賴文昶 黃森豪 祁成民 吳仁燁

摘 ? ?要：水稻是我國主要糧食作物之一，水稻育種是一項重要的科研工作。隨著科技的發(fā)展，相關(guān)人員研發(fā)出越來越多的新型生物技術(shù)，例如基因工程、細胞工程、分子標記技術(shù)、基因編輯技術(shù)等，并在水稻育種研究中得到廣泛的應(yīng)用，解決了育種工作中出現(xiàn)的許多問題。文章論述了生物技術(shù)在水稻育種中的作用，總結(jié)了生物技術(shù)在水稻育種中存在的問題，以供參考。

關(guān)鍵詞：水稻育種;生物技術(shù);基因工程;細胞工程;分子標記技術(shù);基因編輯技術(shù)

文章編號：1005-2690（2022）09-0034-03 ? ? ? 中國圖書分類號：S511 ? ? ? 文獻標志碼：B

水稻是稻屬谷類作物，是世界上最主要的三大糧食作物之一，種植面積占世界糧食總面積的1/5。我國是世界上最大的水稻生產(chǎn)國和消費國，水稻產(chǎn)量約占全國糧食總產(chǎn)量的1/2。同時，水稻在釀酒、醫(yī)藥、工業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，水稻事業(yè)的發(fā)展與國家糧食安全關(guān)系重大。

生物技術(shù)以基因工程和細胞工程為核心，包含發(fā)酵工程、酶工程等生物技術(shù)的新興學(xué)科。目前，我國水稻育種面臨病蟲害頻發(fā)、人多地少、選育效率低等問題，生物技術(shù)可以有效解決這些問題，被廣泛應(yīng)用于水稻育種中。

1 基因工程

基因工程也被稱作基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是在分子生物學(xué)和微生物學(xué)的基礎(chǔ)上，以分子遺傳學(xué)為理論來源的現(xiàn)代生物技術(shù)。水稻基因工程育種是把需要的目的基因克隆轉(zhuǎn)移到水稻上，進而實現(xiàn)對水稻遺傳特性的改良。同時，通過建立完善高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，對優(yōu)良的目的基因進行整合和表達，使之穩(wěn)定地遺傳給下一代[1]。在基因轉(zhuǎn)化過程中常被使用的外植物體包括愈傷組織、原生質(zhì)體和根尖、莖尖等組織器官，水稻的幼穗、幼胚和花藥等愈傷細胞往往作為基因轉(zhuǎn)化的受體。

目前，水稻轉(zhuǎn)基因包括抗病性基因、抗蟲性基因、抗除草劑基因、抗逆性基因以及品質(zhì)改良基因等。促進水稻基因工程育種的發(fā)展對于培育高產(chǎn)、抗病、抗蟲、抗逆的新型水稻品種，對推動農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1.1 基因槍法

基因槍法是利用高壓放電、壓縮氣體等方法產(chǎn)生的巨大動力，使黏有目標DNA的高速金（鎢）微粒轟擊進入靶細胞，再通過未知機制，將外源DNA導(dǎo)入植物染色體上實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)。

基因槍法的可控度較高，可根據(jù)需要將金屬顆粒射入特定的細胞，并且不受宿主的限制。但基因槍轟擊位點的隨機性和整合位點的不固定性，大大增加了基因突變、丟失和基因沉默的可能性，影響了外源基因在生物體內(nèi)的穩(wěn)定表達。

1.2 花粉管通道法

花粉管通道法也被稱為授粉后外源基因?qū)胫参锛夹g(shù)。在植物完成授粉后，柱頭部位的花粉會形成一個花粉管通道，然后采用人工方法將外源DNA轉(zhuǎn)移至胚囊。由于受精卵和生殖細胞仍處于未形成細胞壁的“原生質(zhì)體”狀態(tài)，外源DNA片段容易進入、整合到原有的基因組中，達到遺傳轉(zhuǎn)化的目的。

