丙二醇、氮酮、薄荷醇對(duì)黃香愈膚乳膏中鹽酸小檗堿體外透皮吸收的影響※

王 倩，喇林立，劉貴琴，白 雪，楊建鑫，段雅彬，朱俊博，周 楊，顧文琦，李向陽(yáng)，3*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001；3.三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

如何提高黃香愈膚乳膏的透皮吸收率是實(shí)現(xiàn)藥物設(shè)計(jì)目的的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是目前膏劑類產(chǎn)品品質(zhì)控制的難點(diǎn)。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，在乳膏劑中加入丙二醇、氮酮及薄荷醇等促滲劑，考察累積滲透量和穩(wěn)態(tài)透皮速率及取樣末點(diǎn)鹽酸小檗堿的皮膚滯留量，以此綜合判斷丙二醇、氮酮、薄荷醇對(duì)黃香愈膚乳膏中鹽酸小檗堿體外透皮吸收的影響。本研究通過(guò)對(duì)黃香愈膚乳膏體外滲透特性的研究，為最佳透皮劑篩選提供了依據(jù)，同時(shí)也為該制劑的安全性評(píng)價(jià)提供了參照，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

薄荷醇(批號(hào)：D813157，99%)、1，2-丙二醇(批號(hào)：P815581，分析純)、氮酮(批號(hào)：A800359，97%)、鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：C10835997)均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，乙醇(批號(hào)：20201128，分析純)購(gòu)自天津市博華通化工產(chǎn)品銷售中心，生理鹽水(批號(hào)：H37020764，0.9%)購(gòu)自山東齊都藥業(yè)有限公司。

1.1.2 儀器

BT25S電子天平購(gòu)自德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器公司，TGL-16B離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠，XHF-DY高速分散器購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司，HK-300CDE型超聲波清洗器購(gòu)自杭州市匯爾儀器設(shè)備有限公司，LC-2030 Plus高效液相色譜儀購(gòu)自島津馬來(lái)西亞工廠，YB-P6智能透皮實(shí)驗(yàn)儀購(gòu)自天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器制造廠。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200±20 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：SCXK(陜)2018-001。

1.2 方法

1.2.1 鹽酸小檗堿含量測(cè)定

1.2.1.1 色譜條件選擇

XDB-C18色譜柱(3.0×250.0mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(0.1%磷酸，35：65)，體積流量0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為40 μL。

1.2.1.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品5.02 mg置于5 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，即得濃度為1000 μg/mL鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，按比例稀釋成濃度為10.000、5.000、1.000、0.500、0.100、0.010、0.002 μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品工作液。

1.2.1.3 供試品溶液制備

取透皮實(shí)驗(yàn)中獲得的接收液離心(12000r/min，5min)取上清液，用微孔濾膜(0.22μm)濾過(guò)，即得供試品溶液。

1.2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取“1.2.1.2”項(xiàng)下制備的鹽酸小檗堿對(duì)照品工作液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y=341005x-2997.2，R2=1，結(jié)果顯示在0.002～10.000 μg/mL范圍內(nèi)，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好。

1.2.1.5 專屬性考察

精密量取空白皮膚接收液、供試品溶液、對(duì)照品溶液做進(jìn)樣分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示皮膚接收液中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)供試品溶液中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定無(wú)干擾作用，表明此方法專屬性良好。接收液的HPLC圖見(jiàn)圖1。

1.2.1.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取10.00、1.00、0.01 μg/mL鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，于1 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，3 d內(nèi)每天重復(fù)進(jìn)樣2次(每12h 1次)，測(cè)定各成分的峰面積，結(jié)果顯示高、中、低濃度的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液日內(nèi)精密度RSD分別為1.15%、0.08%、0.01%，日間精密度RSD分別為1.62%、0.94%、1.85%，表明儀器的精密度良好。

