張豪 李哲 郭凱 黃艷華 郝永任

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物研究所，濟(jì)南 250014）

木霉（Trichoderma spp.）屬于半知菌類的絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、木霉屬，廣泛分布于自然界中，是土壤微生物群落的重要組成部分［1］。木霉是一種多功能絲狀真菌，在植物促生抗逆、生物防治、纖維素酶生產(chǎn)和生物質(zhì)利用等方面有著廣泛用途。

木霉菌作為生防菌株已得到廣泛認(rèn)可，其對(duì)植物病原真菌的拮抗機(jī)制包含競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用及抗生作用等［2］。木霉還可以產(chǎn)生一些拮抗性物質(zhì)和次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)其他微生物產(chǎn)生毒害，抑制其他微生物的蛋白質(zhì)表達(dá)，從而抑制其他微生物的生長(zhǎng)。一些研究已經(jīng)表明木霉對(duì)黑曲霉菌［3］、尖孢鐮刀菌［4］、炭疽病［5］、菌核病病菌［6］具有拮抗作用。

木霉在自然界分布廣泛，常腐生于木材、種子及植物殘?bào)w上，生長(zhǎng)迅速［7］，且對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要求低，分泌豐富的纖維素酶系，可在植物殘?bào)w和土壤等含有有機(jī)質(zhì)的環(huán)境中通過(guò)菌絲體和繁殖孢子存活，適應(yīng)力強(qiáng)。另外，近年來(lái)越來(lái)越多的報(bào)道指出，木霉菌能夠很好地在植物根部定殖并快速生長(zhǎng)，并能伴隨根系的生長(zhǎng)而拓展［8-9］，較好地促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)和抗病性［10］。大量研究表明，木霉可以誘導(dǎo)根際微生物群落組成發(fā)生變化，增強(qiáng)養(yǎng)分吸收，穩(wěn)定土壤養(yǎng)分，促進(jìn)側(cè)根發(fā)育，增加根毛形成［11-12］。同時(shí)，木霉還能提高植物耐受非生物脅迫的能力，包括一些鹽堿脅迫、干旱脅迫［13］、重金屬離子脅迫［14］等。因此，木霉已經(jīng)被制成孢子粉、發(fā)酵液等多種制劑，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

研究表明，生長(zhǎng)素介導(dǎo)的信號(hào)通路是調(diào)控木霉生防促生能力的主要方式［15］。木霉處理可以提高植物體內(nèi)生長(zhǎng)素的水平，同時(shí)在多種木霉菌的代謝產(chǎn)物中也能夠檢測(cè)到生長(zhǎng)素的水平。另外，在多種木霉菌的代謝產(chǎn)物中還分離純化出了木霉特有的類植物生長(zhǎng)素6-PP［16］，它不僅能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，還能減少植物病害的發(fā)生［17］。

木質(zhì)纖維素是地球上含量最豐富的可再生資源，其降解主要由以木霉屬、曲霉屬和青霉屬為代表的絲狀真菌完成。其中木霉屬被公認(rèn)是產(chǎn)纖維素酶最高的菌種之一，是當(dāng)前生產(chǎn)上應(yīng)用較多的菌種［18-19］。里氏木霉和綠色木霉是木霉屬中纖維素酶的有效生產(chǎn)者，是現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)線上不可缺少的“生物機(jī)器”［20-21］。同時(shí)，也有研究表明，木霉通過(guò)分泌纖維素酶分解植物細(xì)胞壁，從而實(shí)現(xiàn)更好的根系定殖效果［22］。木霉在產(chǎn)纖維素酶方面具有菌體生長(zhǎng)量大且迅速、酶系齊全、產(chǎn)酶量大、酶活性高、降解木質(zhì)纖維素能力強(qiáng)、綠色高效以及自身生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

