王 怡，馬勇剛，冉 迪，劉宗平*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州，225009；2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009)

近年來(lái)，我國(guó)畜禽飼料受到不同程度的鎘污染，多地抽檢的飼料樣品出現(xiàn)鉛鎘含量超標(biāo)[1]。飼料中鎘的持續(xù)污染主要以食物鏈的方式進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)[2]，生物半衰期可達(dá)10～30年，主要蓄積在肝、腎和骨骼，但其對(duì)骨骼的毒性機(jī)制尚不明確。破骨細(xì)胞是一種多核的終末分化細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)降解骨基質(zhì)，在骨代謝中發(fā)揮著重要的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞功能抑制是鎘誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的主要原因[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在鎘誘導(dǎo)的鴨骨質(zhì)疏松中發(fā)揮了重要作用[5]，鎘暴露明顯增加了鴨成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的凋亡。除了細(xì)胞凋亡外，其他的細(xì)胞死亡方式是否參與鎘誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松？細(xì)胞焦亡是一種非典型的程序性細(xì)胞死亡方式[6]。不同于細(xì)胞凋亡，細(xì)胞焦亡會(huì)呈現(xiàn)一系列與炎癥反應(yīng)相關(guān)的形態(tài)變化和生理結(jié)果，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜的通透性改變，細(xì)胞內(nèi)容物大量釋放，細(xì)胞膜有大量孔道形成，最終細(xì)胞裂解死亡而引發(fā)炎癥反應(yīng)[7]。經(jīng)典的細(xì)胞焦亡是由活化后的炎性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1) 切割活化的GSDMD所介導(dǎo)[8]，除此之外，活化后的Caspase-1同時(shí)也可以剪切細(xì)胞因子IL-18和IL-1β的前體使其成熟[9]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡參與了很多疾病的發(fā)生與發(fā)展[10]。但鎘暴露是否可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞焦亡依然尚未闡明。本研究以鴨破骨細(xì)胞為模型，通過(guò)多種方法探究鎘暴露是否可以誘導(dǎo)鴨破骨細(xì)胞發(fā)生焦亡，為鎘誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)鴨胚，由高郵市種鴨繁殖基地提供。

1.2 主要試劑LDH檢測(cè)試劑盒 (碧云天生物技術(shù)有限公司)；IL-18和IL-1β檢測(cè)試劑盒 (上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司)；Annexin V-FITC 細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒 (南京諾唯贊生物科技有限公司)；Hoechst染色液 (翌圣生物科技有限公司)；Caspase-1試劑盒 (Immunochemistry,USA)。

1.3 鴨破骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)15日齡的SPF級(jí)鴨胚表面消毒，分離股骨，用不含血清的培養(yǎng)基沖出骨髓，過(guò)濾后離心。用含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，離心后接種于培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后換新鮮培養(yǎng)基，如果細(xì)胞密度適宜，5 d后可見(jiàn)大量成熟的破骨細(xì)胞。

1.4 鴨破骨細(xì)胞形態(tài)的觀察成熟的破骨細(xì)胞鎘暴露12 h后，在倒置顯微鏡下觀察破骨細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.5 ELISA試劑盒檢測(cè)LDH、IL-18和IL-1β的含量鴨破骨細(xì)胞經(jīng)鎘處理結(jié)束后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)LDH、IL-18和IL-1β的含量，根據(jù)D值計(jì)算出各自的相對(duì)含量。

1.6 Casepase-1活性和細(xì)胞焦亡的檢測(cè)待細(xì)胞處理完成后，用胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞于流式管中，分別用FITC、PI和SYTOX標(biāo)記細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其活性和焦亡率。

1.7 用PI和Hoechst染色觀察破骨細(xì)胞膜的完整性細(xì)胞處理結(jié)束后，棄去細(xì)胞板中培養(yǎng)基，加入含PI和Hoechst的PBS在培養(yǎng)箱孵育1 h，在熒光顯微鏡下觀察各自的熒光強(qiáng)度。

