李美麗， 宿俊吉， 楊永林， 秦江鴻， 李鮮鮮， 楊德龍*，馬麒， 王彩香*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，省部共建干旱生境作物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730070；2.石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院棉花研究所，新疆 石河子 832000；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院棉花研究所，新疆 石河子 832000）

茉莉素（jasmonates，JAs）是具有廣泛作用的植物激素，它不僅調(diào)控植物生長發(fā)育，而且還參與植物生物或非生物脅迫響應(yīng)[1-2]。冠菌素不敏感蛋白1（coronatine-insensitive 1，COI1）是茉莉素信號途徑的關(guān)鍵受體，含有富含亮氨酸重復(fù)（leucinerich repeat，LRR）和F-box結(jié)構(gòu)域，最早從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中獲得[3]。該蛋白能夠與SCF（skp-cullin-F-box）型 E3泛素連接酶組成SCFCOI1復(fù)合物，構(gòu)成茉莉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的核心組分，能夠識別茉莉素信號傳導(dǎo)途徑中的一些調(diào)控因子，通過26S蛋白酶體降解，達(dá)到調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆性的作用[4]。在擬南芥中，COI1參與調(diào)控葉片衰老[5-8]和頂端優(yōu)勢[9]。在小麥中，TaCOI1參與小麥雄性不育信號調(diào)控[10]。此外，水稻OsCOI1的RNAi株系表現(xiàn)出株高、節(jié)間長度和籽粒長度的改變，并增加了對咀嚼昆蟲的敏感性[11]，而油菜中沉默COI1基因表現(xiàn)出蚜蟲抗性下降和雄性不育等現(xiàn)象[12]。目前，關(guān)于COI1基因功能的研究主要集中在植物的生長發(fā)育和生物脅迫方面，而在植物非生物脅迫中的研究甚少。

隨著植物基因組信息不斷釋放，已從小立碗鮮、中華卷柏、云杉、水稻、高粱、毛果楊中分別鑒定到12、7、2、9、8、10個COI基因家族成員[13]。棉花不僅是天然纖維的重要來源，也是重要的抗旱、耐鹽堿先鋒作物，鑒定分析陸地棉（Gossypium hirsutum L.）COI1家族基因，為改良棉花耐逆性提供重要基因資源。本研究基于最新公布的升級版陸地棉TM-1參考基因組[14]，對GhCOI家族成員進行全基因組鑒定，并對其家族成員的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、染色體分布、系統(tǒng)進化和共線性關(guān)系進行分析，結(jié)合干旱、鹽、高溫和冷脅迫處理轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定參與非生物脅迫的GhCOI基因，利用熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證其脅迫表達(dá)模式，為陸地棉COI家族基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用材料為抗旱、耐鹽堿陸地棉品種新石K18，種子由石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院棉花研究所提供。將新石K18棉花種子用75%乙醇浸泡2 min，用無菌水漂洗至無乙醇味后，再用無菌水浸泡24 h左右，將露白的棉花種子放置于自制水培盒（30 cm×20 cm×15 cm，內(nèi)置泡沫板24 cm×15 cm，11個孔，孔距7 cm）中進行萌發(fā)，挑選長勢一致的棉花幼苗，移入1/2改良型霍蘭格營養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，待棉花幼苗長至4葉期分別用200 mmol·L-1NaCl和 15% PEG-6000 溶液進行脅迫處理，每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，并分別在處理0、0.5、1.0、3.0、6.0、12.0和24.0 h進行葉片采樣，樣本收集后液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 數(shù)據(jù)來源

棉花全蛋白序列、全基因組序列和基因注釋GFF3 文 件 下 載 自 CottonFGD[15]（http://www.cottonfgd.org/），擬南芥COI蛋白序列下載自TAIR數(shù)據(jù)庫[16]（https://www.arabidopsis.org/index.jsp），陸地棉4種非生物脅迫（鹽、干旱、冷和熱）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載自NCBI SRA數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA248163）。

