魯 月，羅 婧，顏 璐，吳 宇，鄭煜芳,

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438； 2.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，上海 200011)

泛素化是一種重要的翻譯后修飾。泛素分子在一系列特殊酶的作用下特異性修飾到靶蛋白上。其過(guò)程主要涉及E1、E2和E3三種酶[1]。E1是泛素激活酶，負(fù)責(zé)在ATP供能的條件下激活泛素并將激活的泛素分子轉(zhuǎn)移到E2酶上。E2是泛素結(jié)合酶，負(fù)責(zé)結(jié)合被激活的泛素分子并通過(guò)E3呈遞給底物蛋白。E3是泛素連接酶，負(fù)責(zé)將泛素從E2轉(zhuǎn)移到底物蛋白上[2]。在這3種酶中，只有E3酶能對(duì)底物進(jìn)行特異性識(shí)別，因此E3泛素連接酶是泛素化過(guò)程中最重要的3個(gè)酶之一。確定E3泛素連接酶與其特異底物之間的作用一直是這一領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[3]。

E3D泛素連接酶(Ubiquitin protein ligase E3D, UBE3D)基因UBE3D又名Ube2cbp，編碼的蛋白UBE3D在人和小鼠中具有78.5%的同源序列。E3酶按照特殊的結(jié)構(gòu)域主要分為3種： 帶一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域，帶一個(gè)HECT結(jié)構(gòu)域，或者帶兩個(gè)RING結(jié)構(gòu)域。UBE3D蛋白序列中有一區(qū)域與經(jīng)典的E3泛素連接酶E6AP上的HECT結(jié)構(gòu)域有31%相似度，故UBE3D被認(rèn)為可能是一種HECT型E3泛素連接酶[4]。現(xiàn)有報(bào)道顯示Ube3d的突變與老年性黃斑病變相關(guān)，且Ube3d純合敲除的小鼠胚胎致死[5]，提示UBE3D在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。但因?yàn)槟壳癠BE3D的底物未知，無(wú)法深入探索其功能。本研究利用高通量互作組學(xué)的方法篩選了UBE3D的候選底物。

最常用的高通量篩選蛋白互作的方法是酵母雙雜交(Yeast two-hybrid, Y2H)篩選和親和純化質(zhì)譜法。酵母雙雜交系統(tǒng)是一種利用酵母內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)互作的方法[6-7]，將待研究的兩種蛋白質(zhì)分別融合到表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活域上，構(gòu)建成融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，從酵母的表達(dá)產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)是否相互作用[8-9]。親和純化質(zhì)譜(AP-MS)是利用固定在親和柱上的誘餌蛋白捕獲其相互作用的獵物蛋白，純化和洗脫后，對(duì)洗脫后的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中扣除對(duì)照組中的蛋白，即可鑒定出與誘餌蛋白互作的蛋白，是一種大規(guī)模識(shí)別蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)的標(biāo)準(zhǔn)方法[10-11]。本研究通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和分析Bioplex2.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥bioplex.hms. harvard.edu/bioplexDisplay/index.php#)篩選出來(lái)兩個(gè)UBE3D的候選底物： 微管相關(guān)蛋白1S(Microtubule-Associated Protein 1S, MAP1S)和切割與聚腺苷酸化特異因子3(Cleavage and Polyadenylation Specific Factor 3, CPSF3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MAP1S的蛋白表達(dá)水平不受UBE3D影響。而CPSF3可以與UBE3D互作并且蛋白表達(dá)量受UBE3D調(diào)控。因此，CPSF3可能是UBE3D的底物，受UBE3D的調(diào)控參與其對(duì)發(fā)育的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞系

大腸桿菌E.coliDH5a購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。293T細(xì)胞菌株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 pCMV-Flag-UBE3D及pcDNA3.0-Myc-CPSF3表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

表1 用于擴(kuò)增UBE3D及CPSF3的PCR引物

UBE3D，基因ID： 90025.CPSF3，基因ID： 51692.為了在293T中表達(dá)UBE3D和CPSF3，我們構(gòu)建了pCMV-Flag-UBE3D(下文簡(jiǎn)寫(xiě)為UBE3D-Flag)、pcDNA3.0-Myc-CPSF3(下文簡(jiǎn)寫(xiě)為CPSF3-Myc)質(zhì)粒。首先，通過(guò)PCR從全基因組中克隆出帶有KpnⅠ和ApaⅠ酶切位點(diǎn)的UBE3D的cDNA，之后用KpnⅠ和ApaⅠ限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切UBE3D片段和pCMV載體，回收后進(jìn)行雙片段連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5a感受態(tài)，然后涂板，挑克隆，最后測(cè)序篩選出pCMV-Flag-UBE3D陽(yáng)性克隆。同理，通過(guò)RT-PCR從全基因組中克隆出帶有KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的CPSF3片段，酶切后克隆入pcDNA載體，測(cè)序篩選出pcDNA3.0-Myc-CPSF3陽(yáng)性克隆。