組蛋白的翻譯后修飾在染色質(zhì)調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。它確保開(kāi)放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的保真度，增加基因表達(dá)和其他DNA活動(dòng)［23-24］。GCN5是第一個(gè)被鑒定的組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶［25］，屬于GCN5相關(guān)的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（GNAT）超家族［26］，最初是從氨基酸合成缺陷的酵母突變體中鑒定出來(lái)的［27］，被確認(rèn)為是組蛋白乙?；揎椀谋匦钘l件。GCN5通過(guò)催化核心組蛋白N末端尾部特定賴氨酸殘基的乙?；鴧⑴c染色質(zhì)修飾［28］。在釀酒酵母、曲霉菌以及木霉菌的研究中表明，GCN5對(duì)于維持全基因組組蛋白乙酰化的基礎(chǔ)水平具有決定性的作用，但是其在絲狀真菌生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控等方面的功能研究還比較少。Xin等［28］通過(guò)序列比對(duì)和功能分析鑒定了釀酒酵母GCN5的里氏木霉直系同源物，并構(gòu)建了里氏木霉GCN5缺失突變株，對(duì)里氏木霉纖維素酶活性和乙?；降葴y(cè)定后，發(fā)現(xiàn)里氏木霉TrGCN5在絲狀生長(zhǎng)、形態(tài)發(fā)生和包括纖維素酶編碼基因在內(nèi)的特定基因的轉(zhuǎn)錄激活中起著關(guān)鍵作用。Zheng等［29］通過(guò)銅抑制現(xiàn)象實(shí)現(xiàn)了木霉GCN5缺失的效果，從而降低了木霉的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量，而且還嚴(yán)重?fù)p害了木霉纖維素酶基因的表達(dá)。

木霉體內(nèi)代謝途徑豐富，代謝產(chǎn)物繁多，其基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受到復(fù)雜而嚴(yán)格的調(diào)控［30-31］。利用基因組分析和基因工程技術(shù)，發(fā)掘木霉中重要的代謝途徑和功能基因，是對(duì)木霉進(jìn)行遺傳改良的有效途徑。本文鑒定了綠色木霉Tv-1511中的組蛋白乙?；幋a酶基因TvGCN5，并對(duì)TvGCN5在木霉促生抗逆、次級(jí)代謝以及產(chǎn)纖維素酶等方面的功能進(jìn)行了分析和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 綠色木霉（Trichoderma viride）Tv-1511，本實(shí)驗(yàn)分離保存，在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心的保藏號(hào)為CGMCC No. 16800，保藏日期為2018年12月04日，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基均是購(gòu)買于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。PDA培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯浸粉6.0，葡萄糖20.0，瓊脂20.0。LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，氯化鈉10.0，瓊脂15.0。

1.1.3 試劑 潮霉素；氨芐青霉素。溶液A：1.2 mol/L D-sorbitol，0.1 mol/L KH2PO4，pH 5.6。溶解酶液：取0.15 g 溶解酶（lysing enzyme，Sigma：L1412）溶于20 mL溶液A，0.2 μmol/L濾膜過(guò)濾除菌。溶液B：1 mol/L sorbitol，50 mmol/L CaCl2，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5。PEG溶 液：25% PEG600，50 mmol/L CaCl2，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5。