1.2.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按“1.2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，取同一時(shí)間點(diǎn)的6份樣品測(cè)定峰面積，考察方法的重復(fù)性，結(jié)果顯示試品溶液峰面積的RSD為2.75%，表明方法的重復(fù)性良好。

1.2.1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取“1.2.1.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液適量，于制備后0、2、4、6、8、12、24 h做進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示供試品溶液濃度的RSD為2.16%，表明供試品溶液在0～24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.1.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

在已知量的低、中、高3個(gè)濃度的樣品透過(guò)液中加入等體積濃度為1、5、10 μg/mL的鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度制備3份樣品做進(jìn)樣分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1、5、10 μg/mL的鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為100.81%、96.10%和95.29%，RSD分別為0.83%、0.51%和0.15%，符合規(guī)定。加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.2.1.10 供試品溶液測(cè)定

取“1.2.1.3”項(xiàng)下的供試品溶液，按上述色譜條件做進(jìn)樣分析，測(cè)定各樣品峰面積并計(jì)算濃度。

1.2.2 體外透皮實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 離體鼠皮的制備

用異弗烷麻醉大鼠后，以生理鹽水濕潤(rùn)大鼠背部毛發(fā)，用手術(shù)刀片將其剔除干凈，12 h后脫頸處死，剝離背部皮膚，剔除皮下脂肪組織和血管，用生理鹽水沖洗干凈后平鋪于鋁箔上置-20 ℃冰箱凍存。實(shí)驗(yàn)前將皮膚自然解凍，檢視皮膚是否完整。

1.2.2.2 促滲劑的初步選擇

選擇濃度為1%、2%、3%、5%的丙二醇、氮酮及薄荷醇作為單一促滲劑，選擇各濃度促滲劑兩兩聯(lián)用作為復(fù)合促滲劑，分別加入乳膏中，選擇對(duì)乳膏性狀及穩(wěn)定性無(wú)影響的促滲劑做進(jìn)一步研究。

1.2.2.3 體外透皮實(shí)驗(yàn)

將制備好的離體皮膚自然固定在Franz擴(kuò)散池(有效透皮面積為2.01cm2，接收液體積為17mL)上，角質(zhì)層面朝供給室。精密稱取乳膏劑1.0 g均勻涂布于大鼠角質(zhì)層上，用一層塑料薄膜覆蓋。以20%乙醇-生理鹽水溶液為接收液，將接收液超聲30 min后加入接收池(水浴溫度為37℃±2℃，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min)平衡1 h，排除氣泡。于給藥前及給藥0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h時(shí)從接收室取樣1.0 mL，每次取樣后立即補(bǔ)足等體積的新鮮接收液，用HPLC儀檢測(cè)接收液中鹽酸小檗堿濃度，按如下公式計(jì)算體外經(jīng)皮滲透參數(shù)：

其中，Qn表示各成分在單位面積上的累積透過(guò)量(μg·cm-2)；Cn表示第n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的接收液中藥物的濃度(μg·mL-1)；Ci表示第i(i=n-1)個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的接收液中的藥物濃度(μg·mL-1)。

以Qn對(duì)取樣時(shí)間t作圖，繪制含有不同促滲劑的黃香愈膚乳膏中鹽酸小檗堿的累計(jì)滲透曲線。以Qn對(duì)t作線性回歸，所得方程即滲透動(dòng)力學(xué)方程，直線的斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率Js(μg·cm-2·h-1)。使用OriginPro 8.0軟件對(duì)鹽酸小檗堿累計(jì)透皮量進(jìn)行零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型與Higuchi模型擬合。

于結(jié)束時(shí)取下鼠皮，分離皮膚層和乳膏層，剪去多余的皮膚，剩下與乳膏接觸的皮膚備用。將取下的皮膚剪碎、研磨至乳糜狀，加入2 mL甲醇，超聲振蕩，用微孔濾膜(0.22μm)濾過(guò)，注入HPLC儀測(cè)定峰面積，計(jì)算皮膚滯留量。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 促滲劑的初步篩選