1.3 GhCOI基因家族鑒定及蛋白特性分析

根據(jù)擬南芥已鑒定出的COI基因及其編碼的蛋白序列，利用Pfam[17]數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）和Hmmer3.0軟件構(gòu)建隱馬氏模型，對棉花全蛋白序列進行檢索和去冗余，得到候選蛋白序列，閾值設(shè)為e＜1.0×10-5。利用在線軟件平臺PfamScan（https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/pfamscan/） 和SMART[18]（http://smart.embl-heidelberg.de/）對棉花所有候選基因的氨基酸序列結(jié)構(gòu)域進行鑒定，凡含有LRR和F-box結(jié)構(gòu)域的蛋白即為棉花COI基因家族成員，并根據(jù)陸地棉COI基因家族在染色體上的定位及親緣關(guān)系遠(yuǎn)近進行命名。

利用在線工具ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）分析陸地棉GhCOI蛋白的理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)目（number of amino acids）、分子量（molecular weight）和等電點（pI）等；在亞細(xì)胞定位網(wǎng)站 WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）對其進行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析。

1.4 GhCOI家族基因染色體定位、系統(tǒng)進化樹構(gòu)建及共線性分析

GhCOI基因染色體信息從基因注釋文件中獲得，用MapInspect軟件繪制GhCOI家族基因在染色體上的位置；利用MEGA7.0軟件中的Align by Clustal W工具進行多重序列比對，各參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap值設(shè)定為1 000；采用TBtools軟件中One step MCScanX工具對GhCOI家族基因進行共線性及同義替換率/非同義替換率（Ka/Ks）分析。

1.5 GhCOI基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序的分析

分別從陸地棉全基因組序列和基因注釋文件中篩選GhCOI基因家族的DNA和CDS序列，利用Gene Structure Display Server（GSDS）（http://gsds.gao-lab.org/index.php）對GhCOI家族基因進行基因結(jié)構(gòu)分析。利用MEME Suite 5.3.3（https://meme-suite.org/meme/）對GhCOI蛋白進行保守基序預(yù)測，motif數(shù)為5個，借助TBtools軟件對該基因家族的保守基序進行可視化分析。

1.6 GhCOI家族基因順式作用元件分析

利用TBtools軟件Gtf/Gff3 Sequences extractor工具提取陸地棉CDS序列上游2 000 bp序列，通過 PlantCare[19]數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測順式作用元件。

1.7 GhCOI家族基因表達(dá)特征分析

GhCOI家族基因的鹽、干旱、冷和熱脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從NCBI SRA數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA248163）下載，利用基迪奧生物信息繪圖云平臺（https://www.omicshare.com/tools/）繪制該家族基因的非生物脅迫表達(dá)量熱圖。

1.8 GhCOI家族基因qRT-PCR驗證

篩選含抗逆順式作用元件且高表達(dá)的GhCOI家族基因，利用qRT-PCR進行驗證。利用NCBI Primer-BLAST工具（www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計qPCR引物（表1），產(chǎn)物片段大小在70～150 bp之間，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將1.1中所采集的樣品用多糖多酚總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取總RNA，超微量濃度檢測儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度、含量和完整性。采用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒（天根生化科技有限公司）合成cDNA。采用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強版試劑盒（天根生化科技有限公司）進行qRT-PCR，用2-ΔΔCT法[20]計算相對表達(dá)量。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primer sequence for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 GhCOI基因家族鑒定及理化性質(zhì)分析

從陸地棉中鑒定得到48個COI基因，根據(jù)陸地棉COI基因在染色體上的位置和進化關(guān)系將其命名，如表2所示。序列分析（表2）顯示，48個GhCOI基因編碼的蛋白長度為362（GhCOI4-A05）～702 aa（GhCOI6-A12和GhCOI6-D12）；蛋白質(zhì)分子量在 39.99（GhCOI4-A05）～79.13 kD（GhCOI6-A12）之間；等電點分布在5.50（GhCOI8C-A08）～8.86（GhCOI1-A05、GhCOI1-D06）之間。

對48個GhCOI基因進行亞細(xì)胞定位預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該家族基因主要定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、葉綠體和線粒體（表2），其中43.75%的GhCOI基因定位在細(xì)胞核（21個），39.58%的GhCOI基因定位在細(xì)胞質(zhì)中（19個），其他基因則定位在葉綠體或線粒體，表明GhCOI基因主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)。