當前流行的方法包括花粉管直接攜帶法、花粉勻漿涂抹柱頭法、自花授粉后導(dǎo)入法、受體花粉及供體DNA混合授粉法等。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌是在土壤中普遍存在的一種革蘭氏陰性菌，能夠在自然條件下有選擇地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，產(chǎn)生根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。具體過程是將根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中的一段T-DNA插入到植物基因組中，進而對水稻的性狀進行改良[2]。

1.3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻的優(yōu)點

與基因槍法、花粉管通道法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是最經(jīng)濟、操作最為簡單的方法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法利用天然的載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，具有高效率、高成功率的特點。外源DNA有明顯的轉(zhuǎn)化機理，能夠在轉(zhuǎn)化過程中保持穩(wěn)定。外源基因在植物器官內(nèi)進行特異性表達，可進行人為控制。

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入的外源DNA結(jié)構(gòu)完整，反應(yīng)機理清楚，整合位點穩(wěn)定。經(jīng)過Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的外源大多以單拷貝為主，且符合孟德爾遺傳定律。因此通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的植物大多被應(yīng)用于育種的中間選育材料。T-DNA含有能夠被植物體識別的功能啟動子和轉(zhuǎn)錄信號，能夠使外源DNA和T-DNA一同在植物體內(nèi)表達[3]。

1.3.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻的缺點

存在再生細胞感受態(tài)與轉(zhuǎn)化細胞感受態(tài)不一致的情況。農(nóng)桿菌可能會使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。農(nóng)桿菌介導(dǎo)目前僅在雙子葉植物中被廣泛應(yīng)用，對于單子葉植物的轉(zhuǎn)化仍比較困難。

2 細胞工程

2.1 細胞工程育種簡述

細胞工程的主要理論支撐和思想來源是Haberlandt在20世紀初提出的植物細胞全能性，是指植物體的每個體細胞都攜帶一整套完整的植物基因組，在理論上具備發(fā)育成一個完整植株的能力。

在細胞水平上對植物細胞進行融合，再通過細胞核質(zhì)移植、染色體移植等操作，培育植物新品種、改善植物性狀或引入新性狀。當前流行的細胞工程技術(shù)主要有無性系篩選、原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細胞雜交、花藥培養(yǎng)和多倍體育種等。

植物學(xué)家曾運用細胞工程技術(shù)雜交兩種植物的體細胞創(chuàng)造出一個新細胞，對其進行單細胞培養(yǎng)，讓先分裂分化為組織，進而發(fā)芽生根，最后發(fā)育成新植物，新植物同時具有親代的各自特征，而且在外觀上很像親代植物的組合體。

更有生物學(xué)家幻想將動物細胞與植物細胞相融合，讓動物具有植物的葉綠體，使其具有光合作用，能夠自己合成營養(yǎng)物質(zhì)。除此之外，還有許多基于細胞工程得以實現(xiàn)的成果，目前細胞工程的許多技術(shù)已十分成熟，且廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。

2.2 細胞工程育種的特點

細胞工程育種可以改良舊植物品種或產(chǎn)生新植物品種，篩選出良好性狀的植物品種，改善植物的生長速度、繁殖速度，實現(xiàn)種子脫毒。運用細胞工程技術(shù)改良的植物可以穩(wěn)定遺傳性狀，加快育種進程，提高育種效率，縮短育種年限。體細胞融合技術(shù)和雜交技術(shù)等新技術(shù)的出現(xiàn)，可以幫助相關(guān)人員克服植物間遠緣雜交不親和的問題。

2.3 細胞工程技術(shù)在水稻育種中的應(yīng)用

早在20世紀70年代，我國便開始將細胞工程技術(shù)運用于水稻育種。先是中國科學(xué)院嘗試將水稻花粉離體培養(yǎng)，不久中科院遺傳所率先使用單倍體育種法先后培育出兩個新品種水稻，在之后的50多年里，我國育種專家不斷將各種細胞工程技術(shù)運用到水稻育種中，如今許多技術(shù)已相當成熟并實現(xiàn)了廣泛應(yīng)用[4]。例如，水稻的花藥培養(yǎng)技術(shù)不僅應(yīng)用于常規(guī)育種與雜交育種，而且在水稻“恢復(fù)系”和“不恢復(fù)系”材料的選育方面也發(fā)揮了重要作用。

