，Quan等[16]在小鼠腫瘤模型中觀察到高內(nèi)皮LAT1表達(dá)。通過廢除LAT1的功能或抑制其表達(dá)后發(fā)現(xiàn)體內(nèi)外的血管生成受到抑制。此外，LAT1是VEGF-A依賴性遷移、侵襲、管形成所必需的，這表明內(nèi)皮細(xì)胞中促血管生成信號傳導(dǎo)和能量代謝之間存在交互作用。

谷氨酰胺(glutamine，Gln)代謝在血管生成中的作用更加豐富。Gln提供ECs的三羧酸循環(huán)中的大部分碳，并通過還原羧化作用促進(jìn)脂質(zhì)生物合成。Kim等[17]發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞培養(yǎng)中，Gln剝奪或谷氨酰胺酶的抑制會阻止ECs增殖，谷氨酰胺酶在小鼠EC中的特異性缺失顯著減弱了血管生成。由基因 GLUL編碼的谷氨酰胺合成酶是一種將谷氨酸和氨轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺的酶，它由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。Eelen等[18]在小鼠中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞中Glul的基因缺失會損害血管發(fā)育過程中的血管萌發(fā)，而谷氨酰胺合成酶的藥理學(xué)阻斷抑制眼部和炎癥性皮膚病中的血管生成。Gln是內(nèi)皮細(xì)胞消耗最多的一種氨基酸，內(nèi)皮細(xì)胞通過Gln產(chǎn)生的谷胱甘肽(glutathione，GSH)用于氧化還原穩(wěn)態(tài)，Gln的耗竭使內(nèi)皮細(xì)胞容易受到活性氧誘導(dǎo)的損傷，以川芎嗪-樺木酸衍生物(BA-12)為例。Cui等[19]基于UPLC-QTOF-MS的靶向代謝組學(xué)和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，檢測了GSH代謝相關(guān)指標(biāo)以驗(yàn)證BA-12治療血管生成的主要機(jī)制，發(fā)現(xiàn)檢測樣品中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶和磷脂酶A2的活性顯著升高，而γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性沒有顯著變化，表明BA-12導(dǎo)致GSH代謝的激活，過氧化產(chǎn)物的增加和抗氧化指標(biāo)的顯著降低表明氧化還原平衡受到進(jìn)一步影響，二者共同導(dǎo)致了血管生成的抑制。Gln分解代謝產(chǎn)生的谷氨酸可以轉(zhuǎn)化為鳥氨酸，產(chǎn)生促血管生成因子，如一氧化氮和多胺[20]。谷氨酰胺缺失或抑制谷氨酰胺合成酶會由于增殖和遷移受損而導(dǎo)致血管發(fā)芽缺陷，減少病理性血管生成[21]。

2.3 內(nèi)皮脂質(zhì)代謝與病理性血管生成越來越多的證據(jù)表明內(nèi)皮功能障礙與脂質(zhì)代謝異常之間存在密切關(guān)系。Liang等[22]發(fā)現(xiàn)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露于重金屬鎘(Cd)24 h后，內(nèi)皮功能嚴(yán)重受損并最終導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡。鎘暴露通過破壞人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，具體表現(xiàn)為Cd加速了甘油三酯的分解并導(dǎo)致游離脂肪酸的積累，脂肪酸氧化受損進(jìn)一步誘導(dǎo)了活性氧的產(chǎn)生和線粒體功能障礙，并最終導(dǎo)致了細(xì)胞死亡。脂質(zhì)過載與影響細(xì)胞信號活動和內(nèi)皮功能的內(nèi)皮表觀遺傳狀態(tài)的變化密切相關(guān)。Chen等[23]通過高脂飲食誘導(dǎo)小鼠脂質(zhì)超負(fù)荷狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)與喂食正常食物的小鼠相比，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠表現(xiàn)出血管生成缺陷，具體表現(xiàn)為后肢缺血后血流恢復(fù)速度較慢、皮膚損傷后傷口愈合速度降低以及受傷的組織中毛細(xì)血管密度下降等。而通過過表達(dá)激活轉(zhuǎn)錄因子4增加了其與甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2A的結(jié)合，誘導(dǎo)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2A恢復(fù)因脂質(zhì)過載導(dǎo)致的NOS3和ERK1基因調(diào)控區(qū)的H3K4甲基化水平的降低和血管生成信號的活性，改善了鈍化的血管生成反應(yīng)。以上結(jié)果表明，脂質(zhì)過載環(huán)境導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)血管生成信號的表觀遺傳狀態(tài)改變，這為具有脂質(zhì)超負(fù)荷的疾病如肥胖和糖尿病的血管并發(fā)癥具有重要的潛在治療意義。

