佛山地區(qū)腦梗死患者阿司匹林藥效相關(guān)基因GP1BA多態(tài)性分析

楊康，歐陽(yáng)佩雯，吳蕓華（廣東省佛山復(fù)星禪誠(chéng)醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

腦梗死又稱缺血性腦卒中，約占腦卒中的70%，是由于各類原因?qū)е履X組織血液供應(yīng)障礙，致使缺氧缺血性壞死，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)功能問(wèn)題的臨床綜合征，是當(dāng)今社會(huì)中導(dǎo)致殘疾和死亡較嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)血管性事件[1-2]。阿司匹林作為一線的抗血小板藥物被臨床普遍地應(yīng)用于腦梗死患者的治療和預(yù)防。部分患者使用阿司匹林后呈現(xiàn)阿司匹林抵抗（AR）現(xiàn)象，發(fā)生率為5%-50%[3]。AR受臨床、遺傳和環(huán)境等多種因素影響。當(dāng)前AR被報(bào)道與多種單核苷酸多態(tài)性（SNP）存在相關(guān)性[4]，包括編碼血小板糖蛋白（GP）Ⅱb/Ⅲa的GP1BA（5792C＞T）基因多態(tài)性。由于基因多態(tài)性在不同人群間存在一定的差異[5-6]，目前該基因位點(diǎn)多態(tài)性在本國(guó)人群中的研究較少。本研究中通過(guò)計(jì)算GP1BA（5792C＞T）基因位點(diǎn)在佛山地區(qū)腦梗死人群中的突變情況，分析阿司匹林藥效相關(guān)基因GP1BA（5792C＞T）基因型及等位基因頻率在不同性別和不同地區(qū)人群間的差異，為我國(guó)臨床進(jìn)行個(gè)性化的阿司匹林用藥方案提供遺傳信息依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性隨機(jī)收集2019年4月-2021年4月至我院神經(jīng)內(nèi)科行GP1BA基因多態(tài)性檢測(cè)的腦梗死患者193例病例資料，所有患者均詳細(xì)記錄相關(guān)臨床基線資料，包括年齡、性別、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙史以及合并癥（高血糖、高脂血癥、高血壓）。腦梗死依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組制定的相關(guān)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)[1]，所有患者之間無(wú)血緣關(guān)系，籍貫為廣東佛山，且久居佛山地區(qū)。所納入患者均簽訂知情同意書(shū)，符合醫(yī)學(xué)倫理程序。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器 TL988型熒光定量PCR儀（西安天隆科技有限公司），5424R型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），XO-01漩渦振蕩器（北京泰普聯(lián)合科技開(kāi)發(fā)有限公司）。

1.2.2 試劑 地高辛染色液、樣本萃取液、細(xì)胞保存液（濟(jì)南廣音醫(yī)療科技有限公司）。

1.2.3 GP1BA（5792C＞T）基因多態(tài)性檢測(cè) 采集患者外周血2ml于EDTA·K2抗凝劑保存，提取白細(xì)胞。應(yīng)用熒光染色原位雜交技術(shù)測(cè)定白細(xì)胞中GP1BA（5792C＞T）基因位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)95℃變性解鏈10min，60℃恒溫特異性雜交并實(shí)現(xiàn)非酶級(jí)聯(lián)熒光信號(hào)放大90min。采用雙通道熒光定量PCR儀測(cè)定結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) 通過(guò)檢測(cè)患者的GP1BA（5792C＞T）基因位點(diǎn)，分析GP1BA（5792C＞T）基因多態(tài)性的分布情況、基線資料方面的差異以及與其他地區(qū)人群的差異并作統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 計(jì)算方法