1.3 抗體

本文所用的抗體信息見(jiàn)表2。

表2 Western blot及Co-IP實(shí)驗(yàn)的抗體信息

1.4 酵母雙雜交及酵母基因組DNA提取

首先利用同源重組法進(jìn)行pGADT7-Rec-UBE3D重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定，并制備酵母感受態(tài)細(xì)胞，將融合DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GAL4-bd)的重組UBE3D質(zhì)粒在感受態(tài)酵母菌株中進(jìn)行誘餌菌的轉(zhuǎn)化，比較試驗(yàn)組與對(duì)照組OD600值，進(jìn)行誘餌重組質(zhì)粒的自激活活性檢測(cè)。將文庫(kù)菌與誘餌菌進(jìn)行雜交，與UBE3D具有相互作用的的另一基因則融合到轉(zhuǎn)錄激活域，蛋白質(zhì)間的相互作用使得轉(zhuǎn)錄因子重建導(dǎo)致相鄰的報(bào)道基因LacZ表達(dá)，從而用酵母質(zhì)粒小抽試劑盒(AXYGEN公司#AP-MN-P-250)提取變藍(lán)的克隆進(jìn)行陽(yáng)性克隆的鑒定。對(duì)于鑒定出來(lái)的陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增陽(yáng)性的酵母菌落，用山梨醇法提取酵母菌的基因組DNA提取，用Nano Drop檢測(cè)DNA濃度。

1.5 質(zhì)粒抽提

向30 μL液態(tài)的E.coliDH5α細(xì)胞加目的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，冰上30 min后熱激90 s，冷卻5 min。無(wú)菌環(huán)境下用150 μL無(wú)抗生素LB液態(tài)培養(yǎng)基稀釋滴加到培養(yǎng)皿上，37 ℃潮濕環(huán)境中培養(yǎng)16 h。挑單克隆到氨芐西林抗性液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 300 r/min低速搖床搖16 h。根據(jù)菌液量選擇抽提試劑盒(QIAGEN公司#10023)，按照步驟進(jìn)行抽提，用Nano drop檢測(cè)DNA濃度，注意OD260/OD280的范圍應(yīng)該在1.8～2.0之間，OD260/OD230大于2.0.否則證明有RNA或蛋白污染。將質(zhì)量濃度合適的質(zhì)粒保存在-20 ℃，或者短期內(nèi)(不超過(guò)3個(gè)月)可直接保存在4 ℃冰箱內(nèi)，進(jìn)行下一步使用。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃含5% CO2的Thermo細(xì)胞培養(yǎng)箱，高糖培養(yǎng)基添加10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液。細(xì)胞復(fù)蘇將融化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL LEP管內(nèi)，室溫低速離心，凍上清凍存液留細(xì)胞。加培液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，再加培液至總體積為10 mL，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。對(duì)于需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞前一天傳代，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要將細(xì)胞接種到相應(yīng)類(lèi)型的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，次日待細(xì)胞密度到60%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒比例為2∶1，并用OPTI-MEM分別進(jìn)行稀釋混勻，混合稀釋后的質(zhì)粒和脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑，室溫孵育20 min，將溶液用槍頭均勻滴加到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，隨后輕柔地適當(dāng)混勻細(xì)胞培液。標(biāo)明轉(zhuǎn)染時(shí)間和質(zhì)粒后，將細(xì)胞放回37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后收樣。

1.7 免疫共沉淀(Co-IP)和免疫印跡(Western blot)

