王文萱 張云封 羅揚淦 廖晗婧 劉莉 張仕林 屠鵬飛 朱枝祥 李軍

血人參為豆科蝶形花亞科(Papilionoideae)木藍屬植物茸毛木藍IndigoferastachyodesLindl.的干燥根[1]，是貴州省少數民族特色苗藥。在《貴陽民間藥草》記載血人參具有“補血活血”的功效[2]；在《全國中草藥匯編》記載血人參具有“解表祛濕，止痛，止血”的功效，主治感冒咳嗽，頭痛，小兒痰哮，胃痛，黃疸，心絞痛，腰痛，子宮出血，乳癌初起，風濕性關節(jié)炎，疔瘡，毒蛇咬傷[3]。然而，目前對血人參的現代藥理學研究資料十分缺乏，中醫(yī)臨床中對血人參的利用受到嚴重制約。

本研究前期實驗從血人參中提取分離了大量黃酮類化合物，通過初步生物活性篩選，發(fā)現從血人參中分離出的化合物異甘草素對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導巨噬細胞釋放一氧化氮(nitric oxides, NO)具有很強的抑制作用，可能對巨噬細胞和中性粒細胞的活化及炎癥反應具有抑制作用。因此，本研究將利用LPS誘導小鼠巨噬細胞和原代中性粒細胞活化模型[4-5]，研究異甘草素的抗炎活性及其作用機制，以揭示血人參中發(fā)揮抗炎作用的有效成分及作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株和動物

小鼠巨噬細胞系RAW264.7，購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心。8～10周齡雄性C57BL/6小鼠，動物合格證號：1100112011044776，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 實驗試劑與儀器

血人參由貴州漢方藥業(yè)有限公司提供，經北京中醫(yī)藥大學李軍研究員鑒定為豆科蝶形花亞科木藍屬植物血人參真品；異甘草素由李軍課題組經硅膠、Sephadex LH-20柱色譜和半制備高效液相色譜技術分離純化，純度大于95%。

胎牛血清(貨號35-081-CV)、DMEM細胞培養(yǎng)基(貨號10-013-CVR)、0.25 %胰蛋白酶(貨號25-053-CI)、青霉素和鏈霉素混合液(貨號30-002-CI)購自美國Corning公司；細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(貨號 C009S)購自上海碧云天生物技術有限公司；Trizol試劑(貨號A33254)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；氯仿、異丙醇購自國藥集團化學試劑有限公司；一氧化氮檢測試劑盒(貨號BR45002)購自北京佰瑞達生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒(貨號AT301-02)和實時熒光定量PCR試劑盒(貨號AQ141-02)購自北京全式金生物技術有限公司；腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、巨噬細胞炎癥蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1, MIP-1α)、單核細胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)和干擾素-β(interferon-β, IFN-β)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)等基因的實時熒光定量PCR引物購自上海生工生物工程有限公司；小鼠TNF-α(貨號3511-1H-6)和IL-6(貨號3361-1H-6)的酶聯免疫吸附(enzyme linked immuno sorbed assay, ELISA)試劑盒購自瑞典Mabtech公司；小鼠MCP-1(貨號555260)的ELISA試劑盒購自美國BD公司；干擾素-β(interferon-β, IFN-β)(貨號DY8234-05)的ELISA試劑盒購自美國RD Systems公司。

超凈工作臺(型號SW-CJ-1FD)購自中國蘇州安泰空氣技術有限公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(型號MCO-18AIC)購自日本三洋公司；臺式低溫高速離心機(型號5424R)購自美國Eppendorf公司；實時熒光定量PCR儀(型號CFX96)購自美國Bio-Rad公司；多功能酶標儀(型號Enspire)購自美國PerkinElmer公司；化學發(fā)光成像儀(型號Amersham imager 680)購自美國通用電器公司。

1.3 異甘草素提取流程

血人參藥材(20 kg)干燥、粉碎后，依次用95%、70%、50%乙醇回流提取(每次溶劑120 L，回流2小時)，過濾，合并濾液，減壓濃縮得到總浸膏(3.2 kg)?？偨嘤?0%甲醇-水分散后，依次用正己烷、乙酸乙酯萃取，得到正己烷部位(20.2 g)、乙酸乙酯部位(945.4 g)和水部位(1628.0 g)。乙酸乙酯萃取部位(420 g)經硅膠(200～300目)柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(1∶0→0∶1)梯度洗脫，TLC檢測，合并得到10個流分(Fr. A- Fr. J)。Fr. B(8.57 g)經硅膠柱色譜分離，正己烷-乙酸乙酯(1∶0→0∶1)梯度洗脫得到11個流分(Fr. B1～Fr. B11)。Fr. B9(0.73 g)經Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脫得到9個流分(Fr. B9a～Fr. B9i)。Fr. B9i(65.6 mg)經半制備液相[乙腈-水(35∶65)]分離純化得到化合物異甘草素(41.4 mg，tR= 24分鐘)。

