周 培，辛明遠(yuǎn)，馬敬為，胡繽文，王 蕾，魏 威，馮 琳，周 振，劉文婧，李潤樂，湯 鋒

(1.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)研究生院，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧 810016)

目前尚未發(fā)現(xiàn)單一的抗原可以有效預(yù)防泡型包蟲病(Alveolar Echinococcosis，AE)，找到一種可以誘導(dǎo)機(jī)體對各階段多房棘球絳蟲產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原肽是研制AE疫苗亟需解決的問題。故本研究在課題組前期研究(多房棘球絳蟲EmEMY162、EmLAP的優(yōu)勢抗原表位鑒定)的基礎(chǔ)上，設(shè)計、構(gòu)建多房棘球絳蟲多表位疫苗GILE，并表達(dá)、純化該重組蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

pCzn1質(zhì)粒(鐘鼎生物公司)，Artic express表達(dá)菌株(鐘鼎生物公司)，限制性內(nèi)切酶(TaKaRa公司)，蛋白質(zhì)Marker(Thermo公司)，IPTG(Biotopped公司)，氨芐青霉素鈉(Solarbio公司)，透析袋(Ruitaibio公司)，Ni-NTA親和層析柱(GenScript公司)，4×蛋白上樣緩沖液(Solarbio公司)，鼠抗His抗體(Boster公司)，羊抗鼠IgG抗體(abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 GILE結(jié)構(gòu)預(yù)測

據(jù)課題組前期研究成果及相關(guān)文獻(xiàn)[1-4]，選取多房棘球絳蟲優(yōu)勢抗原表位。將各優(yōu)勢抗原表位相串聯(lián)，構(gòu)建多表位疫苗GILE。通過SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)、pyMOL(https：//pymol.org/2/)軟件對不同的多表位疫苗(優(yōu)勢抗原表位連接順序不同)進(jìn)行同源建模，選取其中最適合誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的優(yōu)勢抗原表位連接順序，以選取的連接順序?yàn)槟０鍢?gòu)建多房棘球蚴多表位疫苗GILE。通過SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)軟件對設(shè)計的多表位疫苗GILE進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，初步評估多表位疫苗的免疫原性。通過VMD軟件分析多表位疫苗GILE的親水性，為后續(xù)GILE的表達(dá)、純化提供依據(jù)。

1.2.2 GILE基因序列合成和重組質(zhì)粒pCzn1-GILE構(gòu)建

選擇在結(jié)構(gòu)預(yù)測中未產(chǎn)生其他抗原表位且各表位間無相互影響的模型為模板構(gòu)建GILE。確定模板后，采用PCR-based Accurate Synthesis的方法設(shè)計全長拼接引物，在引物的兩端設(shè)計保護(hù)性堿基，合成基因GILE。將合成的GILE基因連入載體pCzn1的NdeI和XbaI位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCzn1-GILE。通過酶切和基因測序法對重組質(zhì)粒pCzn1-GILE進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 重組表達(dá)菌的構(gòu)建及重組蛋白表達(dá)部位鑒定

將重組質(zhì)粒pCzn1-GILE轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株Artic express中，構(gòu)建重組表達(dá)菌。將重組表達(dá)菌的菌液涂布于含有Ampicillin(50μg/mL)的LB平板上，在培養(yǎng)箱(37℃)中過夜培養(yǎng)，篩選陽性菌株。次日，選取陽性單克隆菌落接種于5 mL含Ampicillin的LB液體培養(yǎng)基中，恒溫振蕩(37℃，220r/min)，過夜培養(yǎng)后，按1：100接種于50 mL含Ampicillin的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)(37℃，220r/min)。當(dāng)菌液生長至對數(shù)期，取1 mL菌液離心，分離菌液上清、沉淀，分別加入4×蛋白上樣緩沖液混懸后作為陰性對照。其余菌液中加入IPTG(0.5mM)，低溫振蕩培養(yǎng)(11℃，220r/min)，過夜誘導(dǎo)GILE重組蛋白的表達(dá)。然后，通過12%SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色法確定GILE的表達(dá)部位。

