藏藥八味沉香散血清對H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用※

馬春秀，李彩霞，宮佰會，岳棟芳，李永芳，寇毅英

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

藏藥八味沉香散是治療心血管疾病常用的藏藥古方之一，在臨床預(yù)防缺血性心臟病(冠心病、心絞痛)中效果明顯，但其作用機(jī)制不明。本研究結(jié)合中藥血清藥理學(xué)方法制備八味沉香散血清，通過研究八味沉香散血清對大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型中LDH、CK活性的影響，探討八味沉香散血清對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細(xì)胞

清潔級雄性SD大鼠[西安華仁生物科技有限公司，許可證號：SCXK(陜)2018-0001，10～12周齡，體重200～250g]；大鼠H9c2心肌細(xì)胞[普諾賽生物科技有限公司]。

1.1.2 藥品與試劑

藏藥八味沉香散(西藏神猴藥業(yè)公司，批號：20200601)，復(fù)方丹參片(廣州白云山和記黃埔公司，批號：J19A024)。DMEM高糖培養(yǎng)基(普諾賽公司，批號：WH0521P121)，DMEM無糖培養(yǎng)基(普諾賽公司，批號：WH01122012XP01)。胎牛血清(普諾賽公司，批號：21020701)，胰蛋白酶(普諾賽公司，批號：WH01122101SP01)，磷酸鹽緩沖鹽溶液(普諾賽公司，批號：20201219)，青霉素鏈霉素(索萊寶公司，批號：20201127)，二甲基亞砜(索萊寶公司，批號：710N0310)，四甲基偶氮唑藍(lán)(武漢伊萊瑞特公司，批號：MLQ45K8QFE)。CCK-8試劑盒(武漢伊萊瑞特公司，批號：8R1NBWTULX)，LDH乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成公司，批號：20210618)，CK肌酸激酶試劑盒(上海泛柯公司，批號：202104)。

1.1.3 儀器

超凈工作臺(蘇州安泰公司)，恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力康公司)，三氣培養(yǎng)箱(上海力康公司)，熒光倒置顯微鏡(德國徠卡公司)，全波長酶標(biāo)儀(美國賽默飛公司)，離心機(jī)(德國艾本德公司)。

1.2 方法

1.2.1 空白血清和含藥血清的制備方法

將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組，八味沉香散低、中、高劑量組及復(fù)方丹參片(陽性藥物)組，每組12只。八味沉香散組大鼠每天灌胃[劑量：低(0.5g/kg)、中(1g/kg)、高(2.5g/kg)劑量的八味沉香散]，復(fù)方丹參片組每天灌胃(0.6g/kg)，空白組每天灌胃(等容量的蒸餾水)，連續(xù)10 d。八味沉香散組在末次給藥1.5 h(復(fù)方丹參片組在末次給藥4h)后麻醉(異氟烷吸入)，經(jīng)腹主動脈采血，置無菌試管中離心(4000r/min，15min)，取上清液以水浴法(56℃，30min)滅活，最后用濾膜(0.22μm)除菌，置-80 ℃冰箱?？瞻籽寮昂幯逶谑褂们坝肈MEM培養(yǎng)基稀釋。

1.2.2 血清最佳添加量篩選方法

用MTT法篩選血清最佳添加量。收集對數(shù)生長期的大鼠H9c2細(xì)胞，按5×103/孔的密度接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)基，每孔(總體積200μL)加入新鮮培養(yǎng)基，按空白血清添加量分組(0%、10%、20%、30%、40%、50%組)，每組設(shè)置6個復(fù)孔，用二氧化碳培養(yǎng)箱做常規(guī)培養(yǎng)48 h后，加入20 μL的MTT溶液，置二氧化碳培養(yǎng)箱孵育4 h，棄上清液，每孔加100 μL的DMSO孵育(避光，37℃，10min)后檢測OD值(490nm)，確定最佳血清添加量。

1.2.3 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立方法

將H9c2心肌細(xì)胞加入DMEM高糖培養(yǎng)基(10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液)后置于二氧化碳培養(yǎng)箱(5% CO2，37℃)中培養(yǎng)，次日換液，待細(xì)胞匯合率達(dá)90%時加適量0.25%胰蛋白酶消化后，按1：3的比例進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞實驗。改進(jìn)缺氧/復(fù)氧模型制備方法[1，2]：用DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)H9c2細(xì)胞于二氧化碳培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度至80%時，棄原培養(yǎng)液，加入不含血清的無糖培養(yǎng)基置三氣培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2，2%O2，93%N2)中8 h后棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗細(xì)胞2次，加入DMEM高糖培養(yǎng)基并置二氧化碳培養(yǎng)箱中復(fù)氧4 h。