1.4 細胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細胞系RAW264.7，利用含10 %的胎牛血清、100 U/mL氨芐青霉素和100 μg/mL鏈酶素的DMEM高糖培養(yǎng)基在5 %的CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。

1.5 MTT法檢測血人參中異甘草素對巨噬細胞的細胞毒

取對數生長期RAW264.7細胞，調整細胞濃度到4×105/mL，接種細胞到96孔組織培養(yǎng)板中，100 μL/孔，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時；利用二甲基亞砜將異甘草素配制為20 mmol/L的儲備液，然后利用培養(yǎng)基進行梯度稀釋，將100 μL化合物溶液加入到給藥孔中，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時；然后從各孔中吸棄100 μL的細胞培養(yǎng)上清，在剩余細胞培養(yǎng)基中，加入MTT檢測液25 μL，至MTT終濃度0.5 mmol濃度，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時；再加入三聯液125 μL，室溫放置過夜，檢測570 nm吸光度(A)，計算化合物異甘草素對RAW264.7細胞的生長抑制率。

細胞生長抑制率 =(A對照組- A給藥組)/A對照組× 100%

1.6 Griess法檢測血人參中異甘草素對LPS誘導巨噬細胞分泌NO的影響

按照1.5所述的方法將細胞接種到96孔板里，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時；然后將異甘草素加入到給藥孔中，50 μL/孔，至終濃度為5、10、20、40 μmol/L，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)0.5小時，再在模型孔和給藥孔中加入50 μL的LPS至終濃度1 μg/mL，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。利用Griess法測定細胞培養(yǎng)上清中的NO代謝產物亞硝酸鹽的濃度，以定量測定巨噬細胞釋放的NO。具體方法如下，取出96孔板，每孔吸取50 μL上清到新的96孔板中，然后分別加入50 μL的R1試劑和R2試劑，室溫反應5分鐘后在540 nm處測得吸光度，根據標準曲線計算出樣品中的NO濃度。

1.7 實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)檢測血人參中異甘草素對LPS誘導巨噬細胞炎癥因子mRNA轉錄的影響

取對數生長期的RAW264.7細胞，調整細胞濃度為5×105/mL，接種到6孔板中，2 mL/孔，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時至細胞完全貼壁后，將異甘草素加入到給藥孔中，至終濃度為5、10、20、40 μmol。培養(yǎng)1小時后，將LPS加入到模型孔和給藥孔至終濃度1 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)6小時后，將上清棄去，底層的細胞加1 mL 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)制成細胞懸液，轉移到離心管中，離心得到沉淀，利用Trizol試劑裂解細胞，然后利用氯仿、異丙醇和乙醇提取細胞總RNA。

cDNA的制備：以提取的細胞總RNA為模板，按逆轉錄試劑盒說明操作進行反轉錄反應，制備cDNA。反應條件：42℃，30分鐘，85℃，10秒，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

qRT-PCR檢測：具體操作參照全式金實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作。PCR反應條件為：95℃預變性1分鐘，然后進行95℃，5秒，60℃，40秒的循環(huán)反應，擴增40個循環(huán)，并通過熔解曲線確證擴增反應的特異性。最后利用各基因循環(huán)數和參照基因GAPDH的循環(huán)數計算相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR所用引物序列

1.8 ELISA法檢測血人參中異甘草素對LPS誘導巨噬細胞分泌炎癥因子的影響

按照1.6細胞培養(yǎng)的方法給藥刺激后，繼續(xù)培養(yǎng)12小時后，收集細胞上清用于ELISA測定。

按ELISA試劑盒說明書，利用PBS將包被抗體稀釋后，加入到高吸附可拆卸96孔板中，100 μL/孔，4℃包被20小時，棄去包被液，利用PBS清洗3次；再加入封閉液室溫封閉4小時，利用PBS清洗3次。然后根據預實驗將收集到的細胞上清稀釋一定倍數后，加入到包被各種因子抗體的96孔板中，另外在標準品孔加入系列濃度的標準品，均為100 μL/孔，室溫孵育2小時后，利用含0.1 % 吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗板3次。再加入檢測抗體溶液，100 μL/孔，室溫孵育1小時后按上述方法洗板。然后加入辣根過氧化物酶標記的鏈酶親和素溶液，100 μL/孔，室溫孵育0.5小時后按上述方法洗板。然后加入TMB單組份顯色液，100 μL/孔，室溫反應10分鐘，最后加入10%的磷酸水溶液終止顯色反應。在450 nm波長測定吸光度值，根據標準曲線計算各組細胞上清中各種炎癥因子的濃度。

