張一琦，陳 欣，聶志妍，鄭永貴，蘇佳純

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染最常見的病原菌之一，隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，我國碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（CRKP）的檢出率逐年增加[1]，且其感染已經(jīng)對臨床構(gòu)成嚴(yán)重威脅。多黏菌素類抗生素（包括黏菌素、多黏菌素B）是一類從多黏芽孢桿菌培養(yǎng)液中提取得到的多肽類抗生素，對多數(shù)革蘭陰性菌有抗菌作用，其耐藥菌檢出率較低，但目前有研究表明對多黏菌素的耐藥率有增加趨勢[2-3]。作為抗擊多重耐藥革蘭陰性菌的“最后一道防線”，如何減少其耐藥的發(fā)生就顯得尤為重要。有文獻(xiàn)報(bào)道，黏菌素在臨床使用中可使CRKP出現(xiàn)染色體突變，從而介導(dǎo)對黏菌素耐藥[4]。本研究通過體外黏菌素的選擇性壓力作用，獲取對黏菌素的耐藥突變株，并通過全基因組二代測序分析，研究其耐藥的形成機(jī)制，為臨床科學(xué)合理使用黏菌素、減少黏菌素耐藥CRKP的傳播和蔓延提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 藥敏質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853，以及CRKP臨床分離株（CRKP 12-130），均為復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所凍存菌株。

1.1.2 儀器與試劑 細(xì)菌比濁儀（法國生物梅里埃公司）、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Mueller Hinton（MH）瓊脂和營養(yǎng)瓊脂為英國OXIOD公司商品、陽離子調(diào)節(jié)MH肉湯（CAMHB）為美國BD公司商品，黏菌素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品鑒定研究院。

1.2 方法

1.2.1 黏菌素自發(fā)耐藥突變菌株的選擇 將臨床分離菌CRKP 12-130復(fù)蘇后，取單個(gè)菌落接種到新平板上分區(qū)劃線，從中挑取單個(gè)菌落接種至 5 mL MH肉湯培養(yǎng)37℃過夜，次日對菌液采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算100 μL菌液所含菌落的數(shù)量作為初始菌落數(shù)。同時(shí)取100 μL CRKP 12-130菌液涂布于分別含2、4、8、16、32倍MIC黏菌素的MH瓊脂平板，連續(xù)5 d觀察不同黏菌素濃度的MH瓊脂平板上CRKP 12-130菌株的生長情況。對不同黏菌素濃度平板上長出的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)、編號，隨機(jī)取50個(gè)菌落，并將其接種至不含黏菌素的新鮮MH瓊脂平板，連續(xù)傳代10次。

按美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏測定及結(jié)果判讀（MIC≥4 mg/L判定為對黏菌素耐藥）[5]。通過計(jì)數(shù)細(xì)菌的初始總菌落數(shù)，以及黏菌素不同抗生素濃度下選擇獲得的耐藥菌落數(shù)計(jì)算突變頻率，計(jì)算公式為：突變頻率=篩選平板上總菌落數(shù)×耐藥率/初始菌落數(shù)。

1.2.2 突變株細(xì)菌基因組DNA提取和測序 隨機(jī)取不同黏菌素MIC的CRKP 12-130耐藥突變株40株，以及CRKP 12-130原始株，采用由天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302），按照說明書操作步驟，提取細(xì)菌基因組DNA；將基因組DNA采用Illumina二代測序平臺進(jìn)行測序，測序數(shù)據(jù)拼接后與黏菌素敏感肺炎克雷伯菌HS11286參考序列（GenBank序列號：NC_016845.1）進(jìn)行比對，分析其耐藥相關(guān)突變情況。