1.2.4 實驗分組與處理方法

將H9c2細(xì)胞分為空白組，模型組，八味沉香散血清低、中、高劑量組及陽性對照組，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%時進(jìn)行換液。在空白組(高糖培養(yǎng)基+20%空白血清)，模型組(無糖培養(yǎng)基+20%空白血清)，八味沉香散血清低劑量組(無糖培養(yǎng)基+20%低劑量含藥血清)、中劑量組(無糖培養(yǎng)基+20%中劑量含藥血清)、高劑量組(無糖培養(yǎng)基+20%高劑量含藥血清)，陽性對照組(無糖培養(yǎng)基+20%陽性藥含藥血清)中，除空白組外，其他各組處理依照“1.2.3”所示方法：置三氣培養(yǎng)箱(缺氧)8 h，空白組同時置二氧化碳培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)8 h后棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗細(xì)胞2次，進(jìn)行換液[空白組(高糖培養(yǎng)基+20%空白血清)。將模型組(高糖培養(yǎng)基+20%空白血清)和八味沉香散血清低劑量組(高糖培養(yǎng)基+20%低劑量含藥血清)、中劑量組(高糖培養(yǎng)基+20%中劑量含藥血清)、高劑量組(高糖培養(yǎng)基+20%高劑量含藥血清)及陽性對照組(高糖培養(yǎng)基+20%陽性藥含藥血清)]細(xì)胞置二氧化碳培養(yǎng)箱中復(fù)氧4 h。

1.2.5 心肌細(xì)胞生長及形態(tài)變化觀察方法

取對數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后計數(shù)，接種于培養(yǎng)皿(6cm2)中并分組，待細(xì)胞密度至70%～80%時，按“1.2.4”所示方法進(jìn)行操作，待缺氧/復(fù)氧結(jié)束后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6 細(xì)胞存活率檢測方法

用CCK-8法檢測各組細(xì)胞存活率。取對數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/孔，接種至96孔板中，每孔200 μL，置培養(yǎng)箱行常規(guī)培養(yǎng)24 h。分組并按體積比加入相對應(yīng)的含藥血清進(jìn)行缺氧/復(fù)氧干預(yù)，待干預(yù)結(jié)束后，向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液(避免產(chǎn)生氣泡)，將96孔板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5 h后，用酶標(biāo)儀檢測OD值(450nm)。

1.2.7 細(xì)胞上清液中LDH、CK的活性檢測方法

按“1.2.6”所示方法進(jìn)行鋪板、培養(yǎng)、干預(yù)，干預(yù)結(jié)束后分別收集缺氧8 h和復(fù)氧4 h后的各組細(xì)胞上清液，按照試劑盒說明進(jìn)行操作，分別測定缺氧8 h和復(fù)氧4 h時各組的LDH、CK值。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清最佳添加量

與0%組相比較，空白血清添加量組(10%～50%)細(xì)胞活性均明顯大于0%組(P<0.05)；隨血清添加量增加(10%～30%)，血清對細(xì)胞活性的促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，且30%組細(xì)胞活性最大(P<0.05)；30%～50%時，促進(jìn)作用逐漸減弱且活性均比20%組低；0%～50%時總體呈先上升后下降的趨勢，考慮大于30%的血清可能產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用而導(dǎo)致細(xì)胞活性下降。具體數(shù)據(jù)詳見表1。因此，最佳血清添加量為20%。

表1 大鼠空白血清不同添加比例對H9c2心肌細(xì)胞活性的影響值

2.2 八味沉香散血清對各組心肌細(xì)胞生長及形態(tài)的影響情況

缺氧/復(fù)氧結(jié)束后，細(xì)胞形態(tài)如圖1所示，A：空白組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，呈正常長梭形，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞均勻貼壁生長；B：模型組細(xì)胞形態(tài)不完整，細(xì)胞形態(tài)由正常長梭形變?yōu)椴灰?guī)則圓形(有明顯皺縮)，表面死細(xì)胞數(shù)增多；與模型組細(xì)胞相比，八味沉香散血清各組細(xì)胞形態(tài)趨于正常，且中劑量組、陽性組細(xì)胞形態(tài)較為完整。