1.2 方法

1.2.1 綠色木霉TvGCN5基因缺失工程菌構(gòu)建 （1）敲除片段構(gòu)建：以綠色木霉Tv-1511基因組DNA為模板，擴(kuò)增TvGCN5基因的上游片段和下游片段，敲除片段擴(kuò)增引物分別為：上游片段擴(kuò)增引物TvGCN5-up-F：ACAGTGGGATTTGGAAGTTGGGAT和TvGCN5-up-R：GCCATATTGATGTAAGGTAGCTCAGGTGGAATTAGGTGAGGTAGAGAC；下游片段擴(kuò)增引物TvGCN5-down-F：GGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCCATGTCACGAAAGGGTTT GGTGGTAT和TvGCN5-down-R：GTGTTGGACGAAGAATGGGAGCAGT。以線性化的pBARGPE1-Hygro質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增潮霉素抗性基因（HygR），擴(kuò)增引物為HygR-F：GAGAGCTACCTTACATCAATATGGC和HygR-R：GGTACTATGGCTTAGATGGAATACCC。通過(guò)融合PCR構(gòu)建敲除片段，將PCR產(chǎn)物純化回收。（2）原生質(zhì)體制備：接種Tv-1511于PDA平板，28℃培養(yǎng)10 d后，收集分生孢子。在玻璃紙覆蓋的PDA平板上，涂布孢子懸液，待PDA平板上的孢子萌發(fā)后，將長(zhǎng)有菌絲的纖維膜取出并反向貼在含有溶解酶液的平板上，裂解菌絲，收集原生質(zhì)體，并稀釋至107個(gè)/mL。（3）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及突變子篩選：在離心管中加入原生質(zhì)懸浮液、純化的PCR產(chǎn)物、PEG溶液，用槍頭混勻，冰上放置20 min，常溫下放置5 min，輕輕混勻后將混合液涂布在覆蓋層析紙的含1 mol/L蔗糖PDA平板上，待萌發(fā)后，將條形層析紙轉(zhuǎn)到含抗生素的PDA平板上，挑取菌落，轉(zhuǎn)接至新鮮的抗生素平板上，培養(yǎng)2 d，篩選并鑒定突變子。

1.2.2 綠色木霉TvGCN5基因過(guò)表達(dá)工程菌構(gòu)建 （1）TvGCN5基因表達(dá)盒的克隆：以綠色木霉Tv-1511基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)獲得帶有酶切連接位點(diǎn)（BamH I和EcoR I）的TvGCN5基因表達(dá)盒，利用DNA回收試劑盒回收擴(kuò)增出的DNA片段。連接T載體，測(cè)序驗(yàn)證序列的正確性。擴(kuò)增引物分別為TvGCN5-FL-BamHI-F：CGGGATCCATGGCTGAC GTTAAAGAAGA和TvGCN5-FL-EcoRI-R：CGGAATTCCTACTTCTCCGGCTCGAG。（2）過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化：將酶切回收得到的TvGCN5基因表達(dá)盒和載體pBARGPE1切膠并回收，利用T4連接酶試劑盒進(jìn)行DNA片段和表達(dá)載體的連接。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并在抗性LB平板上篩選，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。用質(zhì)粒大提試劑盒提取后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的表達(dá)載體為pBARGPE1-Hygro-TvGCN5，保存?zhèn)溆?。?）過(guò)表達(dá)工程菌的構(gòu)建及驗(yàn)證：按照1.2.1的方法制備原生質(zhì)體，用BamH I酶切表達(dá)載體pBARGPE1- Hygro-TvGCN5，獲得線性化質(zhì)粒。在離心管中加入原生質(zhì)懸浮液、純化的PCR產(chǎn)物、PEG溶液，用槍頭混勻，冰上放置20 min，常溫下放置5 min，輕輕混勻后將混合液涂布在覆蓋層析紙的含1 mol/L蔗糖PDA平板上，待萌發(fā)后，將條形層析紙轉(zhuǎn)到含抗生素的PDA平板上，挑取菌落，轉(zhuǎn)接至新鮮的抗生素平板上，培養(yǎng)2 d，篩選并鑒定突變子。

1.2.3 綠色木霉TvGCN5基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和蛋白表達(dá)水平分析 將100 μL木霉原始菌株（wildtype）和突變工程菌（Tv-1511-△GCN5和Tv-1511-GCN5-OE）的孢子液分別接種于PDB液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min培養(yǎng)48 h，通過(guò)4層無(wú)菌紗布過(guò)濾獲得無(wú)菌的菌絲體。將上述收集的木霉無(wú)菌菌絲體，經(jīng)過(guò)液氮充分研磨處理后，用Trizol法提取木霉菌總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用澤葉生物的真菌總蛋白微量提取試劑盒，提取木霉菌的總蛋白。