1.4.1 基因型頻率的計(jì)算 收集的GP1BA（5792C＞T）基因位點(diǎn)存在3種可能的基因型：野生型（CC）、雜合突變型（CT）以及純合突變型（TT）。CC型頻率=CC型標(biāo)本數(shù)量/標(biāo)本總數(shù)×100%；CT型頻率=CT標(biāo)本數(shù)量/標(biāo)本總數(shù)×100%；TT型頻率=TT標(biāo)本數(shù)量/標(biāo)本總數(shù)×100%。

1.4.2 等位基因頻率的計(jì)算 依據(jù)HWE定律[2]，當(dāng)標(biāo)本中某個(gè)基因位點(diǎn)只存在C和T兩個(gè)等位基因時(shí)，等位基因C的頻率P(C)=（CC型標(biāo)本數(shù)量×2+CT型標(biāo)本數(shù)量×1）/（標(biāo)本總數(shù)×2）×100%；等位基因T的頻率P(T)=（TT型標(biāo)本數(shù)量×2+CT型標(biāo)本數(shù)量×1）/（標(biāo)本總數(shù)×2）×100%或者P（T）=1-P（C）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 研究數(shù)據(jù)采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。使用χ2檢驗(yàn)分析基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg（HWE）遺傳平衡定律，當(dāng)P＞0.05時(shí)為符合。采用頻數(shù)（百分比）表示計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，兩組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05（雙側(cè)）表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HWE遺傳平衡定律檢驗(yàn) 使用χ2檢驗(yàn)對(duì)入組人群的基因型頻率進(jìn)行HWE平衡檢驗(yàn)，基因型分布符合HWE檢驗(yàn)平衡（χ2=4.98，P＞0.05），說(shuō)明入組的人群具有群體代表性。

2.2 GP1BA（5792C＞T）位點(diǎn)基因型、等位基因頻率及在不同性別中的分布 本研究共檢測(cè)193例佛山地區(qū)腦梗死患者的GP1BA（5792C＞T）基因位點(diǎn)。其中CC型為175例（90.67%）、CT型為16例（8.29%）、TT型為2例（1.04%）。在GP1BA（5792C＞T）基因位點(diǎn)中等位基因C出現(xiàn)的頻率較高為366（94.82%），而等位基因T出現(xiàn)的頻率較低為20（5.18%），盡管該等位基因突變頻率較低，一旦出現(xiàn)，便對(duì)阿司匹林的用藥劑量具有重要的指導(dǎo)意義。研究人群中男性118例，女性75例，通過(guò)比較不同性別間GP1BA（5792C＞T）位點(diǎn)基因型及等位基因頻率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 GP1BA（5792C＞T）位點(diǎn)基因型、等位基因頻率及在不同性別中的分布[n(%)]

2.3 不同區(qū)域人群GP1BA（5792C＞T）位點(diǎn)等位基因頻率分布比較 將本研究人群的等位基因頻率結(jié)果與千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)中GP1BA（5792C＞T）等位基因頻率在其他地區(qū)人群中分布[7]進(jìn)行比較，佛山地區(qū)人群T等位基因突變頻率顯著低于非洲人、歐洲人、美國(guó)人（P＜0.05），與南亞人、東亞人比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 GP1BA（5792C＞T）等位基因頻率在不同地區(qū)人群間的分布[n(%)]

3 討論

阿司匹林作為治療和預(yù)防腦梗死患者的主要藥物，但部分患者即使規(guī)律使用阿司匹林仍會(huì)出現(xiàn)AR。當(dāng)前，AR的機(jī)制尚不明確，抗血小板藥物作用與代謝過(guò)程中涉及的相關(guān)基因，其多態(tài)性可能是重要原因[8-9]。以往研究[4]提示，GP1BA（5792C＞T）基因多態(tài)性是阿司匹林抗血小板藥效相因素，Matsubara Y[10]等研究表明GP1BA（5792C＞T）基因多態(tài)性與患者對(duì)阿司匹林藥效有關(guān)，患者攜帶C等位基因，其阿司匹林抵抗風(fēng)險(xiǎn)較高。因此，研究GP1BA（5792C＞T）基因多態(tài)性有助于臨床實(shí)施個(gè)體化使用阿司匹林，提高藥物療效。