表2 GhCOI基因理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測Table 2 Characteristics and subcellular localization prediction of GhCOI genes

表2 GhCOI基因理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測Table 2 Characteristics and subcellular localization prediction of GhCOI genes 續(xù)表Continuted

2.2 GhCOI基因的染色體定位

對48個GhCOI基因進行染色體定位，結(jié)果（圖1）表明：GhCOI基因在染色體上呈不均勻分布，其中染色體 A03、A04、A13、D02和 D13無GhCOI基因分布，染色體 A01、A02、D03、A07、A09、D01、D04、D07和D09各有1個基因分布，其他染色體上GhCOI基因分布數(shù)目2～4個不等，此外還發(fā)現(xiàn)有42%的GhCOI基因主要分布在染色體的兩端。

圖1 GhCOI基因在染色體上的分布Fig.1 Chromosome distribution of GhCOI genes

2.3 GhCOI基因的系統(tǒng)發(fā)育和共線性分析

2.3.1 系統(tǒng)發(fā)育分析 為了研究陸地棉與其他3個棉種及擬南芥COI基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，分別從 海 島 棉（Gossypium barbadenseL.）、亞 洲棉（Gossypium arboreumL.）和雷蒙德氏棉（Gossypium raimondiiL.）得到 48、25和 23個COI基因，運用MEGA7.0軟件進行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹中親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，151個COI基因分為3個亞族：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，而Ⅰ和Ⅱ亞族又分別可細(xì)分為5個不同的亞類，即Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅰ-3、Ⅰ-4、Ⅰ-5和Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5，且不同亞族和亞類所含物種種類和COI基因數(shù)量存在一定差異。其中，Ⅰ-3亞類、Ⅱ亞族和Ⅲ亞族均不包含AtCOI基因，且Ⅰ-3和Ⅱ-1亞類包含成員最少（6個），Ⅰ-5成員最多（24個），其他亞類所包含成員數(shù)量11～18個不等。

圖2 COI基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogeny analysis of COI genes

2.3.2 共線性分析 為了更好地了解GhCOI基因的擴展模式，將GhCOI基因進行了共線性分析，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)：部分GhCOI基因同時與家族內(nèi)多個基因存在共線性關(guān)系，如GhCOI1-A01與GhCOI1-D01和GhCOI1-D05之間有共線性關(guān)系，因此共發(fā)現(xiàn)62對基因具有共線性關(guān)系；48個GhCOI基因全為片段復(fù)制，這表明片段復(fù)制對該家族的擴大起到了關(guān)鍵作用。

圖3 COI基因系統(tǒng)共線性分析Fig.3 Collinearity analysis of COI genes

GhCOI家族基因復(fù)制事件的Ka/Ks范圍為0.09～0.65，平均值是0.21（數(shù)據(jù)未列出），所有重復(fù)事件GhCOI基因的Ka/Ks值均小于1，說明這些基因均在純化選擇壓的作用下進化。

2.4 GhCOI基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守域的分析

對GhCOI基因的結(jié)構(gòu)進行分析（圖4A），發(fā)現(xiàn)21個GhCOI基因無內(nèi)含子，內(nèi)含子數(shù)最多的基因GhCOI10-A09含有8個內(nèi)含子，其余基因所含內(nèi)含子數(shù)目1～7個不等。內(nèi)含子的不均勻分布表明，GhCOI家族基因在進化的過程中可能發(fā)生內(nèi)含子的插入或缺失。

對GhCOI蛋白的保守基序進行預(yù)測（圖4B），發(fā)現(xiàn)48個GhCOI蛋白均含Motif 1和Motif 3，除GhCOI4-A05和GhCOI4-D05外，其余均含有Motif 4，其序列如圖4C所示；另外，41.7%（20個）的蛋白含有的Motif結(jié)構(gòu)最多（5個），4.2%（2個）的蛋白含有的Motif結(jié)構(gòu)最少（Motif 1和Motif 3）。

圖4 GhCOI家族成員結(jié)構(gòu)特征和保守基序分析Fig.4 Structure and conservative motif analysis of the GhCOIs

