張翠翠， 李永川， 孫文萍

(青海紅十字醫(yī)院產(chǎn)科，青海 西寧 810000)

近年來(lái)，空氣污染導(dǎo)致的胚胎發(fā)育異常已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。苯并芘(BaP)廣泛存在于空氣和水中，屬于多環(huán)芳烴類化合物，BaP是一種常見(jiàn)的空氣污染物，能夠引發(fā)早產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)受限等不良妊娠[1-2]。絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞是胎盤(pán)功能發(fā)揮和胚胎成功著床的主要因素，而其過(guò)度凋亡和侵襲受阻是不良妊娠發(fā)生的關(guān)鍵[3]。枸杞多糖是枸杞的有效成分，是由酸性雜多糖、多肽、蛋白質(zhì)組成的復(fù)合多糖，具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等功效[4]。研究表明，枸杞多糖能夠保護(hù)生殖系統(tǒng)，可減輕氧化損傷并促進(jìn)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞生長(zhǎng)和分泌人絨毛膜促性腺激素[5]。目前，枸杞多糖對(duì)BaP誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡和侵襲的影響尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞為體外研究對(duì)象，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、Transwell小室探討枸杞多糖對(duì)BaP誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡和侵襲能力的影響，以期為枸杞多糖在不良妊娠中的作用提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞購(gòu)自上海弘順生物科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購(gòu)自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗體購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；苯并芘(BaP)購(gòu)自無(wú)錫美贊化學(xué)品有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體、p65抗體購(gòu)自武漢友聯(lián)特生物技術(shù)有限公司；p65激活劑佛波酯(PMA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。枸杞多糖(純度90%)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞分組與處理 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組及枸杞多糖低、中、高劑量組，對(duì)照組細(xì)胞不做處理；模型組細(xì)胞用含20 μmol/L BaP的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；枸杞多糖低、中、高劑量組細(xì)胞分別用含20 μmol/L BaP和80、160、240 μg/mL枸杞多糖的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞，用PBS溶液將各組細(xì)胞密度調(diào)整為1×106/mL，吸取1 mL細(xì)胞懸浮液，1 000×g離心10 min，棄上清，在細(xì)胞中添加500 μL Binding buffer溶液，充分混合，添加PI、Annexin V-FITC染色液各5 μL，避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡。

2.3 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 首先將8 μm Transwell小室放入24孔板中，每孔中添加300 μL不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，室溫孵育30 min，棄培養(yǎng)液，用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，在Transwell小室的下室中加入500 μL含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，然后在上室中加入200 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌小室3次，顯微鏡下觀察細(xì)胞穿膜數(shù)目即為細(xì)胞侵襲數(shù)目，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，取平均值。

2.4 Western blot檢測(cè)MMP-9、Bax、Bcl-2、p65蛋白表達(dá)

培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，置于冰上超聲粉碎，4 ℃裂解30 min，15 000×g離心10 min，吸取上清，即為細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。配制5%上層濃縮膠和10%下層分離膠，每孔蛋白上樣量為30 μg，100 V恒壓電泳，90 V轉(zhuǎn)膜90 min。將PVDF膜取出并放在5%牛血清白蛋白中，常溫孵育1 h，再依次放在一抗、二抗溶液中結(jié)合反應(yīng)，ECL顯色，使用Image J軟件分析條帶灰度值，并計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.5 p65激活劑對(duì)枸杞多糖干預(yù)BaP誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的作用 細(xì)胞分為為枸杞多糖中劑量組(20 μmol/L BaP+160 μg/mL枸杞多糖)和枸杞多糖中劑量+PMA組(20 μmol/L BaP+160 μg/mL枸杞多糖+2 ng/mL p65激活劑PMA)，加藥培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲，Western blot檢測(cè)MMP-9、Bax、Bcl-2、p65蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 枸杞多糖對(duì)BaP誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與模型組比較，枸杞多糖各劑量組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。由此可知，枸杞多糖抑制BaP誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡。

圖1 各組細(xì)胞凋亡

表1 枸杞多糖對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

3.2 枸杞多糖對(duì)BaP誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲的影響 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞侵襲數(shù)減少(P<0.05)；與模型組比較，枸杞多糖各劑量組細(xì)胞侵襲數(shù)增加(P<0.05)，并呈劑量依賴性，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，枸杞多糖促進(jìn)BaP誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲。

表2 枸杞多糖對(duì)細(xì)胞侵襲的影響

3.3 枸杞多糖對(duì)BaP誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，枸杞多糖各劑量組細(xì)胞MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見(jiàn)圖2、表3。