伴隨分子生物學(xué)研究的逐步深入，大量學(xué)者開(kāi)始研究遺傳因素在阿司匹林抵抗中的作用[11-13]。廣東省藥學(xué)會(huì)在抗血小板藥物個(gè)體化藥學(xué)服務(wù)指引中表明，在使用阿司匹林抗血小板治療時(shí)，應(yīng)行GP1BA（5792C＞T）基因多態(tài)性檢測(cè)[14]。本研究結(jié)果顯示193例佛山地區(qū)腦梗死患者GP1BA（5792C＞T）基因多態(tài)性中，CC型為175例（90.67%）、CT型為16例（8.29%）、TT型為2例（1.04%），等位基因C突變?yōu)門(mén)的頻率為5.18%，表明該基因位點(diǎn)在佛山地區(qū)腦梗死患者存在不同基因型。通過(guò)比較不同性別間GP1BA（5792C＞T）位點(diǎn)基因型及等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這可能與本研究納入的樣本量較少有關(guān)。同時(shí)筆者將佛山地區(qū)人群T等位基因頻率同千人基因組計(jì)劃研究的人群進(jìn)行比較，結(jié)果顯示佛山地區(qū)人群與東亞地區(qū)人群、南亞地區(qū)人群等位基因頻率無(wú)顯著性差異（P＞0.05），與歐洲人、美國(guó)人、非洲人存在著顯著性差異。GP1BA（5792C＞T）基因多態(tài)性在國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道較少，其中劉磊磊[15]等人報(bào)道顯示江蘇南京地區(qū)漢族腦梗死人群的GP1BA（5792C＞T）T等位基因頻率（7.2%），等位基因突變頻率與本研究突變頻率（5.18%）較為一致。楚明明[16]等人報(bào)道顯示西南地區(qū)358例動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病患者GP1BA（5792C＞T）基因CC型307例（85.75%），CT型48例（13.41%），TT型3例（0.84%），突變率14.25%，與本研究基因型及等位基因頻率存在一定差異，可能由于地區(qū)種族人群原因?qū)е?。楊秀峰[17]等人研究顯示缺血性腦卒中患者GP1BA（5792C＞T）基因型檢測(cè)結(jié)果野生型（CC）78例（61.9%），與本研究結(jié)果中野生型175例（90.67%）、突變型（CT+TT）18例（9.33%），存在差異，可能是由于黑龍江大慶地區(qū)人群與本地區(qū)人群存在差異。相關(guān)報(bào)道[7]顯示亞洲人T等位基因突變頻率（7.61%）、東亞人T等位基因突變頻率（7.04%）、南亞人T等位基因突變頻率（5.58%）與本研究結(jié)果相近，非洲人T等位基因突變頻率（20.12%）、美國(guó)人T等位基因突變頻率（20.08%）、歐洲人T等位基因突變頻率（8.75%）與本研究結(jié)果存在較大差異。

綜上所述，GP1BA（5792C＞T）基因存在多態(tài)性，不同性別間比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但不同地區(qū)人群中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果提示針對(duì)其他人群在基于GP1BA基因進(jìn)行診斷治療時(shí)，其診斷治療方案有可能不適用于我國(guó)人群。臨床醫(yī)生使用阿司匹林治療前應(yīng)考慮GP1BA（5792C＞T）基因多態(tài)性問(wèn)題，根據(jù)不同患者的基因型，給予不同治療方案，以期患者能獲得更好的療效。本研究存在的局限有：①納入的樣本量較少；②未對(duì)不同基因型患者進(jìn)行不同用藥劑量設(shè)計(jì)及藥物治療效果的監(jiān)測(cè)。未來(lái)可通過(guò)擴(kuò)大樣本量、多中心，進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪評(píng)價(jià)不同基因型對(duì)療效的影響。