2.5 GhCOI基因非生物脅迫相關(guān)順式作用元件預(yù)測和表達(dá)分析

對48個GhCOI基因上游2.0 kb的啟動子序列順式作用元件進行分析（圖5A），在GhCOI啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了6種脅迫響應(yīng)調(diào)控元件，即富含 TC 的重復(fù)序列（TC-rich repeats）、LTR（lowtemperature re-sponsiveness），GC 基序/ARE（GC-motif/anaerobic induction）、MBS（MYB binding site）和WUN基序（wound element），它們分別與防御/應(yīng)激、低溫、缺氧、干旱和創(chuàng)傷反應(yīng)相關(guān)。不同的GhCOI基因啟動子中存在不同類型和數(shù)量的調(diào)控元件，表明GhCOI基因可能通過多個順式作用元件共同參與植物的非生物脅迫響應(yīng)。

對鹽、干旱、冷和熱4種脅迫下的48個GhCOI家族基因的表達(dá)模式進行分析，結(jié)果（圖5B和5C）發(fā)現(xiàn)：該家族基因在NaCl、PEG、熱和冷脅迫下，分別發(fā)現(xiàn)有66.7%、56.25%、68.8%和27.1%的基因表達(dá)量升高，其中，同時響應(yīng)NaCl和PEG脅迫的高表達(dá)基因有20個，同時響應(yīng)PEG和熱脅迫的有25個。

圖5 GhCOI基因順式作用元件預(yù)測和在非生物脅迫下的表達(dá)Fig.5 cis-acting elements and expression analysis of GhCOI genes

2.6 GhCOI家族基因qRT?PCR分析

對含較多抗逆順式作用元件且同時在PEG和NaCl脅迫下高表達(dá)的20個基因進行分析，選出表達(dá)較高的9個基因進行qRT-PCR驗證，結(jié)果如圖6所示。NaCl和PEG均能顯著誘導(dǎo)GhCOI基因的表達(dá)，但不同基因的響應(yīng)程度存在差異。在NaCl處 理 下（圖 6A），GhCOI1-D06、GhCOI3-D04、GhCOI3-A05、GhCOI5-A06和GhCOI10-A09基因表達(dá)量顯著提高，其中GhCOI5-A06的表達(dá)量最高，GhCOI3-A05次之。在PEG脅迫下（圖6B），除GhCOI1-D01基因外，其余8個基因均呈現(xiàn)高表達(dá)，其中GhCOI1-D01、GhCOI1-D06、GhCOI3-D04、GhCOI3-A05、GhCOI5-A05和 GhCOI5-A06基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)先增后減再上升的趨勢，且GhCOI5-A05表達(dá)量最高，GhCOI5-A06次之。由此得出，GhCOI5-A06能同時強烈響應(yīng)NaCl和PEG兩種脅迫。

圖6 9個GhCOI基因在NaCl和PEG脅迫下的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of 9 GhCOIs under NaCl and PEG stress

總體來看，GhCOI基因在2種非生物脅迫下的相對表達(dá)量都明顯上調(diào)，與SRA數(shù)據(jù)庫中陸地棉TM-1在鹽和干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達(dá)趨勢相吻合。

3 討論

COI1是茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子，在植物調(diào)控生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫方面起重要作用[21]。本研究共鑒定到陸地棉、海島棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉COI基因各48、48、25和23個，前人在擬南芥中鑒定到7個COI基因[13]。擬南芥與棉花COI基因數(shù)量的差異表明，隨著植物倍性的增加，COI家族基因也在不斷的擴增和復(fù)制。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，151個GhCOI蛋白被劃分為3個亞族，且擬南芥COI基因主要聚集在Ⅰ亞族中，其中AtCOI1與其他6個成員有明顯的聚類分歧，具體表現(xiàn)為Ⅰ-1亞家族中只有AtCOI1，這與段龍飛[13]的研究結(jié)果一致。值得注意的是，AtCOI1是茉莉酸調(diào)節(jié)途徑的關(guān)鍵受體基因，GhCOI3-A05和GhCOI3-D04與其聚類進化關(guān)系較近，這說明在陸地棉中GhCOI3-A05和GhCOI3-D04可能是參與茉莉酸轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵候選基因。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，陸地棉中有44%的COI基因無內(nèi)含子，其余基因含有1～7個不等，這種內(nèi)含子數(shù)量的差異可能是在進化過程中，由于內(nèi)含子的插入或丟失造成的變化；保守基序分析發(fā)現(xiàn)48個GhCOI基因均含有Motif 1和Motif 3，推測它們?yōu)樵摷易宓谋Ｊ匦曰颉?/p>

