么松慧，陳慧，楊洋,3，萬悅,4，初源，孫磊，于淼

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生命組學(xué)研究所，北京 100850；3.天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300072；4.安徽醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中一種重要的細(xì)胞器，主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的折疊和加工[1]，同時(shí)也參與糖類和脂類物質(zhì)[2]的合成，承擔(dān)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸工作.當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境刺激后，細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化導(dǎo)致大量未正常折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集，或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)都會(huì)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERs)[3]，激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)[4].誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激原因除了未折疊蛋白質(zhì)的累積和鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡[5]，還包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜成分的改變、營養(yǎng)物質(zhì)的變化如葡萄糖的缺失、脂毒性物質(zhì)侵?jǐn)_及病毒感染等[6].目前已有大量研究證明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與眾多代謝相關(guān)綜合性疾病如二型糖尿病[7]、胰島素抵抗[8]、非酒精性脂肪肝[9]、肥胖[10]等的發(fā)生發(fā)展有關(guān).近年來有研究指出，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生與脂代謝之間有著密切的聯(lián)系[11].內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以影響脂肪細(xì)胞的分化[12]、調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平、影響脂肪酸的合成和甘油三酯的分泌等[13].

衣霉素(tunicamycin,TM)是一種實(shí)驗(yàn)中常用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑，可以通過抑制糖蛋白鏈合成過程進(jìn)而抑制糖基化的修飾，從而導(dǎo)致大量不能正常折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中累積，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激.有研究表明，低劑量TM誘導(dǎo)輕度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，而較高程度且長期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在使用TM建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激小鼠模型的過程中，高劑量TM處理組小鼠死亡率偏高，并出現(xiàn)體質(zhì)量和血糖大幅降低的現(xiàn)象.為了更好地理解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)脂肪組織的影響，實(shí)驗(yàn)中使用2種中等劑量的TM處理小鼠，并在不同時(shí)間點(diǎn)觀察脂肪組織的變化.研究結(jié)果將有助于完善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與脂肪組織之間的聯(lián)系，為應(yīng)激性脂代謝相關(guān)疾病的治療提供參考.

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

TM(上海源葉生物科技有限公司)；GRP78抗體(美國Santa Cruz公司)；CHOP抗體(美國Santa Cruz公司)；游離脂肪酸(NEFA)試劑盒(南京建成)；小鼠瘦素(LEP)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；小鼠脂聯(lián)素(ADP)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J的8周齡雄性小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院27號(hào)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無特殊病原體(SPF)級(jí)動(dòng)物房.實(shí)驗(yàn)前所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均處于相同飼養(yǎng)環(huán)境內(nèi)，飼養(yǎng)條件均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理標(biāo)準(zhǔn).

1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激小鼠模型的建立

1.3.1 分組及處理?xiàng)l件

將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分組，每組4～5只.按照小鼠體質(zhì)量每kg 1.0 mg或1.5 mg的TM對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，在注射24、48、72 h后分別處死小鼠，摘取附睪處白色脂肪組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè).

1.3.2 Realtime-PCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA水平

為確認(rèn)TM處理后小鼠附睪處白色脂肪組織中是否發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過Realtime-PCR檢測(cè)白色脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性因子如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(Grp78)、C/EBP同源蛋白(Chop)、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Perk)、轉(zhuǎn)錄激活因子4(Atf4)及轉(zhuǎn)錄激活因子6(Atf6)的mRNA水平.利用Trizol法提取小鼠附睪處白色脂肪組織中RNA，使用Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成相應(yīng)cDNA.Realtime-PCR反應(yīng)體系為：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、DEPC水3 μL、cDNA模板5 μL、上游及下游引物各1 μL.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min后，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃ 延伸45 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán).使用TATA盒結(jié)合蛋白(Tbp)為校正內(nèi)參，PCR所需引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1.

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primers for RT-PCR

1.3.3 Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平

通過Western blot對(duì)TM處理后小鼠附睪處白色脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，β-actin為內(nèi)參.取白色脂肪組織加入裂解液后勻漿，12 000 r/min離心10 min，上清液即為總蛋白.在總蛋白中加入5×Loading Buffer煮沸5 min，離心后進(jìn)行體積分?jǐn)?shù)10%的SDS-PAGE凝膠電泳.電泳結(jié)束后在100 mA電壓下轉(zhuǎn)膜2 h，隨后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的封閉液室溫封閉2 h.4 ℃孵育一抗過夜，1×TBST洗膜5 min，重復(fù)洗3次；室溫孵育二抗1 h，1×TBST洗膜10 min，重復(fù)4次.用濾紙吸去膜上多余TBST后加顯色液試劑避光顯影.

1.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下脂肪組織的變化

1.4.1 脂肪病理組織觀察

取小鼠附睪處白色脂肪組織，切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小組織塊置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的甲醛磷酸緩沖鹽(PBS)溶液中固定，48 h后送北京基譜生物公司做HE染色.染色結(jié)果使用熒光顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，CaseViewer軟件統(tǒng)計(jì)脂肪細(xì)胞直徑.