1.2.4 GILE蛋白純化及鑒定

參照文獻(xiàn)方法[5]，將過夜誘導(dǎo)的菌液離心(10000r/min，4℃，3min)，收集菌體沉淀，沉淀重懸于Binding Buffer中，在冰上超聲破碎(破碎3s，間隔7s，功率為60%)30 min。將破碎后的菌液離心(10000r/min，4℃，3min)，收集菌體沉淀，并加入8 M的尿素進(jìn)行蛋白變性。繼續(xù)超聲破碎(破碎3s，間隔7s，功率為60%)20 min。離心后將上清加入透析袋中，置于含有還原型GSH和氧化型GSSH的蛋白復(fù)性緩沖溶液中，在4 ℃低溫條件下進(jìn)行復(fù)性。復(fù)性完成后，通過低壓層析系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白的Ni柱親和純化。用Binding Buffer沖洗(恒流泵流速設(shè)置為25)Ni-NTA柱至OD280值為0，將蛋白樣品加入Ni-NTA柱(恒流泵流速設(shè)置為20)。上樣15 mL后，用Washing Buffer(10mM Tris-HCl，50mM NaH2PO4，60mM咪唑，pH=8.0)洗脫雜蛋白。然后用Elution Buffer(10mM Tris-HCl，50mM NaH2PO4，250mM咪唑，pH=8.0)洗脫并收集GILE蛋白。將洗脫收集的溶液加入透析袋中，通過吸收法(PEG20000)進(jìn)行濃縮，直到溶液濃縮至淡黃色。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，通過12%SDS-PAGE分析蛋白純化情況。

用Western blotting法進(jìn)一步驗(yàn)證重組蛋白表達(dá)情況。將上述分離純化的重組蛋白電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉(4℃，過夜)。次日，使用TBST洗滌后，加入一抗(鼠抗His抗體)孵育(室溫)1 h，使用TBST洗滌，加入二抗(羊抗鼠IgG)孵育(室溫)1 h。使用TBST洗凈PVDF膜，在顯影儀下觀察蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 多表位疫苗GILE的結(jié)構(gòu)設(shè)計

多房棘球絳蟲EmGLUT1、EmLAP、EmEMY162優(yōu)勢抗原表位氨基酸序列及類型見表1。通過SWISS-MODEL軟件對不同連接順序構(gòu)建的多表位疫苗進(jìn)行同源結(jié)構(gòu)建模并對比，結(jié)果如圖1所示，各模型的表位連接順序?yàn)長AP464-479―LAP495-510―EMY16295-104―EMY162112-126―LAP396-410―LAP504-518―EMY162106-121；(圖1.A)EMY162106-121―LAP464-479―LAP495-510―EMY16295-104―EMY162112-126―LAP396-410―LAP504-518；(圖1.B)LAP495-510―EMY162106-121―LAP464-479―EMY16295-104―EMY162112-126―LAP396-410―LAP504-518；(圖1.C)LAP464-479―LAP495-510―EMY162106-121―EMY16295-104―EMY162112-126―LAP396-410―LAP504-518；(圖1.D)LAP504-518―LAP464-479―LAP495-510―EMY162106-121―EMY16295-104―EMY162112-126―LAP396-410；(圖1.E)EMY16295-104―LAP464-479―LAP495-510―LAP396-410―LAP396-410―LAP504-518―EMY162112-126(圖1.F)。結(jié)果表明，僅圖1.F舒展性良好，且各抗原表位間無相互掩蓋和干擾，其余模型表位間有干擾。因此，選擇圖1.F的表位連接順序構(gòu)建多表位疫苗GILE。通過SOPMA軟件對設(shè)計的多表位疫苗GILE進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明，二級結(jié)構(gòu)中β折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占比較大，表明該重組蛋白質(zhì)可能具有較好的免疫原性。如圖2所示，α螺旋占13.84%，β折疊占26.25%，β轉(zhuǎn)角占14.88%，無規(guī)卷曲占45.82%。通過VMD軟件分析多表位疫苗GILE的親水性，如圖3所示，圖中藍(lán)色表示親水性殘基，紅色表示疏水性殘基，結(jié)果表明，GILE是親水蛋白。

表1 合成多表位疫苗的各種抗原表位氨基酸序列及類型

圖1 GILE蛋白結(jié)構(gòu)同源建模

圖2 GILE二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

圖3 GILE親—疏水性圖

2.2 重組質(zhì)粒pCzn1-GILE的酶切及測序鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pCzn1-GILE經(jīng)過酶切后進(jìn)行電泳，酶切位點(diǎn)為CATATG、TCTAGA。結(jié)果如圖4.A所示，相比于酶切前質(zhì)粒，酶切后電泳結(jié)果在1266 bp左右處出現(xiàn)了清晰明亮的條帶，與設(shè)計的GILE(1266bp)大小一致，表明GILE目的序列成功插入質(zhì)粒中，目的質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒pCzn1-GILE轉(zhuǎn)入Top10克隆菌株，選取陽性克隆子進(jìn)行測序。圖4.B為部分測序及比對結(jié)果，結(jié)果和預(yù)期序列比對一致，表明目的質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A：pCzn1-GILE酶切鑒定圖(M：Mark；Line1：酶切前質(zhì)粒；Line2：酶切后質(zhì)粒)；B：pCzn1-GILE序列比對結(jié)果