由膽堿-乙醇胺磷酸轉(zhuǎn)移酶1(CEPT1)介導(dǎo)的從頭磷脂生成對于肝臟中過氧化物酶體增殖物激活受體α (peroxisome proliferators-activated receptor α,PPARα)等轉(zhuǎn)錄因子的磷脂激活至關(guān)重要。Zayed等[24]通過誘導(dǎo)VE-鈣粘蛋白-他莫昔芬誘導(dǎo)型Cre重組酶介導(dǎo)的重組(Cept1Lp/LpCre+)構(gòu)建了特異性缺失CEPT1的ECs，發(fā)現(xiàn)CEPT1的特異性缺失降低了ECs增殖、遷移和小管形成，且Cept1Lp/LpCre+小鼠缺血后肢的灌注和血管生成減少。其中機(jī)制包括CEPT1影響ECs中的PPARα磷酸化，PARα激動劑非諾貝特可以在Cept1減少的情況下挽救ECs功能、后肢灌注和PPARα激活表達(dá)證明了這一點(diǎn)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，參與磷脂生成的病理代謝途徑在ECs功能和缺血性損傷后的恢復(fù)中發(fā)揮重要作用。

內(nèi)皮細(xì)胞脂肪酸代謝也是影響病理性血管生成的代謝過程的重要部分。內(nèi)皮細(xì)胞對脂肪酸代謝的利用與其他細(xì)胞不同，它需要從血液中被動擴(kuò)散或運(yùn)輸脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行脂肪酸氧化[25]。攝取脂肪酸是細(xì)胞利用脂肪酸的第一步，也是代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[26]。在細(xì)胞內(nèi)，非游離脂肪酸需與脂肪酸結(jié)合蛋白結(jié)合才能被轉(zhuǎn)運(yùn)至目的地。脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid-binding protein 4, FABP4)是一種脂肪酸分子伴侶，在體內(nèi)沉默F(xiàn)ABP4后觀察到了微血管密度的顯著下降，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)FABP4的沉默抑制內(nèi)皮芽體外伸長，VEGF和DLL4-Notch1信號通路的相互作用被擾亂，導(dǎo)致血管萌發(fā)和血管生成的減少[27]。肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A(CPT1A)是脂肪酸代謝途徑的限速酶，CPT1A的內(nèi)皮損失通過增加內(nèi)皮氧化應(yīng)激促進(jìn)EC功能障礙，Shi等[28]發(fā)現(xiàn)，對CPT1A進(jìn)行藥物阻斷會損害中藥丹氣丸的促血管生成作用，證明了FAO在血管生成過程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。另外，ECs中的脂肪酸合酶缺失會引起丙二酰輔酶A水平升高，導(dǎo)致在賴氨酸1218處的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)丙二?；?，降低mTOR復(fù)合物1的活性，mTOR相關(guān)通路受阻，ECs增殖和血管發(fā)芽受到抑制，導(dǎo)致體內(nèi)血管生成受到損害，且脂肪酸合酶阻斷劑可減少病理性眼部新生血管形成[29]。IL-17A是調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞因子，Wang等[30]通過植入轉(zhuǎn)染IL-17A表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體的人肺癌細(xì)胞株H460建立異種移植模型，觀察IL-17A對HUVECs出芽和管腔形成的影響，發(fā)現(xiàn)IL-17A在體內(nèi)和體外激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路促進(jìn)FAO，增加內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體呼吸刺激H460腫瘤生長和新血管生成。

3 結(jié)語與展望

內(nèi)皮細(xì)胞代謝是血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，也是血管生成相關(guān)疾病的有效治療靶點(diǎn)。在這里，我們列舉和描述不同的代謝途徑通過影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能進(jìn)而對病理性血管生成進(jìn)程起到?jīng)Q定性作用。事實(shí)上，內(nèi)皮代謝遠(yuǎn)非簡單地刺激細(xì)胞生長和遷移的教條觀點(diǎn)，復(fù)雜的疾病環(huán)境對內(nèi)皮細(xì)胞的影響是多層次的，不同血管床中EC具有異質(zhì)性，轉(zhuǎn)化為功能和表型的差異，因此來自不同組織的ECs的代謝不可一概而論，且內(nèi)皮細(xì)胞的代謝也會通過細(xì)胞間通訊對其他細(xì)胞的正常功能產(chǎn)生影響。因此需要幾種代謝途徑與生長因子、遺傳信號平行作用，以維持內(nèi)皮細(xì)胞正常生物學(xué)行為。當(dāng)內(nèi)皮代謝紊亂使內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，并導(dǎo)致嚴(yán)重疾病時，這一概念變得更加重要。隨著內(nèi)皮糖酵解和脂肪酸代謝過程被開創(chuàng)性地轉(zhuǎn)化為這些疾病的可能治療途徑，其他代謝途徑在血管生成中作用的研究也逐漸引起了研究人員的關(guān)注。深入研究內(nèi)皮代謝不僅能夠?yàn)檠邪l(fā)抗病理性血管新生的藥物提供強(qiáng)有力的依據(jù)，同時對各種血管生成相關(guān)疾病的診斷、治療提供有益的幫助，具有不可忽視的現(xiàn)實(shí)意義。