張秋娥 潘雅婧 張程斐 趙丹 吳麗麗 秦靈靈 劉銅華

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是由于多因子功能紊亂導(dǎo)致的一種器官特異性自身免疫性疾病，其臨床診斷通過血清甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)和抗甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulin antibodies，TgAb)的陽性表達(dá)以確診[1]。目前遺傳易感性、環(huán)境因素、營養(yǎng)因素和免疫紊亂是公認(rèn)的導(dǎo)致AIT發(fā)生的重要因素[2-3]，但其病因未完全闡明，尚無針對病因的治療手段。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路長期以來被認(rèn)為是細(xì)胞代謝、生長、存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，mTOR是細(xì)胞內(nèi)自噬的主要抑制因子，它受到PI3K/Akt通路的正調(diào)節(jié)。臨床研究通過提取橋本甲狀腺炎患者甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白減少。甲狀腺濾泡細(xì)胞自噬參與了橋本甲狀腺炎的發(fā)展[4]，激活PI3K/Akt/mTOR信號通路使AIT的癥狀加重[5-6]。因此，研究組推測甲炎康泰可能作用于PI3K/Akt/mTOR信號通路，參與了對細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用來改善AIT病情。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級Lewis大鼠30只，6周齡，雌性，體質(zhì)量115～145 g。購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

甲炎康泰組方：柴胡10 g、郁金20 g、夏枯草30 g、穿山龍10 g、浙貝母15 g、玄參10 g、山慈菇6 g、黃芪30 g、烏梅15 g。甲炎康泰顆粒劑購于北京康仁堂藥業(yè)有限公司，溶于去離子水，置于4℃冰箱儲存。參考課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)給藥劑量2.834 g/kg[7]。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

碘化鈉(瑪雅試劑有限公司產(chǎn)品，批號：MA-YA-CR-2831)，豬甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin from Porcine thyroid gland，PTg)(美國Sigma公司，批號：#018K7012)，弗氏不完全佐劑(Incomplete Freunds Adjuvant，IFA)(美國Sigma公司，批號：#SLCB8702)，弗氏完全佐劑(Complete Freunds Adjuvant，CFA)(美國Sigma公司，批號：#SLCF1289)，TPO-Ab Elisa kit(CUSABIO，批號：CO331050347)，Trizol(美國Ambion公司)，異丙醇(北京化工廠)，PCR試劑盒(南京維諾贊生物科技股份有限公司)，BASO脫蠟劑(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：C210702)，無水乙醇(北京化工廠)，伊紅(美國Sigma公司)，PI3KCA(proteintech公司，貨號：20583-I-AP)，Anti-Akt1 (phospho S473)(Abcam公司，批號：GR150067-1)，Phospho-mTOR (Ser2448)(CST公司)，蘇木精染色液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號：C1411)，羊血清工作液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：2109D0617)，DAB顯色試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：20A1CB1072)，中性樹膠(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。GAPDH、PI3K、Akt、mTOR基因的PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)、合成(引物序列及引物長度見表1)。

乳化劑的配制：實(shí)驗(yàn)時(shí)將1 mg PTg溶于1L PBS得到0.1% PTg溶液，再按等體積比例將該溶液與CFA研磨混合成乳劑得到終濃度0.05% PTg-CFA乳劑；同法配制0.05% PTg-IFA乳劑。碘化鈉水溶液的配制：100 mL去離子水中加入64 mg NaI，配制成0.064% NaI溶液。

以上試劑現(xiàn)用現(xiàn)配，碘化鈉水溶液注意避光。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

臺式高速冷凍離心機(jī)(德國SIGMA公司，3K15)；Thermo labsystem MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；OLYMPUS BH-2光鏡(日本奧林巴斯公司)；全自動新型電熱培養(yǎng)箱(上海智誠分析儀器制造有限公司)；其他手術(shù)相關(guān)器械。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動物分組與造模 建立AIT模型[8]：根據(jù)體質(zhì)量，采用區(qū)組隨機(jī)法選取10只Lewis大鼠為正常對照組，其余為造模組。第一周適應(yīng)性喂養(yǎng)正常進(jìn)食飲水，第二周開始AIT造模，造模組Lewis大鼠自由飲用0.064% NaI溶液，正常對照組Lewis大鼠自由飲水。第3周造模組Lewis大鼠行初次免疫：每次在每只Lewis大鼠雙側(cè)腹股溝皮下、背部皮下、頸部皮下多點(diǎn)注射PTg-CFA乳劑0.2 mL，此周皮下注射2次，間隔三天。加強(qiáng)免疫：第4～8周配制PTg-IFA乳劑進(jìn)行每周1次的皮下多點(diǎn)注射。造模成功驗(yàn)證方法：采集大鼠眶靜脈血，Elisa法檢測大鼠血清中TPOAb抗體水平。

1.5.2 給藥方法 造模結(jié)束后，根據(jù)TPOAb濃度，將成模大鼠隨機(jī)分為模型組與甲炎康泰組，每組10只，第8周開始給藥。甲炎康泰組大鼠給予甲炎康泰水溶液灌胃，其余組予等體積去離子水灌胃，灌藥體積為1 mL/100 mg，每日一次。連續(xù)給藥8周。