1.8 數(shù)據(jù)分析所有數(shù)值均使用GraphPad Prism軟件分析作圖,數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05表示組間差異顯著,P<0.01表示組間差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 鎘暴露對(duì)鴨破骨細(xì)胞形態(tài)的影響如圖1所示，鴨骨髓單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，可獲得多核的破骨細(xì)胞，用鎘處理12 h，采用倒置顯微鏡觀察破骨細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果顯示，對(duì)照組破骨細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞膜表面光滑，鎘暴露明顯改變了破骨細(xì)胞形態(tài)，主要表現(xiàn)為破骨細(xì)胞腫脹，具有立體感，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)大量孔洞。上述結(jié)果表明，鎘暴露改變了破骨細(xì)胞形態(tài)。

圖1 鎘對(duì)鴨破骨細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2 鎘暴露對(duì)鴨破骨細(xì)胞內(nèi)LDH釋放的影響如圖2所示，成熟鴨破骨細(xì)胞鎘處理12 h后，采用LDH試劑盒檢測(cè)破骨細(xì)胞內(nèi)LDH的釋放。結(jié)果顯示，隨著鎘暴露濃度的增加，LDH的釋放量顯著高于對(duì)照組 (P<0.05)。

與對(duì)照組相比，*P<0,05，**P<0.01。下同

2.3 鎘對(duì)鴨破骨細(xì)胞焦亡率的影響如圖3所示，鴨破骨細(xì)胞鎘暴露12 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)破骨細(xì)胞焦亡率。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，鎘暴露明顯增加了破骨細(xì)胞的焦亡率 (P<0.05)。

圖3 鎘對(duì)鴨破骨細(xì)胞焦亡的影響

2.4 鎘對(duì)鴨破骨細(xì)胞Caspase-1活性的影響如圖4所示，為了探討Casepase-1是否參與鎘誘導(dǎo)的鴨破骨細(xì)胞焦亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了Caspase-1的活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著鎘濃度的增加，Caspase-1的活性逐漸增加 (P<0.05)。

圖4 鎘對(duì)鴨破骨細(xì)胞Caspase-1活性的影響

2.5 鎘對(duì)鴨破骨細(xì)胞內(nèi)IL-1β和IL-18的影響圖5所示，ELISA試劑盒檢測(cè)破骨細(xì)胞內(nèi)IL-1β和IL-18含量。結(jié)果顯示，隨著鎘濃度的增加，與對(duì)照組相比，破骨細(xì)胞內(nèi)IL-1β的含量呈劑量依賴(lài)性增加 (P<0.05)，IL-18的含量也顯著增加 (P<0.05)。

圖5 鎘對(duì)鴨破骨細(xì)胞IL-18(左)和IL-1β(右)的影響

2.6 鎘對(duì)鴨破骨細(xì)胞PI和Hoechst染色的影響如圖6所示，采用PI和Hoechst染色觀察破骨細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞核的完整性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，鎘暴露后紅色熒光明顯增強(qiáng)，同時(shí)藍(lán)色熒光也顯著增強(qiáng)。

圖6 鎘對(duì)鴨破骨細(xì)胞PI和Hoechst染色的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，鎘暴露與骨質(zhì)疏松等疾病有密切的關(guān)系，但是很少有研究揭示細(xì)胞焦亡在骨質(zhì)疏松中的機(jī)制。本課題組前期研究證實(shí)了鎘暴露誘導(dǎo)大鼠原代成骨細(xì)胞凋亡[11]。近年來(lái)，隨著全球工農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展，重金屬污染日趨嚴(yán)重，有關(guān)鎘毒性的研究也越來(lái)越多。本研究采用鴨成熟破骨細(xì)胞暴露于鎘建立細(xì)胞損傷模型，探討鎘誘導(dǎo)鴨破骨細(xì)胞死亡的機(jī)制，為后期進(jìn)一步了解鎘誘導(dǎo)的骨損傷提供新思路。