轉(zhuǎn)染方法同上，在10 cm皿中加4 μg CPSF3-Myc和4 μg UBE3D-Flag質(zhì)粒，收樣前4 h，加終濃度為20 μmol/L的蛋白酶體抑制劑MG-132(溶劑為二甲基亞砜)棄培液，并用1×PBS清洗兩遍，加1 mL的NP-40裂解液，冰上裂30 min。用預(yù)冷好的的細(xì)胞刮板把裂解好的細(xì)胞刮下來(lái)，轉(zhuǎn)移到干凈的1.5 mL EP管內(nèi)。4 ℃冷凍離心機(jī)內(nèi)以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min。去管底部的沉淀，留上清，按IP實(shí)驗(yàn)中所需抗體稀釋比例加對(duì)應(yīng)的抗體。4 ℃翻轉(zhuǎn)搖床上緩慢翻轉(zhuǎn)搖動(dòng)過(guò)夜。每管加30 μL充分上下顛倒重懸后的Protein A+G Agarose beads，放到4 ℃翻轉(zhuǎn)搖床上緩慢翻轉(zhuǎn)搖動(dòng)3 h。離心后，吸去上清，用0.5 mL預(yù)冷的PBS重復(fù)洗4～5次沉淀，加60 μL 1×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，離心把beads離心至管底。95 ℃金屬浴5 min，上清即蛋白樣品，接下來(lái)進(jìn)行Western blot。

取部分細(xì)胞裂解液，與電泳上樣緩沖液混合后95 ℃金屬浴5 min，再進(jìn)行電泳跑膠和轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)好的膜進(jìn)行5%牛奶(以PBS+0.1%Tween溶解)封閉后，加入一抗4 ℃過(guò)夜。第二天用預(yù)冷的PBS+0.1% Tween溶液清洗3次后加入對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育2 h后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.8 qRT-PCR

首先用TRIzol法進(jìn)行RNA的提取，提取后的RNA按照TaKaRa公司提供的反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品。接著按照康為世紀(jì)公司SYBY Green Supermix試劑盒進(jìn)行操作，引物序列見(jiàn)表 3。每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)孔，采用管家基因β-actin作為內(nèi)參，每種樣品中某一基因的表達(dá)量用相對(duì)定量的方式進(jìn)行比較。

表3 用于UBE3D-CPSF3的qRT-PCR引物列表

1.9 泛素化

將帶HA標(biāo)簽的泛素表達(dá)質(zhì)粒、UBE3D-Flag及CPSF3-Myc質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。根據(jù)不同組別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后收樣，并于收樣前4 h加入蛋白酶體抑制劑(MG-132)處理。收集處理后的細(xì)胞，用免疫共沉淀法使用的裂解液裂解細(xì)胞，用外源的Myc抗體孵育過(guò)夜，以下步驟與外源性表達(dá)的免疫共沉淀相同，Western blot檢測(cè)泛素等表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母雙雜交和蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)篩選UBE3D候選底物

之前報(bào)道根據(jù)序列推測(cè)UBE3D可能是一種E3泛素連接酶[4]。為了篩選UBE3D的候選底物，我們分別使用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和Bioplex蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)兩種方法篩選UBE3D可能的底物蛋白。通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，我們一共獲得了337個(gè)陽(yáng)性克隆，其中326個(gè)在NCBI上有對(duì)應(yīng)的基因序列，去除測(cè)序結(jié)果中結(jié)合區(qū)段非CDS的基因，共獲得了286個(gè)候選互作底物。將在酵母雙雜交篩選中出現(xiàn)頻次大于3的候選底物共17個(gè)，按照出現(xiàn)頻次從高到低依次排序，結(jié)果如圖1(a)所示。同時(shí)，根據(jù)哈佛大學(xué)團(tuán)隊(duì)利用大規(guī)模親和純化質(zhì)譜技術(shù)建立的蛋白互作預(yù)測(cè)網(wǎng)站Bioplex Display篩選出UBE3D可能存在21個(gè)互作蛋白(圖1(b))。其中，CPSF3同時(shí)出現(xiàn)在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和Bioplex數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的結(jié)果中(圖1(c))。所以我們選定CPSF3為UBE3D候選底物蛋白。同時(shí)，我們也將酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)頻次最多的陽(yáng)性克隆MAP1S作為候選底物蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 利用酵母雙雜交和Bioplex 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)篩選UBE3D的候選底物Fig.1 The candidate substrates of UBE3D were screened by using yeast two-hybrid and Bioplex 2.0 database(a) 酵母雙雜交篩選出的出現(xiàn)頻次大于3的UBE3D候選底物蛋白；(b) Bioplex 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)中UBE3D的可能互作蛋白；(c) 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Bioplex 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果的交集.