3 分子標記技術(shù)

3.1 分子標記技術(shù)的簡介及原理

DNA分子標記技術(shù)是一種依靠基因組DNA中核苷酸排列順序的差異示位、追蹤、顯示不同個體之間所潛藏的遺傳變異差異的生物技術(shù)[5]。分子標記最早出現(xiàn)要追溯到20世紀80～90年代SSR技術(shù)（Simple Sequence Repeat：簡單重復(fù)序列）和RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism：限制性片段長度多態(tài)性）的橫空出世。

前者是依靠當時已經(jīng)成熟的PCR技術(shù)（Polymerase Chain Reaction）和微衛(wèi)星DNA特性的標記技術(shù)，原理是在真核生物基因組上會出現(xiàn)短串聯(lián)重復(fù)序列這一序列，又稱微衛(wèi)星DNA，不同個體之間的重復(fù)序列長度不同，根據(jù)這一差異可以在微衛(wèi)星序列的兩端設(shè)計引物，再通過PCR技術(shù)對微衛(wèi)星序列進行大量擴增。因為不同個體間的序列長度不同，所以使用PCR技術(shù)擴增出的序列長度也有所不同，因此電泳出的條帶大小也不同。

RFLP技術(shù)比SSR技術(shù)更早，早在1974年Grodzicke等人就創(chuàng)立了RFLP技術(shù)，其建立在DNA雜交技術(shù)原理的基礎(chǔ)上，同時也是最早廣泛應(yīng)用的分子標記技術(shù)。分子標記技術(shù)首先使用特定的限制性內(nèi)切酶對整個基因組進行切割，得到長度不同的DNA片段，再通過southern雜交和放射性影像顯示得到相應(yīng)的圖譜，不同圖譜能反映出不同個體間酶切位點的多態(tài)性。RFLP技術(shù)因為其共顯性與特定位點的多樣性，在遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳育種、臨床醫(yī)療診斷等許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

3.2 分子標記技術(shù)的特點

分子標記技術(shù)相對于其他標記技術(shù)來說優(yōu)點突出，分子標記技術(shù)受環(huán)境影響較小、穩(wěn)定性較高、準確性高、多態(tài)性強。分子標記技術(shù)以基因突變?yōu)榛A(chǔ)，分子標記的數(shù)量眾多且分布較廣，從理論的角度出發(fā)，標記的數(shù)量幾乎是無限的，生物發(fā)育的各個時期，不同器官、不同組織的DNA都可以用作于分子標記分析。

大多數(shù)DNA分子標記具有共顯性，利用這一特點能夠鑒定和識別雜合子與純合子的基因型。分子標記的表現(xiàn)為中性，對表達目標性狀的影響幾乎為零，并且與不良性狀不存在任何連鎖關(guān)系，最重要的是操作簡單、檢驗迅速。

3.3 分子標記技術(shù)在水稻遺傳育種中的應(yīng)用

通過分子標記技術(shù)進行基因定位、基因型鑒定、目的基因篩選、基因克隆等操作都是育種過程中所需要的，分子標記技術(shù)不僅提高了準確性及選擇效率，還縮短了育種周期與育種年限，具有很強的目的性，在水稻的遺傳育種中應(yīng)用非常廣泛。

分子標記技術(shù)在水稻的抗病蟲育種中同樣發(fā)揮了重要作用，在抗病基因的選擇上得益于分子標記技術(shù)輔助，準確率和精確率得以大大提高。尤其在抗稻瘟病的研究中發(fā)揮了非常重要的作用。

我國科學(xué)家鄭祥正等發(fā)明了一種名叫InDel的標記，該標記能夠準確實現(xiàn)抗病基因和非抗病基因的基因分型，大大簡化了水稻抗稻瘟病種質(zhì)的篩選工作[6]。陳紅旗等通過分子標記技術(shù)在保持系金23B中導(dǎo)入基因Pi-1，Pi-3（抗稻瘟病基因），使其達到了96.7%的抗病率[7]。