1.2.3mgrB基因PCR檢測 根據(jù)二代測序分析結(jié)果，利用mgrB基因兩翼序列（KPHS-33450和KPHS-33620）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物設(shè)計(jì)（見圖1），引物序列為mgrB-yz1-Fs：ata agc cac gct taa cca atc g與mgrB-yz1-Rs：cgc ctg aca tta acg cct tcg，PCR產(chǎn)物151 bp，以TaKaRa DL2000為DNA marker時(shí)mgrB基因缺失菌株的PCR產(chǎn)物會在100 bp與250 bp間出現(xiàn)條帶；而無mgrB基因缺失的菌株由于兩引物間超過15 kb，72℃延伸30 s擴(kuò)增條件下將不會獲得PCR產(chǎn)物。采用煮沸法制備細(xì)菌DNA模板。PCR反應(yīng)體系總體積50 μL，包括DNA模板3 μL，相應(yīng)上、下游引物各2 μL（10 μmol/L），PCR反應(yīng)試劑Mix 25 μL，ddH2O 18 μL。PCR擴(kuò)增條件94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸30 s；共循環(huán)35次；72℃延伸5 min。

采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳后經(jīng)SYBR GreenⅠ染色30 min后在ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，分析菌株中mgrB基因發(fā)生變異的情況，如在100 bp與250 bp間出現(xiàn)PCR產(chǎn)物條帶，表明受試菌株存在mgrB基因完全缺失。

2 結(jié)果

2.1 CRKP 12-130對黏菌素的耐藥突變頻率

通過平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算出100 μL CRKP 12-130過夜培養(yǎng)菌液的初始菌落數(shù)為5.3×107CFU/mL。 涂布于含2倍MIC（0.5 mg/L）、4倍MIC（1 mg/L）、8倍MIC（2 mg/L）、16倍MIC（4 mg/L）、32倍MIC（8 mg/L）黏菌素藥物濃度的MH瓊脂平板，5 d后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示2倍MIC平板上生長400個(gè)、4倍MIC平板上生長193個(gè)、8倍MIC平板上生長300個(gè)、16倍MIC平板上生長270個(gè)、32倍MIC平板上生長206個(gè)。

采用CLSI推薦的微量肉湯稀釋法測定黏菌素對細(xì)菌的MIC，黏菌素對質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853的MIC分別為 0.25 mg/L和0.5 mg/L，均在質(zhì)控范圍內(nèi)；250株待測菌中，230株（92.0%）顯示對黏菌素耐藥。從含2倍、4倍、8倍、16倍、32倍MIC黏菌素的選擇平板上獲得細(xì)菌耐藥的占比分別是66%、94%、100%、100%、100%；根據(jù)耐藥突變菌落數(shù)和初始菌落數(shù)計(jì)算CKRP對黏菌素的耐藥突變頻率。見表1。

表1 不同黏菌素濃度平板上獲得250株肺炎克雷伯菌菌株的藥敏結(jié)果及耐藥突變頻率Table 1 Mutation frequency of colistin resistance and susceptibility of 250 strains of Klebsiella pneumoniae obtained on selective plate containing different concentrations of colistin

2.2 黏菌素耐藥相關(guān)基因檢測

本研究挑選了40株不同黏菌素耐藥水平的CRKP進(jìn)行全基因組二代測序，結(jié)果顯示，15株菌株存在mgrB基因缺失，同時(shí)伴隨mgrB基因兩側(cè)KPHS-33560和KPHS-33580序 列（GenBank序列號：NC_016845.1）的缺失。2株菌株存在mgrB基因位置相同的部分缺失突變。2株菌株的mgrB基因中出現(xiàn)了堿基的替換突變（G82C），并導(dǎo)致變異（Gly28Cys）。這些菌株的MIC值在16～128 mg/L，表現(xiàn)出高水平耐藥。測序菌株的phoP、pmrA、pmrB基因均為野生型，未發(fā)生突變，見表2。

表2 黏菌素耐藥突變菌株的全基因組二代測序分析結(jié)果Table 2 Genomic variation of colistin-resistant mutants by whole-genome second-generation sequencing analysis

通過PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳，在230株從2倍、4倍、8倍、16倍和32倍MIC黏菌素選擇平板上獲得的黏菌素耐藥CRKP菌株中分別有18株、21株、22株、15株、23株，在100 bp與250 bp間存在PCR產(chǎn)物條帶，共計(jì)99株mgrB基因完全缺失菌株。