2.2 UBE3D不影響MAP1S的蛋白表達(dá)水平

因?yàn)榉核鼗揎椇蟮陌械鞍卓赡鼙唤到饣蛘弑晦D(zhuǎn)移到細(xì)胞及細(xì)胞外的特定部位[1]，靶蛋白的表達(dá)量是否受E3泛素酶調(diào)控是一個(gè)關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)。所以我們對(duì)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)頻次最高的候選底物MAP1S首先進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其蛋白表達(dá)是否受到UBE3D的量的調(diào)控。我們?cè)?93T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染相同濃度的MAP1S-Flag質(zhì)粒和不同濃度梯度的UBE3D-Myc質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后收獲細(xì)胞。用內(nèi)源性抗體分別檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中MAP1S和UBE3D的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UBE3D的蛋白表達(dá)量的確隨質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量顯著增加，但MAP1S蛋白的表達(dá)沒(méi)有顯著變化(圖2)。因此，MAP1S的蛋白表達(dá)量不受UBE3D調(diào)控。

圖2 UBE3D質(zhì)粒濃度的改變不影響MAP1S蛋白的表達(dá)Fig.2 The change of UBE3D plasmid concentration did not affect the expression of MAP1S protein共轉(zhuǎn)染不同濃度的UBE3D-Myc和MAP1S-Flag質(zhì)粒.3組實(shí)驗(yàn)中MAP1S-Flag質(zhì)粒量保持每個(gè)12孔板單孔轉(zhuǎn)染0.125 μg，與之進(jìn)行共轉(zhuǎn)染的UBE3D-Myc質(zhì)粒量按照單孔內(nèi)不加該質(zhì)粒，加0.125 μg和加0.25 μg進(jìn)行遞增.為保證單孔轉(zhuǎn)染的質(zhì)?？偭恳恢拢肬BE3D-Myc質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的空載Pcmv-Myc質(zhì)粒將單孔總質(zhì)粒量補(bǔ)齊至0.375 μg.共轉(zhuǎn)染24 h后，圖(a)為Western blot圖片，圖(b)為Western blot統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果.(用VINCULIN做內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，n=3).所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n.s.表示不顯著，*表示P<0.05.

2.3 UBE3D調(diào)控CPSF3的蛋白表達(dá)水平

接下來(lái)我們重點(diǎn)測(cè)試了CPSF3是否是UBE3D的底物。類(lèi)似于MAP1S，我們也檢測(cè)了UBE3D是否會(huì)影響CPSF3的表達(dá)量。我們?cè)?93T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染相同濃度的CPSF3-Myc質(zhì)粒和不同濃度梯度的UBE3D-Flag質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后收獲細(xì)胞。然后通過(guò)Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)UBE3D對(duì)CPSF3蛋白和CPSF3 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)UBE3D可以顯著上調(diào)CPSF3蛋白的表達(dá)量，但不影響其mRNA的表達(dá)量(圖3(a))。我們也檢測(cè)了下調(diào)UBE3D表達(dá)后，CPSF3的表達(dá)量變化情況。在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入特異性的siRNA敲低UBE3D，轉(zhuǎn)染24 h后收獲細(xì)胞。然后通過(guò)Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)UBE3D和CPSF3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，siRNA顯著下調(diào)了UBE3D蛋白的表達(dá)。同時(shí)，CPSF3的蛋白量也隨UBE3D表達(dá)量下調(diào)而顯著下降，其mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化(圖3(b))。上述結(jié)果表明UBE3D可以正向調(diào)控CPSF3的蛋白表達(dá)，具有穩(wěn)定CPSF3蛋白的作用。

圖3 UBE3D調(diào)控CPSF3的蛋白表達(dá)水平Fig.3 Protein expression level of CPSF3 regulated by UBE3D共轉(zhuǎn)染不同濃度的UBE3D-Flag和CPSF3-Myc質(zhì)粒，三組實(shí)驗(yàn)中CPSF3-Myc質(zhì)粒量保持每個(gè)6孔板單孔轉(zhuǎn)染0.25 μg，與之進(jìn)行共轉(zhuǎn)染的UBE3D-Flag質(zhì)粒量按照單孔內(nèi)不加該質(zhì)粒，加0.25 μg和加0.50 μg進(jìn)行遞增.共轉(zhuǎn)染24 h后，分別提蛋白和RNA通過(guò)Western blot以及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其轉(zhuǎn)錄和翻譯水平.圖(a)為代表性印跡，用內(nèi)源性抗體檢測(cè)UBE3D和CPSF3的蛋白表達(dá)水平.圖(b)和(c)分別為UBE3D和CPSF3蛋白表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析(用VINCULIN做內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，n=4).圖(d)為CPSF3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平.圖(e)為轉(zhuǎn)染不同濃度的UBE3D的siRNA時(shí)的免疫印跡，并設(shè)置轉(zhuǎn)染ShNC作為對(duì)照組，加入siRNA的量每個(gè)6孔板單孔轉(zhuǎn)染0.15 μg、0.30 μg、0.50 μg進(jìn)行梯度遞增.最終選用0.50 ng的UBE3D siRNA進(jìn)行圖(f～h)的實(shí)驗(yàn)，并同時(shí)設(shè)置空轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)染非特異siRNA的對(duì)照組NC.轉(zhuǎn)染24 h后，提蛋白通過(guò)Western blot檢測(cè)翻譯水平，圖(f)和(g)分別為CPSF3和UBE3D蛋白量的統(tǒng)計(jì)分析，圖(h)為CPSF3的mRNA相對(duì)表達(dá)水平(用VINCULIN做內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，n=4).所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差.N.S,表示不顯著，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.