采用熒光定量PCR檢測(cè)木霉原始菌株和突變工程菌（Tv-1511-△GCN5和Tv-1511-GCN5-OE）中TvGCN5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，擴(kuò)增引物為TvGCN5-qPCR-F：GGAGTGGA AGAATGGCATA和TvGCN5-qPCR-R：GGAGTGGAAGAATGG CATA。利用已知的TvGCN5蛋白的特征序列制備可用于蛋白檢測(cè)的抗體，制備工作有南京金斯瑞公司完成。利用蛋白質(zhì)免疫印跡法，檢測(cè)TvGCN5蛋白在原始菌株（wildtype）和突變工程菌（Tv-1511-△GCN5和Tv-1511-GCN5-OE）中的表達(dá)。

1.2.4 綠色木霉組蛋白乙酰化水平分析 為了測(cè)定GCN5基因缺失與過(guò)表達(dá)后，基因組中組蛋白乙酰化水平的變化，利用EpiQuik公司試劑盒（Total H3ac Detection Kit，P-4031）進(jìn)行組蛋白H3的提取和乙酰化狀態(tài)檢測(cè)。

1.2.5 綠色木霉抗逆能力的分析 在PDA平板上活化木霉原始菌株（wildtype）和突變工程菌（Tv-1511-△GCN5和Tv-1511-GCN5-OE），28℃避光培養(yǎng)48-72 h，使得原始菌株和突變工程菌木霉長(zhǎng)勢(shì)均一，再使用打孔器制備大小均一的菌塊。一部分菌塊轉(zhuǎn)移到含有300 mmol/L NaCl的PDA平板中央，進(jìn)行耐鹽實(shí)驗(yàn)研究；部分菌塊轉(zhuǎn)移到新的PDA平板中央，放入35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，進(jìn)行耐高溫實(shí)驗(yàn)研究。將不同處理的木霉平板培養(yǎng)一段時(shí)間后，分別測(cè)量其菌落生長(zhǎng)直徑。

將200 μL木霉原始菌株和突變工程菌（Tv-1511-△GCN5和Tv-1511-GCN5-OE）的孢子分別接種于含有300 mmol/L NaCl的PDB液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min培養(yǎng)72 h；再重新取等量的菌絲體分別接種于新的PDB液體培養(yǎng)基中，35℃，180 r/min培養(yǎng)72 h，進(jìn)行耐高溫實(shí)驗(yàn)研究。在特定培養(yǎng)時(shí)間，收集菌絲，測(cè)定生物量。

1.2.6 綠色木霉對(duì)植物促生能力的分析 供試植物為擬南芥、椒樣薄荷和黃瓜（津研四號(hào)）。將上述供試植物進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，并選用長(zhǎng)勢(shì)均一的植物移至水培裝置，進(jìn)行處理。以加入木霉原始菌株或突變工程菌（Tv-1511-△GCN5和Tv-1511-GCN5-OE）的孢子液（終濃度為105）為不同處理組，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)，處理一段時(shí)間后進(jìn)行生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.7 木霉發(fā)酵液中的IAA含量分析 將200 μL木霉原始菌株和突變工程菌（Tv-1511-△GCN5和Tv-1511-GCN5-OE）的孢子分別接種于PDB液體培養(yǎng)基（加入或者不加100 μg/mL L-tryptophan）中，28℃，180 r/min培養(yǎng)72 h，通過(guò)2層無(wú)菌紗布過(guò)濾菌絲體，回收液體發(fā)酵液，回收的液體發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心后取上清，利用HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中的IAA含量。

1.2.8 木霉發(fā)酵液中纖維素降解酶的活性分析 將200 μL木霉原始菌株和突變工程菌（Tv-1511-△GCN5和Tv-1511-GCN5-OE）的孢子分別接種于MM液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min培養(yǎng)48 h，通過(guò)2層無(wú)菌紗布過(guò)濾獲得工程菌和原始菌株的菌絲體。將菌絲體分別接種于含有微晶纖維素的MM液體培養(yǎng)基（不添加葡萄糖）中進(jìn)行纖維素酶的誘導(dǎo)培養(yǎng)，72 h后通過(guò)2層無(wú)菌紗布過(guò)濾菌絲體，回收液體發(fā)酵液。

