梁思怡，紀勝男，田璐肖，智靜驛，李麗麗，哈婧

(1.河北科技大學 化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北御芝林藥業(yè)有限公司，河北 邢臺 054400)

艾葉(Artemisiaargyi)為菊科多年生草本植物，又名冰臺、炙草等[1].夏季花未開時采摘其干燥葉，可全草入藥，味辛、苦，對慢性支氣管炎、肺氣腫、肝炎、哮喘等疾病都有療效[2-4].艾葉主要含有揮發(fā)油、酚類、鞣質、苯丙素類等活性物質[5-6]，具有抗真菌、細菌、病毒感染、各種炎癥等作用[7-8].中藥配方顆粒，是將單味中藥飲片經提取、濃縮、干燥、制粒、包裝等過程制成的純中藥產品，是傳統(tǒng)中藥的一種新的用藥形式[9-10]，有方便攜帶、無需煎煮、便于醫(yī)生調劑等優(yōu)點[11-13].配方顆粒在制備過程中以“標準湯劑”為參照物，制備過程中經高溫煎煮后，揮發(fā)油成分會隨水蒸氣蒸餾，導致?lián)]發(fā)油為主要成分的藥物有效成分散失[14].β-CD是由淀粉在微生物酶作用下產生的環(huán)狀低聚糖，在現代的制劑生產中一般使用β-CD與揮發(fā)油制成包合物[15-16].鄒新成[17]通過對揮發(fā)油的包合率、收得率及綜合評分進行考查，用氣相色譜儀對制得的包合物進行含量測定，以桉油精和龍腦的總含量計算，3批包合物的包合率分別為81.99%、76.11%、87.14%.周瑤、沈德鳳等[18-19]提出飽和水溶液包合法，操作簡單，但容易受人為和儀器等不可控因素的影響造成實驗差異.本實驗通過優(yōu)化揮發(fā)油與β-CD包合工藝，得到最佳包合條件，在此條件下進行配方工藝制備，大大提高了制備艾葉配方顆粒過程中指標成分的轉移率，增加了藥物的穩(wěn)定性[20-21]，為指導企業(yè)實際生產提供一定科學依據.

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

艾葉飲片(批號20201211，河南，樂仁堂大藥房提供)；桉油精(PS020020，中國食品藥品檢定研究院)；龍腦(PS2103326，中國食品藥品檢定研究院)；乙酸乙酯、無水乙醇、正己烷(均為分析純，天津市永大化學試劑有限公司)；β-環(huán)糊精(天津市大茂化學試劑廠)；純凈水(石家莊山中純凈水有限公司).

1.2 實驗儀器

電子天平(AL204，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；SQP十萬分之一電子天平(德國賽多利斯科學儀器有限公司)；98-1-B型電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；RE-52B旋轉蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；SP SCIENTIFIC冷凍干燥機；GC Smart(GC-2018)氣相色譜儀；HT-1色譜柱(上海星銥色譜科技).

2 實驗內容

2.1 飲片含量測定方法

以2020版《中國藥典》[22]為依據，按照氣相色譜法通則(0521)測定.取艾葉飲片2.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水300 mL，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶為止，再加乙酸乙酯2.5 mL，連接回流冷凝管.加熱至沸騰5 h，放冷，分取乙酸乙酯，置10 mL量瓶中，用乙酸乙酯分次洗滌測定器及冷凝管，轉入同一量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，即得.精密吸取供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，進行含量測定，氣相色譜條件見表1，測定結果見表2.

表1 含量測定程序升溫Tab.1 Content determination by temperature programming

表2 飲片含量測定結果Tab.2 Determination results of decoction pieces

2.2 揮發(fā)油提取

2.2.1 飲片粉碎對揮發(fā)油提取的影響

取同一批藥材4份，每份60 g，2份粉碎，2份不粉碎，每份加10倍量水，浸泡1 h，加熱回流4.5 h，讀取揮發(fā)油量，結果見表3.

表3 飲片粉碎對揮發(fā)油提取的影響Tab.3 Effect of decoction pieces crushing on extraction of volatile oil

未粉碎飲片出油量較高，可能是由于艾葉粉碎后碎片過多，揮發(fā)油不能夠完全外逸，因此在后續(xù)揮發(fā)油提取中對艾葉飲片不進行粉碎工藝.

通過對加水量、浸泡時間、提取時間進行3因素3水平的正交實驗，提取揮發(fā)油的最佳工藝為艾葉飲片100 g，不粉碎，12倍水浸泡1.5 h，按2020版《中國藥典》第四部項下通則(2204)揮發(fā)油測定法安裝冷凝回流裝置，冷凝回流5 h，靜置1 h后收集提取的揮發(fā)油，放入冰箱冷藏24 h后用于包合.

2.2.2 揮發(fā)油空白回收實驗

揮發(fā)油具有不穩(wěn)定性，加熱條件下易隨水蒸氣蒸餾，在加熱回流提取揮發(fā)油的過程中，導致?lián)]發(fā)油有損失，為消除包合率計算誤差，故對揮發(fā)油進行空白回收實驗.