A：空白組；B：模型組；C：低劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組；F：陽性對照組

2.3 細(xì)胞存活率

CCK-8實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，八味沉香散血清低、中、高各組細(xì)胞存活率均有明顯升高(P<0.05)，且八味沉香散血清各組中，中劑量組細(xì)胞存活率最高。具體數(shù)據(jù)詳見表2。

表2 八味沉香散血清對缺氧/復(fù)氧處理心肌細(xì)胞存活率的影響值

2.4 八味沉香散血清對各組細(xì)胞上清液中LDH、CK的影響情況

缺氧8 h時，與空白組相比，模型組上清液中的LDH、CK活性明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，八味沉香散血清中劑量組LDH顯著降低(P<0.05)，八味沉香散血清低、中、高劑量組CK均明顯降低(P<0.05)。復(fù)氧4 h時，與空白組相比，模型組上清液中的LDH、CK活性明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，八味沉香散血清中、高劑量組LDH、CK顯著降低(P<0.05)。具體數(shù)據(jù)詳見表3。

表3 八味沉香散血清對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后LDH、CK的影響值

3 討論

截至目前，治療心肌缺血的一種重要策略是缺血再灌注，但再灌注治療會致心肌損傷，稱為“再灌注損傷”[3，4]。

血清藥理學(xué)是一種在復(fù)方藥效學(xué)研究領(lǐng)域新興的藥理實驗方法，是指將中藥及復(fù)方制劑經(jīng)灌胃給藥，經(jīng)過動物體內(nèi)吸收和機(jī)體的生物轉(zhuǎn)化后收集其血清的方法[5]。其獨(dú)特優(yōu)勢體現(xiàn)在經(jīng)動物給藥后因經(jīng)過了機(jī)體進(jìn)一步代謝，更好地模擬了中藥(復(fù)方)最終入血的有效成分[6，7]。而含藥血清的添加量是血清藥理學(xué)體外實驗中不可忽視的問題之一。有學(xué)者報道，含藥血清在高濃度可抑制細(xì)胞的增殖[8]，10%含藥血清濃度最宜在體外實驗時選?。涣碛袑W(xué)者研究發(fā)現(xiàn)含藥血清的添加量不宜超過20%[9]；也有研究發(fā)現(xiàn)種屬關(guān)系相近或者同種屬的較高濃度血清具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，種屬較遠(yuǎn)的血清在低濃度時(10%～40%)才能促進(jìn)細(xì)胞增殖[10]。還有學(xué)者認(rèn)為，為避免高濃度血清的毒性作用及考慮實驗中被培養(yǎng)細(xì)胞對血清的耐受性，實際操作時，可根據(jù)預(yù)實驗選取最佳的血清添加量[11]。本實驗結(jié)果表明，選取體積分?jǐn)?shù)為20%的血清較適宜，與上述研究結(jié)果相符。

對藏藥八味沉香散的前期研究發(fā)現(xiàn)，其對異丙腎上腺素所致的大鼠心肌缺血損傷具有保護(hù)作用[12，13]，對在體的大鼠心肌缺血/再灌注損傷也有很好的保護(hù)作用[14]。對八味沉香散單味藥有效成分的研究結(jié)果顯示，八味沉香散所含主要化學(xué)成分有黃酮類、酚酸類、脂肪酸類和萜類等，其中的大多數(shù)成分具有抗氧化和抗炎作用[15，16]，與其具有治療缺血性心臟病的功效相符。

本研究以血清藥理學(xué)方法并采用離體心肌細(xì)胞模型(模擬心肌缺血損傷、復(fù)氧再灌注損傷)，對LDH、CK進(jìn)行研究。研究結(jié)果顯示，八味沉香散血清不僅對心肌缺血損傷具有保護(hù)作用，而且對再灌注損傷也具有一定的保護(hù)作用。同時，實驗結(jié)果顯示缺氧/復(fù)氧(12h)結(jié)束后，八味沉香散血清各組細(xì)胞形態(tài)趨于正常，細(xì)胞存活率均有升高，且八味沉香散中劑量含藥血清細(xì)胞存活率最高，進(jìn)一步證實了八味沉香散血清具有抗缺氧/復(fù)氧損傷的作用。

綜上所述，藏藥八味沉香散血清對H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷具有一定的保護(hù)作用。