回收的液體發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心后取上清，制備粗酶提取液，檢測(cè)纖維素酶的活性。其中濾紙酶（filter paper celluloses，F(xiàn)Pase）活性、羧甲基纖維素酶（carboxymethylcellulose cellulose，CMCase）活性檢測(cè)采用DNS法檢測(cè)，pNPCase（p-nitrophenyl-β-cellobioside cellulase）和pNPGase（p-nitroph- enyl-β-glucopyranoside cellulase）酶活性采用pNG法檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 綠色木霉TvGCN5基因缺失和過(guò)表達(dá)的工程菌的構(gòu)建

通過(guò)融合PCR獲得TvGCN5基因的敲除片段（圖1-A，B），構(gòu)建了木霉缺失菌株Tv-1511-△GCN5；通過(guò)雙酶切法構(gòu)建了TvGCN5過(guò)表達(dá)載體（圖1-C，D），進(jìn)一步構(gòu)建了TvGCN5過(guò)表達(dá)木霉菌株Tv-1511-GCN5-OE。然后采用熒光定量PCR檢測(cè)TvGCN5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，利用蛋白質(zhì)免疫印跡法，檢測(cè)TvGCN5的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與原始菌株相比，在Tv-1511-△GCN5菌株中檢測(cè)不到TvGCN5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)（圖2-A）和蛋白表達(dá)（圖2-B，C），而在Tv-1511-GCN5-OE菌株中TvGCN5的轉(zhuǎn)錄表達(dá)（圖2-A）和蛋白表達(dá)（圖2-B，C）均明顯上升。

圖1 TvGCN5基因敲除片段及過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建Fig. 1 Construction of knockout fragment and overexpression vector of TvGCN5 gene

圖2 熒光定量PCR和Western blot鑒定TvGCN5基因過(guò)表達(dá)和缺失的木霉工程菌Fig.2 Identification of overexpressing or deleting TvGCN5 gene in Trichoderma engineering strains by fluorescence quantitative PCR and Western blot

2.2 過(guò)表達(dá)TvGCN5基因?qū)G色木霉組蛋白乙?；降母淖?/h3>

檢測(cè)了綠色木霉中TvGCN5基因缺失和過(guò)表達(dá)對(duì)組蛋白H3乙?；降挠绊?。結(jié)果表明，與原始菌株相比，TvGCN5基因缺失突變體Tv-1511-△GCN5中組蛋白H3的乙?；揎椝矫黠@下降（圖3），TvGCN5基因過(guò)表達(dá)工程菌Tv-1511-GCN5-OE中組蛋白H3乙?；揎椝矫黠@提高（圖3）。

圖3 綠色木霉Tv-1511及其工程菌中的組蛋白乙?；揎椝降淖兓疐ig.3 Changes in the levels of histone acetylation in T. viride Tv-1511 and its engineered strains

2.3 過(guò)表達(dá)TvGCN5基因提高了綠色木霉的抗逆 能力

對(duì)木霉原始菌株（wildtype）和突變工程菌株（Tv-1511-△GCN5和Tv-1511-GCN5-OE）進(jìn)行了耐鹽耐高溫平板實(shí)驗(yàn)以及耐鹽耐高溫液體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在300 mmol/L NaCl脅迫下，TvGCN5基因過(guò)表達(dá)的工程菌（Tv-1511-GCN5-OE）的直徑平均比原始菌株增加了大約（90.8±5.1）%，而TvGCN5基因缺失的工程菌（Tv-1511-△GCN5）的直徑平均比原始菌株減少了大約（69.3 ± 3.5）%（圖4-A，B）。TvGCN5過(guò)表達(dá)的工程菌（Tv-1511-GCN5-OE）的生物量比原始菌株提高了大約1.1倍，而TvGCN5缺失的工程菌（Tv-1511-△GCN5）的生物量比原始菌株降低了大約（62.4 ± 4.4）%（圖4-C）。這些結(jié)果表明TvGCN5基因在綠色木霉耐鹽中起著重要作用。

圖4 綠色木霉Tv-1511原始菌株及其工程菌耐鹽能力的 分析Fig.4 Analysis of the salt tolerances of T. viride Tv-1511 original strain and its engineered strains

