盛美玲 汪群智

[摘要] 目的 了解呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)改變對(duì)慢性阻塞性肺疾?。–OPD）急性加重預(yù)后的影響。方法? 選取2019年3月至2021年3月浙江省金華市人民醫(yī)院收治的140例AECOPD患者為研究對(duì)象。依據(jù)預(yù)后分為死亡組（21例）及存活組（119例）。收集所有對(duì)象呼吸道灌洗液標(biāo)本，提取DNA并進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA測(cè)序，比較兩組的肺泡灌洗液中細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)并與其預(yù)后進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果? 兩組患者的呼吸道菌群Alpha多樣性指數(shù)比較，ACE及Chao指數(shù)死亡組顯著高于存活組（P<0.05），Shannon及Simpson指數(shù)兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果提示，ACE及Chao指數(shù)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.37、-0.52，P=0.047、0.027）。結(jié)論? COPD急性加重時(shí)呼吸道微生態(tài)的豐富度可能與其預(yù)后相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] COPD;呼吸道;微生態(tài);預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R563.9? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）12-0090-04

[Abstract] Objective To understand the effect of respiratory tract microecosystem changes on the prognosis of acute exacerbation of COPD. Methods A total of 140 patients with AECOPD admitted to the Jinhua People′s Hospital in Zhejiang Province from March 2019 to March 2021 were selected as the study subjects. According to prognosis， they were divided into the death group （21 cases） and the survival group （119 cases）. Respiratory tract lavage fluid samples were collected from all subjects. DNA was extracted， and bacterial 16S rDNA sequencing was performed. The bacterial Alpha diversity index in the bronchoalveolar lavage fluid was compared between the two groups， and its correlation with prognosis was analyzed. Results Comparing the Alpha diversity index of the respiratory tract flora of the two groups of patients， the ACE and Chao index of the death group were significantly higher than the survival group （P<0.05）. There was no significant difference in the Shannon and Simpson indexes between the two groups （P>0.05）. The results of Pearson correlation analysis suggested that ACE and Chao index were negatively correlated with prognosis （r=-0.37， -0.52， P=0.047， 0.027）. Conclusion The richness of respiratory tract microecology in acute exacerbation of COPD may be related to its prognosis.

[Key words] COPD; Respiratory tract; Microecology; Prognosis

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmoriary disease，COPD）是一組進(jìn)行性氣流受限、不完全可逆為特征的肺部疾病。該病患者呼吸系統(tǒng)癥狀的惡化被稱為急性加重 （acute exacerbations chronic obstructive pulmoriary disease，AECOPD）。在臨床實(shí)踐中，急性加重的病因和誘因較多，約超過80% 的AECOPD發(fā)生與細(xì)菌或病毒等病原體感染有關(guān)[1-2]。AECOPD會(huì)對(duì)患者的肺功能、生活質(zhì)量及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)產(chǎn)生顯著影響，嚴(yán)重的甚至危及生命，這已成為困擾臨床工作的棘手問題之一。了解AECOPD患者的呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)情況，有利于臨床針對(duì)性治療各種原因引起的感染。既往研究集中在有關(guān)呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)成[3-4]，但鮮有文章涉及呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)與預(yù)后。本研究通過探討AECOPD患者呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)變化與預(yù)后的關(guān)系，了解其對(duì)預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年3月至2021年3月浙江省金華市人民醫(yī)院收治的140例AECOPD患者為研究對(duì)象。依據(jù)預(yù)后分為死亡組（21例）及存活組（119例）。存活組中男73例，女46例;年齡52～67歲，平均（61.31±5.24）歲;病程5～13年，平均（7.91±1.44）年;肺功能相關(guān)指標(biāo)：一秒用力呼氣容積（0.93±0.27）L、平均一秒用力呼氣容積（1.07±0.13）L、用力肺活量（1.71±0.23）L、平均用力肺活量（2.01±0.24）L。死亡組中男13例，女8例;年齡56～67歲，平均（61.72±4.54）歲;病程5～15年，平均（8.24±1.94）年;肺功能相關(guān)指標(biāo)：一秒用力呼氣容積（0.97±0.32）L、平均一秒用力呼氣容積（1.12±0.15）L、用力肺活量（1.75±0.21）L、平均用力肺活量（2.05±0.28）L。兩組患者的上述一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有入選患者診斷均符合GOLD 2019版《global strategy for diagnosis，management，and prevention of COPD，updated 2019》[5]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)及分級(jí);②所有患者無意識(shí)障礙及血流動(dòng)力學(xué)障礙;③患者和/或家屬了解研究?jī)?nèi)容及方法，并均簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除具有支氣管哮喘、過敏性鼻炎、遺傳性過敏癥病史者;②排除肺纖維化、肺不張、肺栓塞等情形者;③排除嚴(yán)重心腦血管疾病或腎衰竭者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 方法

1.2.1 呼吸道標(biāo)本樣本收集? 患者取仰臥位，應(yīng)用1%利多卡因霧化吸入局部浸潤(rùn)麻醉，靜脈推注咪達(dá)唑侖2 mg，應(yīng)用纖維支氣管鏡對(duì)右肺中葉的某一亞段進(jìn)行肺泡灌洗，灌洗時(shí)注意避免大氣道分泌物混入及灌洗液外滲，采用37℃無菌生理鹽水150 ml灌洗（分3～5次）并回收灌洗液，總回收率≥40%，將回收的灌洗液送細(xì)菌室培養(yǎng)。合格灌洗液標(biāo)本要求：灌洗液中紅細(xì)胞<10%，上皮細(xì)胞<5%;灌洗液中細(xì)胞分布均勻，形態(tài)完整、無變形。