重金屬鎘是一種嚴(yán)重影響動(dòng)物和人類(lèi)健康的環(huán)境污染物，骨骼是其主要的靶器官之一。近期研究發(fā)現(xiàn)鎘暴露促進(jìn)了鴨破骨細(xì)胞的凋亡及抑制了破骨細(xì)胞的分化，表現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)疏松[5]。細(xì)胞凋亡是不同于細(xì)胞焦亡的一種程序性死亡方式，細(xì)胞凋亡時(shí)主要表現(xiàn)出細(xì)胞皺縮，細(xì)胞骨架解體，細(xì)胞核濃縮等。細(xì)胞凋亡涉及一系列基因的調(diào)控，病理和生理?xiàng)l件下均可發(fā)生[12-13]。本研究結(jié)果顯示，鎘暴露可使鴨破骨細(xì)胞腫脹、具有立體感以及空洞的形成，最終誘導(dǎo)破骨細(xì)胞死亡。該種死亡方式明顯不同于細(xì)胞凋亡，但完全符合細(xì)胞焦亡的形態(tài)特征。因此，破骨細(xì)胞焦亡很可能是鎘誘導(dǎo)其死亡的主要途徑。

除此之外，細(xì)胞凋亡和焦亡都是由Casepase家族介導(dǎo)，細(xì)胞焦亡主要是由Caspase-1和Caspase-3介導(dǎo)[14]，細(xì)胞凋亡主要是Caspase-8和Caspase-9介導(dǎo)的[15]。Casepase-1是屬于Caspase家族的成員，其激活主要依賴(lài)于炎性小體的組裝。當(dāng)外源性的刺激激活炎性小體后，可直接招募Caspase-1，使其發(fā)生自剪切激活[16]。激活后的Casepase-1可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡，同時(shí)可剪切細(xì)胞因子IL-18和IL-1β的前體使其成熟，Caspase-3是不依賴(lài)炎性小體而參與調(diào)控細(xì)胞焦亡。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘暴露后，Casepase-1的活性明顯增加，IL-18和IL-1β的產(chǎn)生也伴隨鎘濃度的增加顯著升高。另外，細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)細(xì)胞膜通透性增加，內(nèi)容物大量釋放，同時(shí)胞外的水分透過(guò)細(xì)胞膜孔道大量進(jìn)入胞內(nèi)，使細(xì)胞腫脹，最終細(xì)胞裂解死亡[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘暴露后破骨細(xì)胞除了形態(tài)發(fā)生明顯改變外，破骨細(xì)胞內(nèi)LDH釋放量顯著增加，這進(jìn)一步說(shuō)明破骨細(xì)胞由于細(xì)胞膜破裂而發(fā)生大量死亡。結(jié)合焦亡的特征，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了鎘誘導(dǎo)鴨破骨細(xì)胞焦亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸外翻與FITC-AnnexinV結(jié)合，但此時(shí)由于細(xì)胞膜并未破裂，PI不能夠進(jìn)入細(xì)胞與DNA結(jié)合，而發(fā)生細(xì)胞焦亡時(shí)由于細(xì)胞膜破裂，PI可直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，形成FITC和PI雙染的細(xì)胞群[18]。本研究結(jié)果表明，鎘暴露明顯增加了FITC和PI雙染的細(xì)胞群，進(jìn)一步表明鎘暴露引起了鴨破骨細(xì)胞發(fā)生焦亡。PI和Hoechst染色進(jìn)一步驗(yàn)證了鎘暴露誘導(dǎo)鴨破骨細(xì)胞發(fā)生焦亡而不是凋亡?？傊?，本試驗(yàn)結(jié)果表明，鎘暴露誘導(dǎo)了鴨破骨細(xì)胞發(fā)生焦亡。