分子標記技術(shù)還可以幫助構(gòu)建水稻的分子遺傳圖譜，以分子標記技術(shù)為工具，通過目的基因分子標記之間的緊密連鎖實現(xiàn)目的基因的定位，構(gòu)建出水稻的高密度的遺傳連鎖圖譜。1988年McCouh率先構(gòu)建了第一張水稻遺傳圖譜，Causse等和Harushima等緊隨其后分別完成了不同標記數(shù)量的高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建工作，在之后的30多年間標記位點數(shù)目不斷增加，已經(jīng)達到326個RFLP標記，公布的水稻SSR標記達到14 000多個，基本實現(xiàn)了基因組的全部覆蓋。

4 基因編輯技術(shù)

4.1 基因編輯技術(shù)的簡介及特點

基因編輯也被稱作基因組編輯（genome editing）或基因組工程（genome engineering），是一種能夠準確修飾生物體特定目標基因的新興技術(shù)?；蚓庉嫾夹g(shù)是利用去除或添加基因、替代基因、定點突變等方式修飾原有的基因，改變物種原有的基因型，進而實現(xiàn)物種性狀的改變。目前，比較流行的基因編輯技術(shù)包括一代ZFNs基因編輯技術(shù)、二代TALENs基因編輯技術(shù)和三代CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)[8]。

4.2 基因編輯技術(shù)在水稻育種中的應(yīng)用

目前，大量試驗數(shù)據(jù)表明，基因編輯技術(shù)與水稻育種速率和效率密切相關(guān)。利用CRISPR/Cas9技術(shù)培育的水稻具有較高的出苗率。覃玉芬等通過CRISPR/Cas9技術(shù)系統(tǒng)編輯水稻品種GXU41中TMS5的兩個靶點位，獲得純合突變的T0代陽性植株，并在T1代獲得到無外源標記的植株。表明該技術(shù)能夠提高得到TGMS系效率。

隨著生活水平的提高，人們對水稻的口感和香糯程度也有了更高的要求，基因編輯技術(shù)恰恰使這一目標成為現(xiàn)實。現(xiàn)階段，可使用基因編輯技術(shù)改良人們所需的水稻性狀，從而將水稻中直鏈淀粉的含量達到最適水平[9]。

5 生物技術(shù)在水稻育種中存在的問題與展望

雖然當前生物技術(shù)在水稻育種中得以廣泛應(yīng)用，取得了較大進展，但仍存在一些現(xiàn)實性問題亟待解決。我國缺乏高效完整的基因發(fā)掘技術(shù)，對于實用分子的標記仍處于空白，一些重要的目標性狀基因急需標記。水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)仍處于發(fā)展階段，水稻的出愈率、綠芽分化率較低，后期可能會影響后代的基因型表達。應(yīng)用生物技術(shù)培育的水稻雖然實現(xiàn)了目標性狀的轉(zhuǎn)移，但要想應(yīng)用于生產(chǎn)必須通過常規(guī)育種進行加工。農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)無法同時標記多個目標性狀，農(nóng)藝產(chǎn)品無法滿足市場對品種的需求[10]。

因此，要加快水稻基因工程與細胞工程的結(jié)合，充分利用我國豐富的水稻種質(zhì)資源，建立優(yōu)良的水稻核心種質(zhì)資源基因庫，利用分子標記技術(shù)對不同的種質(zhì)進行遺傳多樣性評價，構(gòu)建以農(nóng)家稻、野生稻、恢復(fù)系、不育系為核心的種質(zhì)，為我國水稻發(fā)展提供源源不斷的種質(zhì)資源。將生物技術(shù)和常規(guī)育種相結(jié)合，使用回交方法將導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)入生產(chǎn)品種中，或通過常規(guī)品種和轉(zhuǎn)基因品種的雜交，利用系譜法選出新品種。

只要抓住生物技術(shù)發(fā)展的契機，充分做足理論、技術(shù)的準備，就能利用生物技術(shù)實現(xiàn)水稻優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、廣適應(yīng)性改良的目標，更好地緩解糧食供給側(cè)結(jié)構(gòu)矛盾，促進我國水稻產(chǎn)業(yè)增效提質(zhì)。

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