促滲劑初步篩選結(jié)果表明以2%丙二醇、2%薄荷醇、2%氮酮、2%丙二醇+2%薄荷醇、2%丙二醇+2%氮酮作為促滲劑時(shí)，乳膏的外觀性狀及離心穩(wěn)定性均無(wú)明顯變化，因此選擇上述促滲劑進(jìn)行進(jìn)一步體外透皮實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 體外透皮實(shí)驗(yàn)

體外透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同促滲劑對(duì)黃香愈膚乳膏中鹽酸小檗堿的體外透皮吸收性能產(chǎn)生不同影響，且差異較大，與不含促滲劑組相比，2%丙二醇組第12 h的鹽酸小檗堿累計(jì)滲透量顯著升高了92.92%(P<0.05)，2%薄荷醇組、2%丙二醇+2%薄荷醇組有一定的升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2%氮酮組顯著降低了78.86%(P<0.05)，2%氮酮+2%丙二醇組有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同促滲劑的黃香愈膚乳膏中鹽酸小檗堿的累計(jì)滲透曲線見(jiàn)圖2，第12 h鹽酸小檗堿的累計(jì)滲透量見(jiàn)表2。

圖2 含不同促滲劑黃香愈膚乳膏累計(jì)滲透曲線

表2 含不同促滲劑黃香愈膚乳膏經(jīng)皮滲透參數(shù)

與不含促滲劑組相比，2%丙二醇組的鹽酸小檗堿的穩(wěn)態(tài)透皮速率顯著升高了86.67%(P<0.05)；2%薄荷醇組和2%薄荷醇+2%丙二醇組有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2%氮酮和2%氮酮+2%丙二醇組有降低的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合考慮，2%丙二醇為最佳促滲劑。穩(wěn)態(tài)透皮速率結(jié)果見(jiàn)表2。

與不含促滲劑組相比，除2%丙二醇組的鹽酸小檗堿的皮膚滯留量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。鹽酸小檗堿皮膚滯留量見(jiàn)表2。

分別采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型與Higuchi模型對(duì)黃香愈膚乳膏中鹽酸小檗堿的體外透皮吸收曲線進(jìn)行回歸分析，結(jié)果顯示，相比于零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Higuchi模型，各組一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的R2均較高，說(shuō)明無(wú)論使用何種透皮劑，黃香愈膚乳膏中鹽酸小檗堿的濃度變化規(guī)律都更符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。擬合方程結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 含不同促滲劑黃香愈膚乳膏透皮吸收動(dòng)力學(xué)方程

3 討論

體外透皮實(shí)驗(yàn)是測(cè)定外用制劑經(jīng)皮擴(kuò)散特性最常用的方法。大鼠皮膚的組織結(jié)構(gòu)與人體皮膚基本一致[1，2]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠背部皮膚考察黃香愈膚乳膏的經(jīng)皮滲透特性。

體外透皮實(shí)驗(yàn)中接收液模擬了皮膚下的體液，體外實(shí)驗(yàn)要求接收液不能與藥物發(fā)生反應(yīng)，同時(shí)符合漏槽條件[3]，一般以生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(PBS)等作為接收液，為增大脂溶性藥物的溶解度，通常會(huì)加入一定比例的有機(jī)溶劑，本實(shí)驗(yàn)在前期研究中分別在生理鹽水及PBS中加入了10%、20%、30%的無(wú)水乙醇，測(cè)定中藥提取浸膏在上述接收液中飽和時(shí)鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生理鹽水中測(cè)得的鹽酸小檗堿含量高于PBS中測(cè)得的鹽酸小檗堿含量，且乙醇含量越多，鹽酸小檗堿含量越高。有研究指出，當(dāng)乙醇含量超過(guò)20%時(shí)，皮膚褶皺展開(kāi)，毛囊口擴(kuò)張，皮膚正常生理結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[4]。因此本實(shí)驗(yàn)最終以20%的乙醇-生理鹽水作為接收液。