在35℃的培養(yǎng)環(huán)境下，TvGCN5基因過(guò)表達(dá)的工程菌（Tv-1511-GCN5-OE）的直徑平均比原始菌株增加了大約（82.2 ± 4.1）%，而TvGCN5基因缺失的工程菌（Tv-1511-△GCN5）的直徑平均比原始菌株減少了大約（48.8 ± 3.6）%（圖5-A，B）。TvGCN5基因過(guò)表達(dá)的工程菌（Tv-1511-GCN5-OE）的生物量比原始菌株提高了大約（75.3 ± 5.2）%，而TvGCN5基因缺失的工程菌（Tv-1511-△GCN5）的生物量比原始菌株降低了大約（51.9 ± 6.3）%（圖5-C）。這些結(jié)果表明TvGCN5基因在綠色木霉耐高溫中起著重要作用。

圖5 綠色木霉Tv-1511原始菌株及其工程菌耐高溫能力的分析Fig.5 Analysis of the high temperature tolerance of T. viride Tv-1511 original strain and its engineered strains

2.4 過(guò)表達(dá)TvGCN5基因的綠色木霉具有更強(qiáng)的植物促生能力

在擬南芥、椒樣薄荷和黃瓜種植中，接種了綠色木霉Tv-1511的孢子液，有效地促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)，而且接種了TvGCN5基因過(guò)表達(dá)工程菌菌株（Tv-1511-GCN5-OE）的促生效果更明顯（圖6-8）。

其中，TvGCN5基因過(guò)表達(dá)工程菌（Tv-1511-GCN5-OE）對(duì)擬南芥的促生效應(yīng)明顯強(qiáng)于原始菌株，其中鮮重提高了（34.1 ± 3.3）%，葉片面積提高了（24.6 ± 3.8）%；而TvGCN5基因缺失工程菌（Tv-1511-△GCN5）的促生效率相比原始菌株明顯下降 （圖6），其中鮮重降低了（45.9 ± 5.1）%，葉片面積降低了（25.9 ± 4.1）%。

圖6 綠色木霉Tv-1511原始菌株及其工程菌對(duì)擬南芥促生能力的分析Fig.6 Analysis of the growth-promoting effects of T. viride Tv-1511 original strain and its engineering strains on Arabidopsis thaliana

TvGCN5基因過(guò)表達(dá)工程菌（Tv-1511-GCN5-OE）對(duì)椒樣薄荷的促生效應(yīng)明顯強(qiáng)于原始菌株（圖7），其中鮮重提高了（48.1 ± 4.5）%，葉片面積提高了（34.3 ± 4.3）%；而TvGCN5基因缺失工程菌（Tv-1511-△GCN5）的促生效率相比原始菌株明顯下降 （圖7），其中鮮重降低了（40.6 ± 3.1）%，葉片面積降低了（46.1 ± 5.3）%。

圖7 綠色木霉Tv-1511原始菌株及其工程菌對(duì)椒樣薄荷促生能力的分析Fig.7 Analysis of the growth-promoting effects of T. viride Tv-1511 original strain and its engineering strains on peppermint（Mentha piperita）

TvGCN5基因過(guò)表達(dá)工程菌（Tv-1511-GCN5-OE）對(duì)黃瓜的促生效應(yīng)明顯強(qiáng)于原始菌株（圖8），其中鮮重提高了（50.9 ± 6.3）%，葉片面積提高了（14.33 ± 1.3）%；而TvGCN5基因缺失的工程菌（Tv-1511-△GCN5）的促生效率相比原始菌株明顯下降（圖8），其中鮮重降低了（33.6 ± 2.9）%，葉片面積降低了（26.4 ± 1.9）%。

圖8 綠色木霉Tv-1511原始菌株及其工程菌對(duì)黃瓜促生能力的分析Fig.8 Analysis of the promoting effects of T. viride Tv-1511 original strain and its engineering strains on cucumber（Cucumis sativus L.）