1.5.3 取材方法 各組大鼠灌胃干預(yù)8周后，禁食12小時(shí)，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)，麻醉后行腹主動脈取血，負(fù)壓真空采血管采集外周血，室溫靜置后離心(4℃，3 000r/min)10分鐘，吸取上清，-80℃冰箱超低溫保存，用于后續(xù)血清指標(biāo)檢測(本實(shí)驗(yàn)中每組取6只大鼠血清進(jìn)行Elisa檢測)；每組取6只大鼠的甲狀腺組織用于后續(xù)蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色以及免疫組織化學(xué)檢測，另一側(cè)甲狀腺組織進(jìn)行PCR檢測(因RNA純度問題，最終本實(shí)驗(yàn)中用4只)。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 血清抗體檢測 Elisa法檢測大鼠外周血清中TPOAb抗體水平。按說明書：酶標(biāo)板加10 μL標(biāo)準(zhǔn)品、樣品，另設(shè)空白孔，加一抗50 μL(空白孔不加)，37℃恒溫培養(yǎng)箱1小時(shí)，wash buffer洗板后加入二抗50 μL，37℃恒溫培養(yǎng)箱30分鐘，洗板完畢加顯色液避光顯色15分鐘，酶標(biāo)儀讀取OD值，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TPOAb濃度。

1.6.2 病理變化觀察 取甲狀腺組織，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，自來水低速沖洗，蘇木精染色5分鐘，加0.5%的鹽酸，加入0.5%的氨水回藍(lán)30秒，伊紅溶液染色2分鐘，乙醇梯度處理，二甲苯浸泡，封片，鏡下觀察病理變化。

1.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR) 采用逆轉(zhuǎn)錄定量PCR方法檢測甲狀腺組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達(dá)。Trizol法提取甲狀腺組織RNA后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，根據(jù)說明書，以37℃，15分鐘；85℃，5秒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)體系：10 μL SYBR qPCR Master Mix，0.04 μL上引，1 μL下引，2μL cDNA稀釋液，7.92 μL dH2O。PCR擴(kuò)增依據(jù)廠商說明書條件：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，退火60℃延伸30秒，循環(huán)反應(yīng)40次，95℃，15秒，60℃持續(xù)60秒，采集溶解曲線，最后統(tǒng)計(jì)Ct值，結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，正常組樣本為對照，采用2-△△Ct相對定量法比較各組目標(biāo)mRNA的表達(dá)差異。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.6.4 免疫組織化學(xué)分析 甲狀腺組織石蠟包埋切片后脫蠟復(fù)水，Trition、3%H2O2處理，檸檬酸鹽溶液高溫抗原修復(fù)，山羊血清封閉，滴加一抗4℃，12小時(shí)后復(fù)溫PBS沖洗，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精染色，自來水低速沖洗，酒精梯度脫水，BASO脫蠟劑浸泡，滴加中性樹膠封片。鏡下拍照分析，運(yùn)用Image-Pro Plus6.0，Media Cybernetics系統(tǒng)進(jìn)行吸光度檢測，分析PI3K、P-Akt、P-mTOR的平均光密度(IOD/Area)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠外周血中TPOAb濃度測定

與正常組大鼠比較，模型組大鼠外周血TPOAb滴度值均升高(P<0.05)。與模型組相比，甲炎康泰組TPOAb滴度值降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TPOAb含量比較

2.2 各組大鼠甲狀腺病理觀察

200倍鏡下可見正常組大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞排列整齊，濾泡圓形完整，濾泡腔內(nèi)膠質(zhì)豐富，未見淋巴細(xì)胞等浸潤；與正常組對比，模型組AIT大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞可見明顯破壞，濾泡部分萎縮甚至消失，濾泡腔內(nèi)膠質(zhì)減少，濾泡間隙可見明顯浸潤淋巴細(xì)胞；甲炎康泰組大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞較完整，濾泡形態(tài)較規(guī)則，鏡下可見膠質(zhì)略少，甲狀腺濾泡細(xì)胞間偶見淋巴細(xì)胞浸潤，與模型組比較普遍輕微。見圖1。

注: A 正常組；B 模型組；C 甲炎康泰組。

2.3 各組大鼠甲狀腺組織中PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達(dá)情況

模型組大鼠甲狀腺組織PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達(dá)較正常組顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，甲炎康泰組PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠甲狀腺組織PI3K、Akt、mTOR的mRNA表達(dá)情況比較

2.4 各組大鼠甲狀腺組織中PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表達(dá)情況

400倍鏡下可見各組大鼠甲狀腺組織PI3K、P-Akt、P-mTOR免疫陽性物呈棕色，計(jì)算并統(tǒng)計(jì)平均光密度值，正常組大鼠甲狀腺組織內(nèi)有較少PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表達(dá)，模型組大鼠PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白均為陽性表達(dá)。與模型組比較，甲炎康泰組PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，見表4，圖2、3、4。