在研究中藥復(fù)方外用制劑時(shí)，為提高其有效成分的透皮量，通常會(huì)在其中加入一定比例的透皮劑，目前常用的透皮劑種類包括亞砜類(如DMSO)、脂肪酸酯類(如IPM、PGML)、氨基化合物類(如氮酮)、有機(jī)醇類(如丙二醇)等，這類透皮劑通過(guò)改變角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)或者增加促滲劑與角質(zhì)層的作用來(lái)增強(qiáng)藥物在皮膚中的滲透能力[5，6]。其中，氮酮、丙二醇、薄荷醇為最常用的促滲劑，其不僅有較好的促透作用，且毒性小、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定[7-9]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇上述三種單一促滲劑及兩兩聯(lián)用的復(fù)合促滲劑開(kāi)展體外透皮性能研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以丙二醇作為促滲劑時(shí)，透皮效果較好，相較于不含促滲劑組，其累計(jì)滲透量及穩(wěn)態(tài)透皮速率均顯著升高，故最終選擇2%的丙二醇作為黃香愈膚乳膏的促滲劑。研究發(fā)現(xiàn)丙二醇組的皮膚滯留量與不含促滲劑組相比無(wú)明顯變化，而其他各組均顯著降低，其原因可能與各促滲劑的不同促滲機(jī)制相關(guān)，丙二醇通過(guò)作用于細(xì)胞內(nèi)途徑提高藥物的透過(guò)量，而薄荷醇和氮酮屬于油性介質(zhì)，主要是通過(guò)增加藥物在脂質(zhì)分子層中的溶解增加藥物的滲入量[10-12]，由此造成不同組皮膚滯留量及累計(jì)滲透量之間的差異。

本研究對(duì)促滲劑的考察發(fā)現(xiàn)氮酮作為促滲劑時(shí)，無(wú)論單獨(dú)使用還是與丙二醇聯(lián)合使用，促滲效果均不理想，有研究指出，氮酮對(duì)log Ko/w值約為-0.5的藥物具有較好的促透作用[13]，而鹽酸小檗堿log Ko/w=3.45，由此導(dǎo)致氮酮對(duì)鹽酸小檗堿的促透效果不佳。此外，許多研究都發(fā)現(xiàn)氮酮對(duì)藥物的促透作用并非與氮酮添加量成正比[14，15]，本研究中以不影響乳膏性狀的最大濃度氮酮作為透皮劑，故本研究中鹽酸小檗堿的透過(guò)量低也可能是因?yàn)樗x擇的氮酮濃度不合適，未達(dá)到最佳促滲效果。也有研究發(fā)現(xiàn)以氮酮作為軟膏劑的促滲劑時(shí)透皮效果差，指出是由于氮酮的加入導(dǎo)致軟膏劑粒徑增大，從而阻礙了藥物的透皮吸收[16]，但本實(shí)驗(yàn)中是否存在該問(wèn)題還需要進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿可降低人皮膚成纖維細(xì)胞中紫外線誘導(dǎo)的MMP-1表達(dá)，增加Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，還可以預(yù)防皮膚炎癥和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解[17，18]。由此認(rèn)為，鹽酸小檗堿是黃香愈膚乳膏中抗紫外線損傷的主要成分。此外，本研究在做線性關(guān)系考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿具有很強(qiáng)的紫外線吸收能力，以HPLC儀檢測(cè)時(shí)，其檢測(cè)限可至0.002 μg/mL，透皮實(shí)驗(yàn)0～4 h為透皮吸收的平緩期，此時(shí)接收液中鹽酸小檗堿的濃度較低，而基于鹽酸小檗堿化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)，采用HPLC法即可檢測(cè)接收液中的鹽酸小檗堿，故本實(shí)驗(yàn)采用鹽酸小檗堿值作為透皮吸收的檢測(cè)指標(biāo)是可行的。