1.9 流式細胞術分析血人參中異甘草素對LPS誘導中性粒細胞活化的影響

通過頸椎脫臼將自由飲食適應性飼養(yǎng)1周的C57BL/6小鼠處死，無菌取股骨骨髓細胞，裂解紅細胞后，利用含2 % FBS的IMDM培養(yǎng)基清洗并重懸骨髓細胞，加入DHR123至終濃度1 μmol，并調整細胞濃度至2.5×106/mL，將細胞接種到48孔板中，5×105/孔。在給藥孔中加入100 μL系列濃度異甘草素，37℃培養(yǎng)箱孵育15分鐘，然后加入100 μL的LPS至以下濃度，37℃培養(yǎng)箱孵育3小時；收集細胞，離心去上清，利用200 μL含0.2 %牛血清白蛋白的PBS重懸細胞，再加入50 μL的APC標記大鼠抗小鼠Ly6G抗體和PE標記大鼠抗小鼠CD11b抗體混合液，冰浴30分鐘，然后利用含0.2 %牛血清白蛋白的PBS清洗并重懸細胞，最后完成流式細胞測定，利用FlowJo分析Ly6G+中性粒細胞DHR123和CD11b的平均熒光強度。

1.10 Western Blot法分析血人參中異甘草素對LPS誘導巨噬細胞信號通路活化的調節(jié)作用

按照1.9所述方法鋪板給藥，分別在刺激30分鐘和3小時后收集細胞。利用RIPA細胞裂解液冰浴裂解細胞，4℃、12 000 g離心10分鐘，取上清液制備蛋白電泳樣本。然后經過聚丙烯酰胺蛋白電泳分離蛋白，再利用電轉將蛋白轉移到PVDF膜上；利用磷酸鹽緩沖溶液(tris buffered saline, TBS)緩沖液配制的5 %脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1小時，然后加入5 %脫脂牛奶配制的一抗4℃孵育過夜，利用含0.1 % 吐溫20的TBS洗膜3次；然后加入含0.1 % 吐溫20的TBS配制的二抗室溫孵育2小時，再利用含0.1 % 吐溫20的TBS洗膜3次；最后利用化學發(fā)光檢測儀器進行曝光分析。利用Quantity One 軟件定量分析蛋白條帶。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 血人參中異甘草素對巨噬細胞的細胞毒性

首先，本研究利用MTT測定方法分析了異甘草素對巨噬細胞的細胞毒性。結果顯示，與對照組相比，異甘草素在80 μmol/L濃度對巨噬細胞存活有輕度的抑制作用，在40 μmol/L及其以下濃度無抑制作用，這表明該化合物在40 μmol/L以下濃度對巨噬細胞無顯著細胞毒。見表2。

表 2 異甘草素對巨噬細胞的細胞毒性

2.2 血人參中異甘草素對LPS誘導巨噬細胞釋放NO的影響

在完成異甘草素對巨噬細胞的細胞毒測定后，本研究進一步測定了其在無細胞毒劑量下對LPS誘導巨噬細胞釋放NO的調節(jié)作用。結果顯示，與對照組相比，LPS模型組能夠顯著刺激巨噬細胞釋放NO; 與模型組相比，異甘草素各劑量組均能顯著抑制LPS誘導巨噬細胞釋放NO。見表3。

表3 異甘草素對LPS誘導巨噬細胞釋放NO的影響

2.3 血人參中異甘草素對LPS誘導巨噬細胞炎癥因子mRNA轉錄的影響

巨噬細胞表達和分泌的炎癥因子在促進炎癥反應發(fā)生中發(fā)揮重要作用，本研究利用qRT-PCR分析了異甘草素對LPS誘導巨噬細胞炎癥因子mRNA轉錄的影響。結果顯示LPS刺激能夠顯著增加巨噬細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、MIP-1α、MCP-1和IFN-β的mRNA轉錄，異甘草素能夠劑量依賴性地抑制LPS誘導的炎癥因子轉錄，特別是對IL-6、MCP-1和IFN-β的轉錄具有很強的抑制作用。見表4、表5。

表4 異甘草素對LPS誘導巨噬細胞炎癥因子mRNA轉錄的影響

表5 異甘草素對LPS誘導巨噬細胞炎癥因子mRNA轉錄的影響

2.4 血人參中異甘草素對LPS誘導巨噬細胞分泌炎癥因子的影響

在通過實時熒光定量PCR測定發(fā)現異甘草素對巨噬細胞炎癥因子轉錄的抑制作用之后，本研究繼續(xù)利用ELISA測定研究異甘草素對巨噬細胞分泌的部分炎癥因子的影響。結果顯示LPS刺激能夠顯著增加巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6、MCP-1和IFN-β，異甘草素能夠呈劑量依賴性抑制MCP-1和IFN-β的分泌。綜合qRT-PCR和ELISA的結果，異甘草素能夠呈劑量依賴性抑制炎癥因子的表達和分泌，特別是對MCP-1和IFN-β的表達和分泌具有很強的抑制作用。見表6。