表4 各組大鼠甲狀腺組織PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表達(dá)比較

注: A 正常組；B 模型組；C 甲炎康泰組。

注: A 正常組；B 模型組；C 甲炎康泰組。

注: A 正常組；B 模型組；C 甲炎康泰組。

3 討論

AIT是一種常見的器官特異性自體免疫性疾病，起病隱匿,病程較長,病情反復(fù)，常合并其他自身免疫性疾病[9-11]，可引起女性不孕、流產(chǎn)[12]、脫發(fā)[13]等。除了軀體并發(fā)癥，患者也可能出現(xiàn)精神障礙，如抑郁癥、焦慮癥[14]等。AIT遷延不愈，可導(dǎo)致甲亢反復(fù)發(fā)生，可并發(fā)甲狀腺結(jié)節(jié)，最終導(dǎo)致甲狀腺功能減退而不得不采用替代治療[1]。AIT發(fā)病主要是自身免疫耐受被破壞的結(jié)果，細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，特異性地影響特定組織[15-17]，其中T淋巴細(xì)胞直接破壞甲狀腺組織，導(dǎo)致一系列連鎖反應(yīng)，其分泌的細(xì)胞因子等可通過觸發(fā)和增強(qiáng)免疫應(yīng)答及炎性反應(yīng)而加劇AIT病變[15]。

PI3K/Akt/mTOR信號通路作為自噬的經(jīng)典途徑，已被證明在AIT的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[6,18-20]，此通路是由一系列不同的反應(yīng)通過特定的受體激活的生長因子(包括激素、細(xì)胞因子和趨化因子)通過各種機(jī)制激活PI3K。PI3K啟動磷酸肌醇-3激酶調(diào)控通路，特異性結(jié)合Akt和磷酸肌醇依賴的蛋白激酶1(phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)，促進(jìn)PDK1對Akt磷酸化和激活[21]，Akt間接激活mTOR，當(dāng)TSC2在Ser939被激活的Akt磷酸化時(shí)，它從TSC1分離出來[22]，導(dǎo)致mTORC1的激活，mTORC1直接磷酸化下游底物，抑制自噬[23]。自噬是一種保守的細(xì)胞過程，涉及自噬體的形成，自噬體包裹著細(xì)胞質(zhì)貨物，包括長壽命蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)聚集體和細(xì)胞器，并將這些貨物輸送到溶酶體進(jìn)行降解[24]。最新研究已經(jīng)證明了自噬在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中的重要作用[24-26]。T細(xì)胞在胸腺從分化到成熟、在外周的存活和其功能受到自噬水平的影響[26]。此外，自噬的誘導(dǎo)促進(jìn)了抗原肽遞送到主要組織相容性復(fù)合物II類負(fù)載區(qū)，并隨后表達(dá)到CD4+T細(xì)胞[27-28]。自噬過程參與了自身免疫和炎性疾病的發(fā)展，對免疫和炎癥的有益和有害影響起到了平衡作用[29]。T細(xì)胞消融引起嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng)，與mTOR激活和代謝重編程有關(guān)，這些激活引起外周T細(xì)胞的自發(fā)激活和加速分化，藥物性mTOR抑制劑對T細(xì)胞缺陷和免疫調(diào)節(jié)障礙有積極作用[30]。

AIT可歸屬于中醫(yī)“癭病”“癭瘤”等范疇，中醫(yī)藥特色治療在AIT的治療方面有著獨(dú)特優(yōu)勢[31]。甲炎康泰(專利號CN106421633A)由柴胡、郁金、夏枯草、穿山龍、浙貝母、玄參、山慈菇、黃芪、烏梅組方而成，是劉銅華教授在多年臨床治療中不斷總結(jié)而成的療效明確的經(jīng)驗(yàn)方。本病誘因主要為情志失調(diào)，致肝郁氣滯。肝郁犯脾，脾虛痰積，氣滯、痰結(jié)瘀阻于頸前，日久因?qū)嵵绿?，傷陰耗氣，損及陰陽。因此，甲炎康泰全方功以疏肝理氣，可達(dá)到消痰散結(jié)化瘀的治療目的[32]。

前期研究顯示，甲炎康泰能降低Th17/Treg比例，下調(diào)血清白介素(interleukin，IL)-6、IL-17A、IL-23p19、轉(zhuǎn)化生長因子-β1等Th17相關(guān)細(xì)胞因子分泌，上調(diào)血清IL-2、IL-10等Treg相關(guān)細(xì)胞因子分泌[33]，糾正Th1/Th2失衡[34]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，甲炎康泰組大鼠外周血TPOAb滴度降低，給藥甲炎康泰干預(yù)后甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤減輕，一定程度上緩解了AIT病情。相比模型組，甲炎康泰組甲狀腺組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA相對表達(dá)量明顯下降，PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表達(dá)量明顯下降。因此，甲炎康泰可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進(jìn)細(xì)胞自噬，來維持T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)，延緩AIT發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，甲炎康泰治療AIT可能與其能夠抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)僅初步驗(yàn)證了甲炎康泰對于PI3K/Akt/mTOR信號通路的調(diào)節(jié)作用，下游靶蛋白等尚未進(jìn)行驗(yàn)證，與其他信號通路是否有協(xié)同作用，也有待更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。