1.4.2 白色脂肪組織中甘油三酯及NEFA含量測(cè)定

1.4.2.1 甘油三酯含量測(cè)定

取100 mg小鼠附睪處白色脂肪組織(記為m)于EP管中，加入3～5顆磁珠、200 μL三氯甲烷、100 μL甲醇，在組織研磨機(jī)中震蕩60 s，再加入100 μL甲醇，震蕩30 s，震蕩后加200 μL水，再次震蕩60 s.震蕩結(jié)束后以12 000 r/min離心10 min.提前將所需新的EP管稱質(zhì)量，記為m0.離心后吸取最下層液體于新EP管中，在烘干機(jī)中烘干管內(nèi)液體.烘干后再次稱量EP管質(zhì)量，記為m1.根據(jù)以下公式計(jì)算脂肪組織中甘油三酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：w(甘油三酯)=(m1-m0)/m.

1.4.2.2 NEFA含量測(cè)定

取50 mg白色脂肪組織于EP管中，加入3～5顆磁珠及500 μL PBS后勻漿，12 000 r/min離心10 min后取上清液使用試劑盒檢測(cè)NEFA水平.

1.4.3 Realtime-PCR檢測(cè)相關(guān)因子mRNA水平

通過Realtime-PCR檢測(cè)脂代謝相關(guān)因子脂肪甘油三酯酯酶(Atgl)、β-2腎上腺素能受體(Adrb2)、脂聯(lián)素(Adp)、瘦素(Lep)及炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(Tnfα)、白細(xì)胞介素-1β(Il-1β)、白細(xì)胞介素-6(Il-6)的mRNA水平.方法如1.3.2中所述，引物序列見表1.

1.4.4 ELISA試劑盒檢測(cè)脂肪細(xì)胞因子水平

小鼠眼球取血，將收集的血液樣本3 000 r/min離心10 min,取上清液.使用相應(yīng)ELISA試劑盒檢測(cè)血清中ADP及LEP水平.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由GraphPad Prism 8處理，各組間數(shù)據(jù)比較均采用t檢驗(yàn)，N=4～5，當(dāng)P<0.05時(shí)為有顯著差異(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1).

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的建立

不同劑量TM腹腔注射小鼠24、48、72 h后，摘眼球取血，隨后脫頸處死小鼠，取附睪處白色脂肪組織.利用Realtime-PCR和Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激小鼠模型建立成功與否.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組相比，經(jīng)過1.0、1.5 mg/kg TM處理后，白色脂肪組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA水平(圖1a)大多顯著升高(P<0.05)；GRP78、CHOP蛋白表達(dá)水平(圖1b-c)在處理72 h后均有顯著升高(P<0.05).以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：TM誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激小鼠模型造模成功.但是，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)過程中，1.5 mg/kg處理72 h組出現(xiàn)了小鼠死亡現(xiàn)象，死亡率為40%，其余處理組死亡率均為0.推測(cè)死亡原因可能為較高劑量TM激活了細(xì)胞凋亡途徑，小鼠心力衰竭導(dǎo)致死亡.由此比較認(rèn)為，使用1.0 mg/kg劑量誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激更為適宜.

a.Realtime-PCR檢測(cè)結(jié)果；b.Western blot檢測(cè)處理72 h后GRP78、CHOP表達(dá)情況；c.蛋白表達(dá)灰度統(tǒng)計(jì).圖1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因mRNA水平與蛋白表達(dá)情況Fig.1 mRNA level and protein expression of endoplasmic reticulum stress genes

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下白色脂肪細(xì)胞的變化

TM處理之后，在各組小鼠進(jìn)食飲水狀況相同的情況下，與Control組比較，處理組小鼠的體質(zhì)量(圖2a)大多有顯著降低(P<0.05)，并且白色脂肪組織質(zhì)量與體質(zhì)量的比例(圖2b)均有明顯降低(P<0.05).細(xì)胞直徑統(tǒng)計(jì)(圖2c)及HE染色結(jié)果(圖2d)也顯示，TM處理后白色脂肪細(xì)胞直徑大多明顯降低，并且在處理72 h后脂肪細(xì)胞直徑減小最為顯著(P<0.000 1).以上結(jié)果說明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生可以降低白色脂肪組織質(zhì)量與體質(zhì)量的比例、減小白色脂肪細(xì)胞直徑.根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，這些現(xiàn)象的發(fā)生可能是脂肪組織中脂解增多所導(dǎo)致的.