2.3 重組蛋白GILE表達(dá)部位的鑒定與純化結(jié)果

取重組基因工程菌株誘導(dǎo)前、后的菌液上清和沉淀，采用12%SDS-PAGE法進(jìn)行分析。如圖5.A所示，在超聲破碎上清、沉淀中，約45 KD處出現(xiàn)明顯條帶。結(jié)果表明，重組蛋白GILE既以可溶性蛋白的形式表達(dá)于菌液中，又以包涵體的形式表達(dá)于菌體沉淀中。取菌體沉淀超聲破碎后加入8 M的尿素進(jìn)行蛋白變性，繼續(xù)超聲破碎后，取上清于低溫下(4℃)進(jìn)行蛋白復(fù)性。完成復(fù)性后，經(jīng)Ni-NTA親和層析法純化，收集洗脫液，采用12%SDS-PAGE法鑒定純化蛋白。結(jié)果如圖5.B所示，純化后蛋白在45 KD處有明顯單一條帶，表明目的蛋白成功表達(dá)，達(dá)到電泳純。純化GILE重組蛋白是通過Ni-NTA親和層析法，如圖5.C所示，以60 mM咪唑洗去雜蛋白后得到的重組蛋白的純度最高，最終得到純化的重組蛋白濃度為1007.4 μg/mL。

A：原核表達(dá)12%SDS-PAGE分析圖；B：GILE蛋白純化SDS-PAGE分析圖

2.4 重組蛋白GILE的免疫印跡檢測結(jié)果

通過鼠抗His抗體對GILE蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測，結(jié)果如圖6所示，純化后的GILE蛋白能與His抗體特異結(jié)合，未見其他條帶，表明經(jīng)Ni-NTA親和柱層析獲得了重組蛋白。

圖6 GILE蛋白Western blotting結(jié)果

3 討論

AE蟲卵進(jìn)入中間宿主體內(nèi)后，在腸道中孵化并釋放出六鉤蚴。孵化的六鉤蚴穿過肝門靜脈和淋巴管到達(dá)肝臟，最終在肝臟定居，發(fā)育為泡球蚴。多房棘球絳蟲在中間宿主體內(nèi)分別經(jīng)歷了蟲卵、六鉤蚴、泡球蚴三個發(fā)育階段。在不同的發(fā)育階段，蟲體表達(dá)的蛋白種類和含量均有差異，這是單一多房棘球絳蟲蛋白不能產(chǎn)生良好抗AE效果的原因之一。因此，本課題在前期鑒定多房棘球絳蟲EmEMY162、EmLAP、EmGLUT1優(yōu)勢抗原表位的基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)方法設(shè)計抗AE的多表位疫苗GILE。EmEMY162是一種在多房棘球絳蟲入侵中間宿主的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白，該蛋白表達(dá)于多房棘球絳蟲整個發(fā)育周期[6，7]。因此，以EMY162作為抗原肽可能能誘導(dǎo)機(jī)體對各個階段的多房棘球絳蟲產(chǎn)生免疫反應(yīng)，發(fā)揮良好的保護(hù)作用。有研究表明，重組EmEMY162對多房棘球絳蟲感染的小鼠有顯著的保護(hù)作用(74.3%)[6]。亮氨酸氨基肽酶(LAP)是一種在多房棘球絳蟲營養(yǎng)吸收中發(fā)揮作用的蛋白。因此，以EmLAP為抗原肽可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，抑制多房棘球絳蟲的營養(yǎng)吸收，從而達(dá)到防治AE的目的。有研究表明，在多房棘球絳蟲感染的小鼠模型中接種LAP，可顯著降低囊泡的數(shù)量和大小[2]，表明該蛋白可有效防治AE。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)是一種在多房棘球絳蟲攝取葡萄糖的過程中發(fā)揮重要作用的蛋白。多房棘球絳蟲包含不同的GLUT基因型(GLUT1、GLUT2)，但只有GLUT1有較高的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性[8]。因此，以GLUT1為靶點(diǎn)構(gòu)建疫苗，可能會抑制多房棘球絳蟲對葡萄糖的吸收，影響蟲體能量供應(yīng)，進(jìn)而起到保護(hù)宿主的作用。EmEMY162、EmLAP、EmGLUT1在多房棘球絳蟲生存、發(fā)育中均發(fā)揮重要作用。因此，本研究以上述蛋白的優(yōu)勢抗原表位為基礎(chǔ)，構(gòu)建防治AE的多表位疫苗GILE。