3 討論

本研究將臨床分離的CRKP通過微量肉湯稀釋法測定其MIC，并通過含不同黏菌素濃度選擇、計(jì)算CRKP菌株的突變株和突變頻率，發(fā)現(xiàn)含8倍MIC（2 mg/L）黏菌素選擇濃度中突變頻率最高，為5.66×10-6，含16倍MIC（4 mg/L）和2倍MIC （0.5 mg/L）黏菌素選擇濃度中突變頻率次之，分別為5.09×10-6和4.98×10-6，含32倍MIC（5 mg/L）和4倍MIC（1 mg/L）黏菌素選擇濃度中突變頻率略低，分別為3.88×10-6和3.42×10-6。綜上，表明肺炎克雷伯菌臨床分離株在黏菌素暴露后易發(fā)生耐藥相關(guān)突變，臨床使用黏菌素進(jìn)行肺炎克雷伯菌感染的治療中有很大概率選擇出耐藥突變菌株，不同濃度黏菌素的選擇壓力下均可選擇出耐藥突變株，提示在黏菌素單藥治療期間需謹(jǐn)防耐藥突變株出現(xiàn)。

我們在獲得的黏菌素耐藥株中挑選了40株，其MIC范圍為4～128 mg/L，借助全基因組二代測序并結(jié)合生物學(xué)信息分析，發(fā)現(xiàn)此次耐黏菌素突變株中mgrB基因的缺失是最常見的突變。之前的研究顯示，mgrB基因?qū)hoPQ雙組分系統(tǒng)起著負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用[6]。當(dāng)mgrB基因發(fā)生插入失活而無法正確表達(dá)時(shí)，PhoPQ雙組分系統(tǒng)將過度表達(dá)，進(jìn)而激活pmrHFIJKLM操縱子[7]。pmrHFIJKLM操縱子的產(chǎn)物能夠合成4-氨基阿拉伯糖（L-Ara4N），通過在脂質(zhì)A上添加正電荷，降低其與黏菌素的親和力，而導(dǎo)致耐藥[8]。同時(shí)，我們根據(jù)mgrB基因缺失耐藥株兩端存留序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并電泳分析，結(jié)果顯示有99株菌株在100 bp與250 bp間出現(xiàn)PCR產(chǎn)物條帶，為mgrB基因缺失的菌株。上述結(jié)果可推測，本組資料顯示的mgrB基因突變可能在多黏菌素耐藥性產(chǎn)生中發(fā)揮了重要作用。

PhoP是PhoPQ雙組分系統(tǒng)的組成部分，與pmrA和pmrB編碼的pmrAB雙組分系統(tǒng)共同調(diào)控L-Ara4N的合成和pmrHFIJKLM操縱子表達(dá)[9]。 有研究人員觀察到肺炎克雷伯菌中phoP基因上單個(gè)氨基酸Asp191Tyr的改變將致使phoP基因非正常表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致耐藥[7]。pmrA和pmrB基因的突變可能會引起pmrAB系統(tǒng)的激活，使pmrC和pmrHFIJKLM操縱子上移，促使陽離子基團(tuán)添加到細(xì)菌脂多糖的脂質(zhì)A上，進(jìn)而形成對多黏菌素的耐藥性[10]。本研究挑選不同黏菌素耐藥水平的突變株進(jìn)行耐藥相關(guān)基因序列分析，結(jié)果顯示phoP、pmrA、pmrB基因均為野生型，未發(fā)生突變，相較mgrB基因，phoPQ、pmrAB雙組分系統(tǒng)在黏菌素選擇壓力下有更好的穩(wěn)定性。

綜上，CRKP菌株暴露于不同濃度黏菌素時(shí)，可快速選擇出突變耐藥株，推測臨床使用黏菌素治療CRKP感染時(shí)，細(xì)菌染色體可能發(fā)生變異，進(jìn)而導(dǎo)致耐藥及治療失?。籱grB基因突變是導(dǎo)致CRKP對黏菌素耐藥的主要機(jī)制，在使用黏菌素過程中應(yīng)關(guān)注此類現(xiàn)象的發(fā)生，加強(qiáng)防范。此外，由于本研究測試菌株少，實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行多次重復(fù)等不足，后續(xù)將納入更多臨床分離株，開展進(jìn)一步研究，明確此類耐藥形成現(xiàn)象是否具有普遍性，為防控提供參考依據(jù)。