基因復(fù)制被認(rèn)為是基因組和遺傳系統(tǒng)進化的主要驅(qū)動力之一[22]，片段復(fù)制、串聯(lián)復(fù)制和轉(zhuǎn)位事件被認(rèn)為是3種主要的進化模式。在這些模式中，片段復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制被認(rèn)為是植物基因家族擴大的兩個主要原因[23]。對陸地棉COI基因共線性分析發(fā)現(xiàn)，48個GhCOI基因不均勻的分布于21條染色體上，且均為片段復(fù)制，其結(jié)果與小麥COI[24]家族基因共線性分析結(jié)果一致?；蛟谌旧w上的這種不均勻分布表明基因在進化過程中存在遺傳變異[25]。此外，同義替換率和非同義替換率是評價重復(fù)事件純化選擇壓力的基礎(chǔ)，而純化選擇可能是重復(fù)基因功能差異的主要驅(qū)動力[26]。通過對復(fù)制基因?qū)Φ耐x替換率和非同義替換率分析發(fā)現(xiàn)，GhCOI基因均在純化選擇壓下進行，這可能是促進COI基因能夠響應(yīng)各種逆境脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵。

分析GhCOI基因在不同脅迫下的順式作用調(diào)控元件和表達(dá)譜。在GhCOI啟動子中發(fā)現(xiàn)了6種響應(yīng)脅迫及防御反應(yīng)調(diào)控元件（低溫、干旱、缺氧、防御和創(chuàng)傷），與Bai等[24]在小麥TaCOI家族基因的研究一致，這表明GhCOI和TaCOI基因一樣，對不同的脅迫處理和損傷有不同的調(diào)控機制。本文進一步研究了GhCOI基因在不同脅迫條件下的表達(dá)模式，結(jié)果顯示該家族基因可響應(yīng)多種非生物脅迫。例如，在干旱和溫度誘導(dǎo)下，GhCOI3-D04、GhCOI3-A05和GhCOI7-A07表達(dá)上調(diào)，且這些基因均含有1～3個MBS/LTR元件。COI同源基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)可為該家族的生理生化和基因功能研究提供重要信息。

本研究利用qRT-PCR對部分基因進行表達(dá)驗證發(fā)現(xiàn)，9個被檢測GhCOI基因在NaCl和PEG脅迫下均上調(diào)表達(dá)，其中GhCOI5-A06是能同時響應(yīng)2種脅迫最強烈的基因，其表達(dá)量在NaCl脅迫下是對照的45.96倍，在PEG-6000脅迫下是對照的33.71倍。段龍飛[13]對擬南芥COI基因響應(yīng)鹽和干旱脅迫的研究顯示：擬南芥COI基因表達(dá)模式不同于棉花COI基因，如AtCOI4在2種脅迫中表達(dá)量均量下調(diào)趨勢，而AtCOI5在鹽脅迫下表達(dá)量下調(diào)，在干旱脅迫下表達(dá)量上調(diào)。這可能是不同植物在自然界所處生境不同，它們在各自進化過程中一些信號途徑的某些節(jié)點可能發(fā)生了分歧。由此推測，陸地棉GhCOI基因家族在進化過程中，為適應(yīng)外界環(huán)境變化而分化出不同的家族成員[27]。

綜上所述，在基因進化過程中，親緣關(guān)系較近的基因結(jié)構(gòu)和保守基序數(shù)量、類型都極為相似，且均有共線性關(guān)系，而基因復(fù)制為基因家族的擴增提供了原動力，并對不同基因執(zhí)行同一功能提供了可能性。GhCOI基因的系統(tǒng)發(fā)育和表達(dá)模式將為基因功能提供更全面的理解，為陸地棉GhCOI家族基因響應(yīng)非生物脅迫調(diào)控機制的研究奠定了基礎(chǔ)，為棉花抗逆育種提供了潛在的基因資源。今后還需進一步深入研究GhCOI基因如何發(fā)揮特殊功能。