表位疫苗因其具有特異性高、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，成為疫苗研發(fā)的新方向[9]?？乖砦皇强乖禺愋约せ钏拗髅庖邞?yīng)答的最小單位，與完整蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的反應(yīng)相比，抗原表位可以誘導(dǎo)更直接、更有效的免疫反應(yīng)。近年來，其在寄生蟲感染性的疾病預(yù)防中也顯示出優(yōu)勢。在銅綠假單胞菌毛疫苗的研制中，分別使用菌毛蛋白受體結(jié)合域合成肽和完整的菌毛蛋白免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)使用合成肽免疫的動物對天然菌毛的抗體滴度顯著高于用菌毛蛋白免疫的動物的抗體滴度[10]。我們在前期對EmEMY162、EmLAP的優(yōu)勢抗原表位進(jìn)行了鑒定。EMY162的Th1型優(yōu)勢抗原表位有EMY16227-13、EMY16236-41、EMY16280-89、EMY162129-139，Th2型優(yōu)勢抗原表位有EMY16236-41、EMY16287-96、EMY16297-106[11]。LAP的Th1型優(yōu)勢抗原表位有LAP79-63、LAP396-410、LAP106-120、LAP396-410、LAP504-518，Th2型優(yōu)勢抗原表位有LAP13-28、LAP495-510、LAP396-410、LAP504-518、LAP313-328，B優(yōu)勢抗原表位有LAP464-479、LAP495-510和LAP313-328[4]。本研究在此基礎(chǔ)上，選取其中能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)免疫應(yīng)答和特異性較強(qiáng)的優(yōu)勢抗原表位設(shè)計、構(gòu)建多表位疫苗GILE。

在多表位疫苗的設(shè)計、構(gòu)建中，連接處的序列在提高疫苗結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等方面發(fā)揮重要作用[12]。本研究在各表位連接處引入GS和KK氨基酸序列使各表位間有一定間隔，保持多肽鏈的空間構(gòu)象穩(wěn)定性和抗原表位的特異性，防止表位之間互相干擾，避免在連接處形成新表位，間接提高了蛋白酶的切割效率和抗原呈遞效率[13，14]。單個表位分子量小，免疫原性弱，不穩(wěn)定[15]。因此，在GILE的設(shè)計中將各抗原表位重復(fù)串聯(lián)2～3次，以增強(qiáng)重組蛋白的免疫原性與穩(wěn)定性。各抗原表位串聯(lián)時需遵循一定的順序，將T細(xì)胞抗原表位放在B細(xì)胞抗原表位的前端能最大程度保持抗原表位的免疫原性[13]。因此，本研究將免疫原性較強(qiáng)的EmEMY162的B細(xì)胞抗原表位放在末端。完成GILE的設(shè)計、構(gòu)建后，使用生物信息學(xué)軟件對GILE的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

近年來，分子免疫學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展。在疫苗研制中，通過生物信息學(xué)軟件，可方便、快捷地對重組蛋白進(jìn)行分析。比如，模擬蛋白的結(jié)構(gòu)，分析蛋白的親—疏水性，預(yù)測蛋白的過敏原性及免疫原性并對蛋白的優(yōu)勢抗原表位進(jìn)行預(yù)測[16]。生物信息學(xué)軟件的應(yīng)用極大降低了疫苗研制的時間和經(jīng)濟(jì)成本，是目前疫苗研制的重要輔助方法。在本研究中，完成GILE的設(shè)計、構(gòu)建后，結(jié)合生物信息學(xué)軟件對GILE進(jìn)行分析。SWISS-MODEL顯示，GILE的三級結(jié)構(gòu)具有良好的舒展性，各優(yōu)勢抗原表位間無掩蓋和干擾。這可能有助于GILE各優(yōu)勢抗原表位與抗原呈遞細(xì)胞和效應(yīng)T、B細(xì)胞結(jié)合，更好地引起免疫應(yīng)答。SOPMA顯示，在GILE的二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋占13.84%，β折疊占26.25%，β轉(zhuǎn)角占14.88%，無規(guī)則卷曲占45.82%。在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋和β折疊的穩(wěn)定性通過氫鍵維持，并且主要位于蛋白質(zhì)的內(nèi)部。白細(xì)胞和抗體主要識別蛋白外部區(qū)域的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。GILE二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明GILE易被白細(xì)胞和抗體識別，可能有良好的抗原性，能引起明顯的免疫應(yīng)答。VMD顯示，GILE是親水蛋白。

本研究在前期多房棘球絳蟲優(yōu)勢抗原表位鑒定的基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)軟件設(shè)計、構(gòu)建多房棘球絳蟲多表位疫苗GILE，完成了GILE的設(shè)計并構(gòu)建了GILE原核表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)GILE重組蛋白，為后續(xù)研究打下了基礎(chǔ)。本研究為進(jìn)一步開發(fā)新型AE疫苗提供了理論依據(jù)。