表6 異甘草素對LPS誘導巨噬細胞分泌炎癥因子的影響

2.5 人參中異甘草素對LPS誘導中性粒細胞活化的影響

在發(fā)現異甘草素對巨噬細胞炎癥因子轉錄和分泌的抑制作用之后，本研究繼續(xù)利用流式細胞測定研究異甘草素對中性粒細胞活化的影響。結果顯示LPS刺激能夠顯著增加中性粒細胞釋放活性氧，同時能促進中性粒細胞表面粘附分子CD11b的上調。異甘草素能夠呈劑量依賴性抑制中性粒細胞釋放活性氧，但是不能抑制CD11b的上調。見表7。

表7 異甘草素對LPS誘導中性粒細胞活化的影響

2.6 血人參中異甘草素對LPS誘導小鼠巨噬細胞信號通路活化的調節(jié)作用

LPS刺激巨噬細胞0.5小時后，NF-κB通路中P65蛋白發(fā)生顯著的磷酸化修飾，MAPKs通路中P38、ERK1/2和JNK1/2也發(fā)生了顯著的磷酸化修飾。LPS刺激巨噬細胞3小時后，IRFs通路中IRF3以及STATs通路中的STAT1和STAT3也發(fā)生了顯著的磷酸化修飾。異甘草素能夠顯著抑制ERK1/2、JNK1/2和STAT1的磷酸化修飾，特別是對JNK1/2的磷酸化修飾具有很強的抑制作用。見圖1、圖2，表8、表9。

圖1 異甘草素對巨噬細胞信號通路活化的調節(jié)作用(0.5小時)

圖2 異甘草素對巨噬細胞信號通路活化的調節(jié)作用(3小時)

表8 異甘草素對LPS誘導巨噬細胞信號通路活化的調節(jié)作用

表9 異甘草素對巨噬細胞信號通路活化的調節(jié)作用

3 討論

巨噬細胞和中性粒細胞是兩種重要的天然免疫細胞，具有很強的病原識別、吞噬和清除功能。在炎癥性疾病的發(fā)病過程中，巨噬細胞活化后，NF-κB和STAT1信號通路會被激活，進而導致NO合酶的增加，NO釋放量增加。NO不僅能夠殺傷侵入機體的微生物，同樣也會加重體內的炎癥反應。同時，巨噬細胞分泌的炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β直接激活巨噬細胞和中性粒細胞，趨化因子MIP-1α和MCP-1趨化中性粒細胞至炎癥部位，加重體內的炎癥反應[6]。并且巨噬細胞分泌的IFN-β也能夠激活STAT1信號通路增強T細胞介導的細胞免疫反應，加重自身免疫性疾病的發(fā)展[7]。

中性粒細胞在炎癥性疾病發(fā)病過程中同樣發(fā)揮著重要作用[8]。在各種內外源致炎因子刺激下，中性粒細胞表面使細胞停駐在免疫器官的粘附分子CD62L會被內吞，同時使細胞進入炎癥部位的粘附分子CD11b會上調，從而促使中性粒細胞由免疫器官進入炎癥部位。炎癥部位的中性粒細胞內NADPH氧化酶會被激活，合成大量超氧化物。超氧化物不僅會殺傷病原體，同時在炎癥性疾病中也會導致嚴重的組織損傷[9]。在病理條件下，體內的活性氧產生和清除失衡，造成活性氧對機體的損傷。

血人參是貴州少數民族的特色苗藥，具有清熱解表、化痰、利濕、活血止痛之功效，在當地具有廣泛的使用價值。然而，現代藥理學對血人參的研究多集中在血人參提取物對肝損傷的體內研究[10-11]，對于其在抗炎方面研究較少[12]，其發(fā)揮抗炎藥效的重要藥效物質并不十分清楚。本研究在前期活性篩選時發(fā)現從血人參中提取分離的異甘草素具有顯著的抗炎活性[13-14]，這可能是其發(fā)揮藥效的關鍵物質。因此本實驗采用LPS誘導巨噬細胞和中性粒細胞活化模型，對異甘草素的抗炎作用進行分析。研究發(fā)現異甘草素能夠抑制巨噬細胞釋放NO和炎癥因子的分泌，并且能夠抑制中性粒細胞釋放活性氧，這可能與異甘草素抑制JNK1/2、ERK1/2和STAT1的磷酸化有關。相對已有的研究，本研究通過體外實驗更明確地闡明了異甘草素的抗炎作用及機制，這可能是血人參發(fā)揮藥效的重要藥效物質，但是對異甘草素發(fā)揮抗炎作用的藥物靶點仍不清楚，在后續(xù)的研究中還需在此方面做出進一步探索。