圖2 各組細(xì)胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

表3 枸杞多糖對(duì)細(xì)胞MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

3.4 枸杞多糖對(duì)BaP誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞p65蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞p65蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，枸杞多糖各劑量組細(xì)胞p65蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見(jiàn)圖3、表4。

圖3 各組細(xì)胞p65蛋白表達(dá)

表4 枸杞多糖對(duì)細(xì)胞p65蛋白表達(dá)的影響

3.5 PMA逆轉(zhuǎn)枸杞多糖對(duì)BaP誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞p65蛋白表達(dá)的影響 各劑量枸杞多糖對(duì)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞均有作用，選擇中劑量初步探討其作用機(jī)制。與枸杞多糖中劑量組比較，枸杞多糖中劑量+PMA組細(xì)胞p65蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖4、表5。由此可知，PMA逆轉(zhuǎn)枸杞多糖對(duì)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞p65蛋白表達(dá)影響。

圖4 PMA對(duì)細(xì)胞p65蛋白表達(dá)的影響

表5 PMA逆轉(zhuǎn)枸杞多糖對(duì)細(xì)胞p65蛋白表達(dá)的影響

3.6 PMA逆轉(zhuǎn)枸杞多糖對(duì)BaP誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡率、侵襲數(shù)以及MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 與枸杞多糖中劑量組比較，枸杞多糖中劑量+PMA組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞侵襲數(shù)及細(xì)胞中Bax、MMP-9蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5、表6。

圖5 各組細(xì)胞凋亡(A)和MMP-9、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)(B)

表6 PMA對(duì)細(xì)胞凋亡率、侵襲數(shù)及MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

4 討論

環(huán)境污染是影響人類生殖系統(tǒng)正常功能的重要原因，其可誘發(fā)子宮內(nèi)膜異位癥、月經(jīng)紊亂、多囊卵巢綜合征等疾病[6]。絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞成功侵入子宮內(nèi)膜是成功妊娠的基礎(chǔ)[7]。BaP是一個(gè)典型的多環(huán)芳烴類化合物，可誘導(dǎo)DNA損傷、畸形和突變[8]。BaP處理可以誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞過(guò)度凋亡和侵襲能力下降，所以常作為體外研究絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞損傷的誘導(dǎo)因子[9]。Bax和Bcl-2均屬于Bcl-2蛋白家族成員，分別在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)和抑制作用[10]。MMP-9是細(xì)胞侵襲促進(jìn)因子，其水平的高低與細(xì)胞侵襲能力正相關(guān)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BaP處理后的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞侵襲能力下降，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2、MMP-9蛋白表達(dá)下降，說(shuō)明BaP抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示成功構(gòu)建了人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞體外損傷模型。

枸杞是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有明目、補(bǔ)肝腎等功效。枸杞多糖是枸杞的關(guān)鍵活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、降血脂、抗輻射等作用[12-14]。研究顯示，枸杞多糖具有保護(hù)生殖系統(tǒng)的作用，可以降低生殖系統(tǒng)損傷，枸杞多糖灌胃后，實(shí)驗(yàn)性高血壓妊娠小鼠胎盤(pán)明顯改善[15-17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能夠降低BaP處理后的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，促進(jìn)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲，降低細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，增加細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促細(xì)胞轉(zhuǎn)移蛋白MMP-9的表達(dá)，提示枸杞多糖可以抑制BaP誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞侵襲。

p65是NF-κB信號(hào)激活的必需調(diào)控因子，其表達(dá)升高標(biāo)志著NF-κB信號(hào)激活水平升高[18-21]。研究顯示，NF-κB參與人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞損傷，在細(xì)胞損傷發(fā)生時(shí)過(guò)度激活，而下調(diào)其激活水平可以促進(jìn)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲并降低細(xì)胞凋亡發(fā)生[22]。本實(shí)驗(yàn)表明，枸杞多糖可以降低BaP處理后的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞中p65蛋白表達(dá)，而p65激活劑可以逆轉(zhuǎn)枸杞多糖對(duì)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡和侵襲的作用。

綜上所述，枸杞多糖可能通過(guò)降低BaP誘導(dǎo)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞侵襲而發(fā)揮保護(hù)作用，其機(jī)制可能與p65有關(guān)。目前對(duì)于枸杞多糖調(diào)控p65下游機(jī)制和體內(nèi)作用還不清楚，仍需進(jìn)一步探討。