2.5 TvGCN5基因參與調(diào)控綠色木霉產(chǎn)IAA的能力

木霉菌能分泌一些植物生長(zhǎng)激素等物質(zhì)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。因此我們利用液相色譜檢測(cè)了木霉發(fā)酵液中IAA的含量。結(jié)果（圖9）發(fā)現(xiàn)，相比于原始菌株，在加入L-tryptophan 的培養(yǎng)基中，TvGCN5基因過(guò)表達(dá)工程菌（Tv-1511-GCN5-OE）所產(chǎn)IAA的含量提高了（71.2 ± 6.7）%，而TvGCN5基因缺失工程菌（Tv-1511-△GCN5）則降低了（53.5 ± 3.9）%。這些結(jié)果表明TvGCN5基因在綠色木霉產(chǎn)IAA的代謝中起著重要作用。

2.6 TvGCN5基因過(guò)表達(dá)提高了綠色木霉產(chǎn)纖維素酶的能力

木霉是公認(rèn)的高效的纖維素酶產(chǎn)生菌，因此測(cè)定了TvGCN5基因在綠色木霉產(chǎn)纖維素酶中的作用。TvGCN5基因過(guò)表達(dá)工程菌（Tv-1511-GCN5-OE）中各種纖維素降解酶的活性均高于原始菌株，其中FPase 活性提高了大約1.3倍（圖10-A），CMCase 活性提高了大約（75.2 ± 4.8）%（圖10-B），pNPCase 活性提高了大約（74.6 ± 6.2）%（圖10-C），pNPGase活性提高了大約（72.9 ± 5.1）%（圖10-D）；而TvGCN5基因缺失工程菌（Tv-1511-△GCN5）中，各種纖維素降解酶的活性均低于原始菌株（wildtype），其中FPase 活性降低了大約（60.1 ± 3.7）%（圖10-A），CMCase 活性降低了大約（41.4 ± 4.4）%（圖9-B），pNPCase 活性降低了大約（53.8 ± 5.5）%（圖10-C），pNPGase活性降低了大約（61.9 ± 5.8）%（圖10-D）。

圖9 綠色木霉Tv-1511原始菌株及其工程菌發(fā)酵液中IAA含量的檢測(cè)Fig.9 Detection of IAA contents in the fermentation broths of T. viride Tv-1511 original strain and its engineering strains

圖10 綠色木霉Tv-1511原始菌株及其工程菌產(chǎn)纖維素酶活性的分析Fig.10 Analysis of cellulase activities of T. viride Tv-1511 original strain and its engineering strains

3 討論

由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；复呋慕M蛋白乙?；腿ヒ阴；瘜?duì)于基因表達(dá)調(diào)節(jié)至關(guān)重要［32］，在生物生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶GCN5屬于其中重要的一種，在維持全基因組組蛋白乙?；幕A(chǔ)水平起著重要作用。自從1996年Brownell等從四膜蟲核提取物中分離到第一種組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（HAT）——GCN5以來(lái)，在酵母、果蠅等生物體內(nèi)都分離得到了不同的HATs。我們基于前期全基因組測(cè)序（DDBJ/ENA/GenBank under the accession VCEC00000000（BioProject：PRJNA543939；BioSample：SAMN11791795））的結(jié)果，也從綠色木霉Tv-1511中克隆到了組蛋白乙酰化酶編碼基因TvGCN5，并已將基因序列提交至NCBI GenBank（MZ338376）。