精密量取艾葉揮發(fā)油1 mL，至圓底燒瓶中，加300 mL水，回流提取5 h，靜置1 h后讀取回收的揮發(fā)油體積，平行3組實驗，結果見表4.

表4 揮發(fā)油空白回收率(n=3)Tab.4 Blank recovery of volatile oil(n=3)

揮發(fā)油空白回收率[23]公式為

(1)

2.3 揮發(fā)油包合工藝

參考文獻[17-19,24]的揮發(fā)油包合工藝，初定工藝為V(揮發(fā)油)∶V(β-CD)∶V(水)=1∶8∶10，V(揮發(fā)油)∶V(乙醇)=1∶1，包合溫度60 ℃，包合時間2 h，平行測定3次，所得包合率分別為81.99%、76.11%、87.14%，包合率較低，在此條件下對包合工藝進行優(yōu)化.

通過對包合溫度、包合時間、揮發(fā)油與水和β-CD的比例進行考查，以包合率作考查指標，結果得最佳包合工藝為V(揮發(fā)油)∶V(β-CD)∶V(水)=1∶10∶12，將適量β-CD與水置于圓底燒瓶中，65 ℃下恒溫攪拌1 h，緩慢滴加揮發(fā)油與無水乙醇體積比1∶2混合的稀釋液，約10 s 1滴，繼續(xù)恒溫磁力攪拌1 h，放冷，得揮發(fā)油包合物水溶液，冰箱預凍，冷凍干燥即得.冷凍干燥參數見表5.

表5 冷凍干燥參數Tab.5 Freeze drying parameters

2.4 包合率的測定

揮發(fā)油供試品的制備：取0.5 mL揮發(fā)油，精密稱定，置500 mL圓底燒瓶中，加入300 mL水，按照2.1項下供試品制備方法冷凝回流提取，靜置1 h后將乙酸乙酯層轉入10 mL容量瓶中，稀釋至刻度.

對照品溶液制備：取桉油精和龍腦適量溶于乙酸乙酯，制成含桉油精0.2 mg/mL，龍腦0.1 mg/mL的混合對照溶液.

包合物供試品的制備：稱取包合物適量，精密稱定，按照2.1項下方法提取供試品溶液，精密吸取供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，進行含量測定，共測試5組包合物.結果見表6.

表6 包合率測定結果(n=5)Tab.6 Result of inclusion rate determination(n=5)

(2)

優(yōu)化后的包合工藝所制得包合物的包合率有明顯提高，通過平行實驗可知該包合工藝穩(wěn)定可行，可用于后續(xù)配方顆粒制備過程中揮發(fā)油的包合.

2.5 艾葉“標準湯劑”制備工藝優(yōu)化

取未進行包合工藝制備的艾葉“標準湯劑”2.5 g，按《中國藥典》艾葉項下含量測定提取供試品，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入正己烷25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用正己烷補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得.精密吸取供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，未檢出指標成分，結果見圖1.

圖1 艾葉“標準湯劑”含量測定色譜Fig.1 Chromatogram of artemisia argyi “standard decoction” for content determination

優(yōu)化后的制備工藝為：取艾葉飲片100 g，12倍量水浸泡1.5 h，安裝冷凝回流裝置提取揮發(fā)油，將提取的揮發(fā)油制成包合物.藥液過濾放冷待用，藥渣煎煮2次，第1煎加12倍量水，煮沸后煎煮30 min，300目(孔徑48 μm)濾布趁熱濾過；第2煎加10倍量水，煮沸后煎煮20 min，300目(孔徑48 μm)濾布趁熱濾過，3次濾液合并，減壓濃縮(溫度60 ℃)至約1∶2(投料量∶浸膏體積=1 g∶2 mL)的浸膏，噴霧干燥，將包合物與干燥粉混合，即得.

取標準湯劑0.7 g，精密稱定，按2.1項下供試品制備方法制備標準湯劑供試品，精密吸取對照品溶液與供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，進行含量測定，并計算桉油精及龍腦的轉移率.結果見表7.

表7 “標準湯劑”含量測定結果Tab.7 Determination results of “standard decoction”

(3)

由數據可知，桉油精、龍腦的平均轉移率為33.71%、29.61%，按均值的30%上下浮動，得桉油精轉移率為23.60%～43.82%，龍腦的轉移率為20.73%～38.49%.

2.6 艾葉“標準湯劑”指紋圖譜

為了考查從艾葉“標準湯劑”到配方顆粒制備過程中化學成分的變化，加強專屬性鑒別，進行色譜條件優(yōu)化，并建立“標準湯劑”指紋圖譜對其進行評價.將12批艾葉“標準湯劑”色譜圖導入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)中”，選出10個共有峰，并將桉油精色譜峰定為參照峰.指紋圖譜氣相條件見表8，“標準湯劑”特征圖譜見圖2，疊加圖譜見圖3.