2.4 Co-IP顯示UBE3D和CPSF3之間存在相互作用

驗(yàn)證了CPSF3表達(dá)量受UBE3D調(diào)控后，我們進(jìn)一步用Co-IP驗(yàn)證了CPSF3和UBE3D之間的相互作用。在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染了帶Myc標(biāo)簽的CPSF3和帶Flag標(biāo)簽的UBE3D表達(dá)質(zhì)粒，分別利用外源Myc和Flag抗體和內(nèi)源的CPSF3抗體做Co-IP，由WB檢測(cè)IP結(jié)果。如圖4顯示，用CPSF3或Myc抗體IP，可以免疫共沉淀UBE3D；用Flag抗體IP，可以免疫共沉淀CPSF3.這一結(jié)果表明CPSF3和UBE3D之間確實(shí)存在互作。

圖4 CO-IP顯示UBE3D和CPSF3之間存在相互作用Fig.4 CO-IP shows the interaction between UBE3D and CPSF3在10 cm皿培養(yǎng)293T細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染4 μg UBE3D-Flag和4 μg CPSF3-Myc質(zhì)粒(對(duì)照組加對(duì)應(yīng)的空載)，轉(zhuǎn)染20 h后(收樣前4 h)加終濃度為20 μmol/L的蛋白酶體抑制劑MG-132，培養(yǎng)24 h后收細(xì)胞.圖(a)用CPSF3質(zhì)粒上帶的Myc做Co-IP，用二者內(nèi)源抗體分別檢測(cè)UBE3D和CPSF3的表達(dá)；圖(b)用UBE3D質(zhì)粒上帶的Flag做Co-IP，用二者內(nèi)源性抗體檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，n>4.

2.5 UBE3D不改變CPSF3的多聚泛素化水平

根據(jù)UBE3D可能是一個(gè)E3泛素連接酶的功能背景[4]，下一步我們檢測(cè)了UBE3D對(duì)于CPSF3泛素化水平的影響。為了排除內(nèi)源蛋白的影響，我們?cè)?93T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入帶Myc標(biāo)簽的CPSF3表達(dá)質(zhì)粒。同時(shí)轉(zhuǎn)入帶HA標(biāo)簽的泛素表達(dá)質(zhì)粒和表達(dá)UBE3D的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h，在收樣前4 h，加入MG132.然后通過(guò)Myc抗體免疫共沉淀富集CPSF3，用Western blot檢測(cè)HA標(biāo)記的泛素表達(dá)量。與對(duì)照組相比，CPSF3的多聚泛素化水平(77 kDa)沒(méi)有顯著變化(圖5)。

圖5 UBE3D不改變CPSF3的多聚泛素化水平Fig.5 UBE3D does not change the ubiquitin level of CPSF3在10 cm皿培養(yǎng)293T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染UBE3D的特異性siRNA，轉(zhuǎn)染20 h后(收樣前4 h)加終濃度為20 μmol/L的蛋白酶體抑制劑MG-132，培養(yǎng)24 h后收細(xì)胞.用CPSF質(zhì)粒上帶的Myc做IP，用泛素抗體檢測(cè)泛素化水平，圖(a)為代表性Western blot圖，圖(b)為CPSF3多聚泛素化的統(tǒng)計(jì)分析(用Input及對(duì)照組做內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，n=3).所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差.ns表示不顯著，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.