圖2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下小鼠體質(zhì)量(a)、白色脂肪組織比例(b)和細(xì)胞直徑(c)的變化及脂肪細(xì)胞HE染色(d)Fig.2 Changes of body weight (a),proportion of white adipose tissue (b),cell diameter (c)of mice and HE staining of adipocytes (d) under endoplasmic reticulum stress

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)脂解反應(yīng)的影響

為進(jìn)一步檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否能引起脂肪組織中發(fā)生脂解，在TM處理后不同時(shí)間點(diǎn)取小鼠白色脂肪組織進(jìn)行檢測(cè).結(jié)果顯示，與Control組相比，TM處理72 h后，小鼠白色脂肪組織中甘油三酯含量(圖3a)顯著降低(P<0.05)，并且脂肪組織中NEFA水平(圖3b)顯著升高(P<0.05)，由此可證明白色脂肪組織中有脂肪分解發(fā)生.同時(shí)，RT-PCR結(jié)果也顯示，TM處理一定時(shí)間后，脂肪組織中Atgl和Adrb2的mRNA水平升高(圖3c-d)，再次證明脂肪組織中脂解反應(yīng)增多.以上結(jié)果說明，TM誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)了脂肪組織中脂肪分解的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪組織質(zhì)量與體質(zhì)量的比例降低和脂肪細(xì)胞直徑的減小.

a.脂肪組織中甘油三酯總量變化;b.脂肪組織中NEFA水平變化；c.d.不同處理脂解因子的mRNA水平.圖3 脂肪組織中脂解反應(yīng)的檢測(cè)Fig.3 Detection of lipolysis in adipose tissue

2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，脂肪細(xì)胞因子和炎癥水平的變化

通過Realtime-PCR和ELISA進(jìn)一步檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下脂肪細(xì)胞因子和炎癥水平變化.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激處理組小鼠血清及白色脂肪組織中脂肪細(xì)胞因子水平(圖4a-b)大多有明顯降低(P<0.05)；并且白色脂肪組織中多種炎性因子mRNA的水平(圖4c)也部分升高.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生可以導(dǎo)致白色脂肪組織中Adp、Lep水平降低，炎癥水平升高.

a.脂肪細(xì)胞因子mRNA水平；b.血清中ADP、LEP水平；c.脂肪組織中炎癥因子mRNA水平圖4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下脂肪細(xì)胞因子水平及炎癥水平變化Fig.4 Changes of adipocytokine levels and inflammation levels under endoplasmic reticulum stress

3 討論

脂肪組織在維持能量物質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的作用，可以通過感受機(jī)體內(nèi)膽固醇、葡萄糖等水平變化進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)[14].本實(shí)驗(yàn)使用TM建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激小鼠模型，誘導(dǎo)白色脂肪組織中發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激.結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以影響脂肪組織中的脂代謝.在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA水平及蛋白表達(dá)升高的情況下，小鼠體質(zhì)量和白色脂肪組織的比例均有顯著降低，白色脂肪細(xì)胞直徑也明顯減小.這與之前多數(shù)研究結(jié)果是一致的.同時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，脂肪組織中甘油三酯總含量減少，NEFA水平升高，并且脂解反應(yīng)相關(guān)基因mRNA水平升高.脂肪分解釋放的NEFA作為一種脂毒性因子，可能會(huì)進(jìn)一步加劇脂肪組織中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度[15]，誘導(dǎo)組織內(nèi)炎癥發(fā)生.脂肪細(xì)胞分泌的ADP和LEP同為保護(hù)性脂肪因子[16]，在脂代謝穩(wěn)態(tài)維持和抑制炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用.離體脂肪組織中，ADP能抑制組織內(nèi)炎癥發(fā)生[17]；LEP可以通過調(diào)控自噬機(jī)制抑制炎癥小體激活.研究中也發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下脂肪組織中Adp、LepmRNA水平降低，炎癥水平升高.結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以介導(dǎo)脂肪組織中炎癥的發(fā)生.

此外，綜合比較不同處理組的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.0mg/kg TM處理72h誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效果最佳.不同程度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)組織的影響大相徑庭，低劑量誘導(dǎo)的輕度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以適當(dāng)激活細(xì)胞自噬從而產(chǎn)生一定的保護(hù)作用；而高劑量或持續(xù)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則會(huì)激活細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致機(jī)體嚴(yán)重?fù)p傷甚至死亡[18].1.5mg/kg TM處理組雖然也能成功誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，但在72h的條件下小鼠出現(xiàn)了較高的死亡率，推測(cè)可能由于較高劑量TM激活了細(xì)胞凋亡途徑，小鼠心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡進(jìn)而心力衰竭導(dǎo)致死亡.因此，1.0mg/kg TM處理小鼠72h誘導(dǎo)白色脂肪組織發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的效果最適宜.

綜上所述，TM誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以導(dǎo)致白色脂肪組織中脂解的大量發(fā)生，并且導(dǎo)致脂肪細(xì)胞因子分泌減少、炎癥反應(yīng)增多，導(dǎo)致脂代謝紊亂.本研究為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件的設(shè)立提供了參考意義，并且有助于進(jìn)一步了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與脂肪組織的聯(lián)系以及應(yīng)激性脂代謝相關(guān)疾病的分子機(jī)制.