本研究通過(guò)構(gòu)建TvGCN5缺失的木霉菌株Tv-1511-△GCN5和TvGCN5過(guò)表達(dá)的木霉菌株Tv-1511-GCN5-OE，清晰高效的研究了TvGCN5基因在木霉中的作用。木霉菌屬于重要的植物根際促生真菌，在植物根際接種木霉孢子液，可以有效的增加植物的鮮重、葉面積等［9-11］。本研究中，綠色木霉對(duì)植物的促生作用效果明顯，而且經(jīng)過(guò)TvGCN5過(guò)表達(dá)的木霉菌株Tv-1511-GCN5-OE處理后的植物促生效果比經(jīng)過(guò)TvGCN5缺失的木霉菌株Tv-1511-△GCN5更明顯。木霉主要通過(guò)重寄生、競(jìng)爭(zhēng)作用和分泌一些代謝產(chǎn)物等方法產(chǎn)生促生作用。研究表明，木霉屬可產(chǎn)生一些揮發(fā)性有機(jī)化合物，通過(guò)土壤空氣擴(kuò)散抑制植物病原真菌的生長(zhǎng)［33］或在植物中誘導(dǎo)防御反應(yīng)［34-36］。木霉的促生作用還表現(xiàn)在木霉可以產(chǎn)生IAA。生長(zhǎng)素可以促進(jìn)根系的發(fā)育，促進(jìn)側(cè)根生長(zhǎng)。Contreras-Cornejo HA等通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜在木霉培養(yǎng)液中檢測(cè)到吲哚類化合物吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚-3-乙醛（IAAld）和吲哚-3-乙醇（IEt），并用這3種物質(zhì)處理擬南芥，揭示了木霉菌促進(jìn)擬南芥生長(zhǎng)的生長(zhǎng)素運(yùn)輸/響應(yīng)基因的調(diào)控機(jī)制［37］。在本研究中，在TvGCN5過(guò)表達(dá)的木霉菌株發(fā)酵液中檢測(cè)到了更高濃度的IAA，表明TvGCN5在木霉菌產(chǎn)生生長(zhǎng)素的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

生物在面對(duì)生存環(huán)境無(wú)時(shí)無(wú)刻的變化時(shí)，組蛋白乙?；腔虮磉_(dá)可逆和動(dòng)態(tài)變化的重要調(diào)節(jié)方式。在一些非生物脅迫下，生物可以激活相應(yīng)的反應(yīng)基因來(lái)耐受不斷變化的生存環(huán)境。GCN5通過(guò)組蛋白乙?；姆绞郊せ盍藶榫晏峁┑挚狗巧锩{迫能力的相關(guān)基因［38］。GCN5通過(guò)調(diào)節(jié)有關(guān)于細(xì)胞壁上的重要基因的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)鹽脅迫［39］和熱脅迫［40］。在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，高溫脅迫、鹽脅迫對(duì)于木霉的生長(zhǎng)和生產(chǎn)有著重要的作用，嚴(yán)重影響著木霉的代謝活動(dòng)［30］。本研究中，TvGCN5過(guò)表達(dá)的菌株在抵抗鹽脅迫和熱脅迫時(shí)，效果也更明顯。木霉屬是工業(yè)上重要的產(chǎn)纖維素酶的菌株。在近些年來(lái)，有關(guān)表觀遺傳修飾在真菌產(chǎn)酶方面的研究也在不斷深入。Xin等［28］通過(guò)敲除里氏木霉中的GCN5，發(fā)現(xiàn)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶能力異常。在木霉中，cbh1和egl1是主要編碼纖維素酶的基因，Xyr1是主要的調(diào)控激活因子。周嬌嬌［41］采用siRNA技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上特異性的抑制GCN5的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙?；浇档停琗yr1、cbh1和egl1的表達(dá)量降低，木霉產(chǎn)纖維素酶的能力和纖維素酶活也降低。進(jìn)一步的表明了組蛋白乙?；冈谀久巩a(chǎn)纖維素酶中發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)論

本研究開(kāi)展了綠色木霉Tv-1511組蛋白乙?；妇幋a基因TvGCN5（NCBI accession number MZ338376）在木霉促生、抗逆、產(chǎn)酶等方面的功能研究。在過(guò)表達(dá)TvGCN5基因后，綠色木霉的生長(zhǎng)及抗逆境脅迫能力顯著提升，其產(chǎn)纖維素酶的水平顯著提高，而且其植物促生和產(chǎn)IAA的能力明顯增強(qiáng)。表明TvGCN5基因及其參與的組蛋白乙?；揎椩诰G色木霉生長(zhǎng)發(fā)育、次級(jí)代謝以及促生抗逆等方面起重要作用。