3 總結(jié)與討論

E3泛素酶功能研究的重點(diǎn)之一就在于深尋找并鑒定其底物。本研究主要針對(duì)UBE3D可能是一個(gè)E3泛素連接酶的功能背景，尋找其特異性的底物進(jìn)行研究。通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，篩選出的17個(gè)候選底物中，首先挑選了MAP1S進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)UBE3D對(duì)MAP1S沒(méi)有調(diào)控作用，不影響MAP1S的蛋白表達(dá)水平。這可能由于酵母雙雜交在活酵母菌中受復(fù)雜的環(huán)境影響，一定程度上會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況。而我們根據(jù)酵母雙雜交和大規(guī)模親和純化質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)Bioplex兩種方法的交集篩選的CPSF3的表達(dá)的確受UBE3D的調(diào)控。這表明高通量篩選數(shù)據(jù)中易出現(xiàn)假陽(yáng)性，所以多種篩選方法的聯(lián)用是必須的。

我們的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CPSF3與UBE3D之間的相互作用。值得注意的是，UBE3D具有正向調(diào)控CPSF3的蛋白表達(dá)的功能，即UBE3D起到了穩(wěn)定CPSF3的作用。這與經(jīng)典的泛素化參與蛋白質(zhì)降解過(guò)程調(diào)控的功能不同。泛素化是真核生物中主要的胞漿蛋白水解系統(tǒng)[12-13]。常見(jiàn)的是泛素-蛋白酶體的蛋白質(zhì)分解途徑。然而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，泛素化修飾后并非一定會(huì)導(dǎo)致被修飾蛋白的降解[14]，也有泛素偶聯(lián)的底物在去泛素酶作用下不發(fā)生降解[15]。泛素化修飾可以分為單泛素化、多泛素化和多聚泛素化3種類(lèi)型。前兩種都是指泛素分子以單體形式結(jié)合底物蛋白的賴(lài)氨酸殘基對(duì)其進(jìn)行泛素化修飾，差別在于被修飾位點(diǎn)數(shù)目。這兩種泛素修飾多與DNA修復(fù)、蛋白定位有關(guān)[15]。第3種多聚泛素化，則是由于泛素分子自身攜帶的7個(gè)賴(lài)氨酸殘基(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)[16]，以及N端甲硫氨酸(M1)[17]都可以被其他游離的泛素分子修飾，從而形成多聚泛素鏈。在不同類(lèi)型的多聚泛素鏈修飾中，K48、K11修飾介導(dǎo)的經(jīng)典的降解途徑，被這兩種多聚泛素化修飾的底物蛋白最終會(huì)進(jìn)入蛋白酶體發(fā)生降解。M1和K63介導(dǎo)的則屬于非降解修飾，主要用于輔助底物蛋白復(fù)合物的組裝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]，其他位點(diǎn)的多聚泛素化鏈修飾的功能尚缺乏了解。我們的泛素化實(shí)驗(yàn)結(jié)果中沒(méi)有檢測(cè)到CPSF3的多聚泛素化水平有明顯變化。但是，UBE3D對(duì)于CPSF3是否存在單個(gè)位點(diǎn)的泛素化或者多泛素化作用，則需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)深入探索。

CPSF3是切割和聚腺苷酸化特異性因子的73 kDa亞基,該亞基是金屬-β-內(nèi)酰胺酶家族的成員,具有核酸內(nèi)切酶的作用，該酶識(shí)別pre-mRNA的3′切割位點(diǎn)AAUAAA，進(jìn)行切割，然后pre-mRNA發(fā)生多聚腺苷酸化形成新的末端[19]。因此，CPSF3對(duì)于mRNA的成熟具有重要的作用，其穩(wěn)定的表達(dá)，對(duì)于基因的表達(dá)至關(guān)重要[20]。相關(guān)報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，抑制CPSF3的表達(dá)，可以使HCT-116細(xì)胞中TGFβ2蛋白和磷酸化的SMAD3水平下降，從而抑制TGF-β信號(hào)通路[21]，我們推測(cè)CPSF3對(duì)TGF-β信號(hào)通路的調(diào)控功能在胚胎發(fā)育中也有重要作用。UBE3D可能通過(guò)與CPSF3相互作用，參與調(diào)控早期胚胎發(fā)育的各個(gè)過(guò)程。此外已知E3泛素連接酶和底物之間并非一對(duì)一的關(guān)系，即一個(gè)E3泛素連接酶可能對(duì)應(yīng)多種底物，一種底物也可以受到多種E3泛素連接酶的作用[22-24]。因此，后續(xù)對(duì)于UBE3D是否存在其他底物也需要進(jìn)一步深入探索。