表8 指紋圖譜程序升溫Tab.8 Temperature programming of fingerprint

圖2 艾葉“標準湯劑”特征圖譜Fig.2 Characteristic spectrum of Artemisia argyi “standard decoction”

圖3 12批艾葉“標準湯劑”疊加圖譜Fig.3 12 Batches of artemisiae argyi “standard decoction” overlay mapping

2.7 艾葉配方顆粒制備工藝

取艾葉飲片100 g，12倍量水浸泡1.5 h，安裝冷凝回流裝置提取揮發(fā)油，將提取的揮發(fā)油制成包合物.藥液過濾放冷待用，藥渣煎煮2次，12倍水，每次1 h，300目(孔徑48 μm)濾布趁熱濾過，3次濾液合并，減壓濃縮(溫度60 ℃)至約1∶2(投料量(1 g)∶浸膏體積(2 mL))的浸膏，噴霧干燥，將制得的包合物與干燥粉、適量輔料混合制粒，即得.

取配方顆粒0.7 g，精密稱定，按照2.1項下供試品制備方法制備配方顆粒供試品，精密吸取對照品溶液與供試品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，進行含量測定，結果見表9.

表9 配方顆粒含量測定結果Tab.9 Determination results of formula granule

2.8 飲片、標準湯劑、配方顆粒中指標成分的相關性

2.8.1 指標成分轉移率數據

將艾葉飲片、“標準湯劑”和配方顆粒含量測定結果及出膏率進行匯總，比較桉油精和龍腦在三者間的傳遞情況.具體見表10，由匯總結果可知，桉油精和龍腦在“標準湯劑”和配方顆粒中的轉移率相近.

表10 指標成分轉移率結果Tab.10 Index component tromsfer results

標準湯劑中桉油精的平均轉移率為33.71%，龍腦的平均轉移率為29.61%.配方顆粒中桉油精的平均轉移率為33.48%，龍腦的平均轉移率為25.41%，實驗數據表明此方法制得的配方顆粒和標準湯劑成分含量并無顯著差異.

2.8.2 配方顆粒與“標準湯劑”特征圖譜對比

稱量12批艾葉配方顆粒，按2.1項下供試品制備過程，配制樣品溶液；根據指紋圖譜檢測條件測定，記錄色譜圖.以艾葉“標準湯劑”的色譜圖為對照圖譜，將每批配方顆粒的特征圖譜與對照圖譜進行相似度比較.由結果可知，配方顆粒與“標準湯劑”具有較高的相似性，且艾葉配方顆粒的化學成分與“標準湯劑”基本一致，結果見表11、圖4.

表11 相似度評價結果Tab.11 Similarity evaluation results

圖4 配方顆粒與“標準湯劑”、飲片特征圖譜對比Fig.4 Comparison of characteristic spectrum between formula granule and “standard decoction” and decoction pieces

3 討論

艾葉的主要活性成分是揮發(fā)油類，包括醚類、醇類、半萜類、芳香族化合物等化學結構[25].其中桉油精、龍腦在揮發(fā)油類中占比較大，桉油精具有抗炎、抗菌等作用，龍腦也具有一定的抗菌和鎮(zhèn)痛作用[26-28].2020版《中國藥典》以2種化合物為艾葉的質量控制成分，要求飲片中桉油精含量不得低于0.05%，龍腦含量不得低于0.02%.將飲片直接進行水提工藝，在標準湯劑中并未檢測到桉油精和龍腦，說明揮發(fā)油類在飲片煎煮過程中大多流失.進行揮發(fā)油提取包合后，在標準湯劑的含量測定中，桉油精和龍腦的平均含量分別為0.738 4、0.334 1 mg/g，減少了有效成分的揮發(fā)損失.

4 結語

根據傳統(tǒng)中藥煎煮操作規(guī)范對艾葉飲片及其標準湯劑進行含量測定，發(fā)現艾葉飲片含量測定合格，但在標準湯劑中未檢測出桉油精及龍腦.二者都屬于揮發(fā)油類，具有不穩(wěn)定性，為保證有效成分的轉移，在煎煮艾葉標準湯劑時，需將揮發(fā)油類成分進行提取，與β-CD形成包合物后再與噴霧干燥粉混合制成配方顆粒.水溶液飽和法相較于其他包合方法操作簡單，包合率高，且適用于大生產，利用本實驗優(yōu)化后的包合工藝對艾葉揮發(fā)油進行包合，測得的平均包合率為96.40%，配方顆粒中桉油精和龍腦的平均轉移率為33.48%，25.41%.數據表明利用該工藝有效減少了揮發(fā)油類成分在煎煮過程中的流失，工藝穩(wěn)定可行，為艾葉配方顆粒的工業(yè)化生產提供理論參考.在本實驗揮發(fā)油的提取工藝中，浸泡時間和提取時間相對較長，延長了含量測定和配方顆粒制備的前期工作，后續(xù)將對此部分進行深一步的考查優(yōu)化.