1.2.2 DNA提取和細(xì)菌16S rDNA測(cè)序? 應(yīng)用MoBio Laboratories Inc公司的Power Soil DNA Isolation Kit進(jìn)行DNA提取，所有操作過程依照說明書執(zhí)行。DNA純度和質(zhì)量分別采用NanoDrop2000檢測(cè)及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

選用16S rDNA基因V3-V4可變區(qū)作為靶標(biāo)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用的通用引物如下：F341（5′-ACTCCTACGGGRSGCAGCAG-3′）、806R（5′-GGACTACHV-GGGTWTCTAAT-3′）。并在通用引物的5′端加上適合HiSeq2500 PE250測(cè)序的index序列和接頭序列。反應(yīng)體系（30 μl），PCR Master Mix 15Μl、Primer 3 μl、gDNA 10 μl、ddH2O 2 μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min、95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸45 s，以上執(zhí)行27個(gè)循環(huán)，并在72℃延伸10 min。純化擴(kuò)增結(jié)果并建立文庫，應(yīng)用MiSeq Reagent Kit V3（600cycles）進(jìn)行2×300bP 的雙端測(cè)序并對(duì)16S進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。AECOPD預(yù)后與呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)改變采用Pearson相關(guān)性分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

兩組患者的年齡、性別、病程、合并疾病等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 兩組患者的呼吸道菌群Alpha多樣性指數(shù)組間差異比較

兩組患者的呼吸道菌群Alpha多樣性指數(shù)比較，ACE及Chao指數(shù)死亡組顯著高于存活組（P>0.05），Shannon及Simpson指數(shù)兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 預(yù)后與呼吸道微生態(tài)系統(tǒng)改變的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果提示，ACE及Chao指數(shù)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.37、-0.52），見表3。

3 討論

慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）被慢性阻塞性肺疾病全球創(chuàng)議（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD）定義為臨床急性惡化呼吸癥狀、需額外治療的一個(gè)疾病階段。引起AECOPD的因素眾多，通常認(rèn)為感染是其主要病因，包括細(xì)菌、病毒感染或多種微生物混合感染[6-8]。目前常用的呼吸道感染病原體分離方式為呼吸道分泌物的病原體培養(yǎng)，且以細(xì)菌培養(yǎng)為主。但在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的陽性率較低。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，針對(duì)口腔、呼吸道、胃腸道等存在微生物定植部位的檢測(cè)，使人們了解到局部微生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及其功能特點(diǎn)[9-11]。

近年來，部分學(xué)者應(yīng)用基于16S rDNA 的微生物結(jié)構(gòu)分析方法了解到AECOPD患者肺部菌群分布與COPD穩(wěn)定期及健康同齡人比較具有顯著差異[12]，主要表現(xiàn)為病情惡化發(fā)生時(shí)，AECOPD患者呼吸道菌群多樣性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[13-14]。在對(duì)菌群種類的研究中，學(xué)者發(fā)現(xiàn)COPD患者肺部主要菌群以鏈球菌屬、普雷沃菌屬、葡萄球菌屬等為主[15-16]。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在AECOPD患者中，卡他莫拉菌比例較穩(wěn)定期患者顯著提高，而鏈球菌、葡萄球菌等其他菌群數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定。因此，了解AECOPD患者呼吸道微生態(tài)中菌群的豐富度及多樣性，能更好地了解其發(fā)病機(jī)制。

微生態(tài)系統(tǒng)多樣性指數(shù)是指物種多樣性測(cè)定，主要有三個(gè)空間尺度：α多樣性，β多樣性，γ多樣性[18-19]。每個(gè)空間尺度測(cè)定的數(shù)據(jù)也不盡相同。其中α多樣性主要關(guān)注局域均勻生境下的物種數(shù)目，因此也被稱為生境內(nèi)的多樣性。通過單樣本的α多樣性分析，通過一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性[20]。目前常用計(jì)算菌群豐度（community richness）的指數(shù)有ACE指數(shù)、Chao指數(shù)。Chao指數(shù)是評(píng)估一個(gè)樣本中OTU（operational taxonomic unit）數(shù)目多少，Chao指數(shù)越大，OTU數(shù)目越多，說明該樣本物種數(shù)比較多。ACE指數(shù)用來估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，該指數(shù)數(shù)值越大說明OTU數(shù)目越多。常用計(jì)算菌群多樣性（community diversity）的指數(shù)有Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。這兩個(gè)指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高。

本文主要研究AECOPD患者的呼吸道微生態(tài)Alpha多樣性指數(shù)，了解呼吸道微生物群落的豐度及多樣性。結(jié)果顯示，主要表示多樣性的Shannon及Simpson指數(shù)兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而死亡組的主要表示豐度的ACE及Chao指數(shù)顯著高于存活組（P>0.05），且與患者的預(yù)后呈線性相關(guān)。提示AECOPD發(fā)作時(shí)呼吸道微生態(tài)的豐度可能與其預(yù)后相關(guān)。但本文研究對(duì)象數(shù)量較少，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行修正。

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（收稿日期：2021-08-05）