鹽度對(duì)重金屬鎘的毒性影響:以太平洋牡蠣為例

王智宇, 姜愛(ài)莉, 吉成龍, 吳惠豐,*

1. 煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,煙臺(tái) 264005

2. 中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所,中國(guó)科學(xué)院海岸帶環(huán)境過(guò)程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東省海岸帶環(huán)境過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,煙臺(tái) 264003

鎘(cadmium, Cd)是我國(guó)近岸海域典型的重金屬污染物,海水中較低濃度的Cd 即可被水生生物富集[1],并通過(guò)食物鏈放大,誘導(dǎo)毒性效應(yīng)[2]。 近年來(lái),隨著我國(guó)生態(tài)文明建設(shè)的不斷推進(jìn),全國(guó)總體上Cd直排入海量呈現(xiàn)下降趨勢(shì),但Cd 難以從環(huán)境中清除,仍是我國(guó)近岸海域主要的污染物之一。 據(jù)報(bào)道,錦州灣海水中最高Cd 含量達(dá)5 μg·L-1[3],超國(guó)家第Ⅰ類(lèi)海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB 3097—1997)[4]。 海洋生物是海水污染的直接受害者,山東煙臺(tái)附近海域太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)體內(nèi)Cd 含量最高可達(dá)5.69 μg·g-1(濕質(zhì)量)[5],超國(guó)家第Ⅲ類(lèi)海洋生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB 18421—2001)[6]。

離子穩(wěn)態(tài)在生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用,但有關(guān)Cd 引起海洋生物離子穩(wěn)態(tài)變化的研究鮮有報(bào)道。 研究表明,Cd 可置換超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)等抗氧化酶活性中心的必需金屬元素導(dǎo)致錳(Mn)和鋅(Zn)等離子平衡失調(diào)[7-8],并影響蛋白分子的結(jié)構(gòu)和功能,進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[9]。 此外,Cd具有親巰基(—SH)的特性[10],可通過(guò)結(jié)合—SH 抑制鈉鉀ATP 酶(Na+, K+-ATPase, NKA)活性[11],干擾鈉離子(Na+)和鉀離子(K+)的轉(zhuǎn)運(yùn)。 線粒體內(nèi)也富含具有—SH 的蛋白,Cd 可導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈功能受損,誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS),進(jìn)而導(dǎo)致線粒體及細(xì)胞損傷[12]。 能量動(dòng)態(tài)平衡在海洋生物應(yīng)對(duì)污染物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用,是氧化應(yīng)激和離子穩(wěn)態(tài)等多種生命活動(dòng)的重要基礎(chǔ)[13]。 Cd 不僅造成能量代謝的主要場(chǎng)所線粒體的損傷,也影響機(jī)體的能量代謝過(guò)程。 Bao等[14]發(fā)現(xiàn),Cd 可誘導(dǎo)泥蚶(Tegillarca granosa)鰓中產(chǎn)生與能量代謝相關(guān)的差異表達(dá)蛋白(異檸檬酸脫氫酶(isocitric dehydrogenase, IDH)等)。 我們之前的研究結(jié)果表明,海洋雙殼貝類(lèi)體內(nèi)三羧酸(TCA)循環(huán)、糖酵解以及氨基酸的代謝和合成等關(guān)鍵代謝途徑均受Cd 暴露的影響[15-16]。

盡管?chē)?guó)內(nèi)外已圍繞Cd 對(duì)海洋生物的毒性開(kāi)展了大量研究,但環(huán)境因子(如鹽度)對(duì)Cd 毒性影響的報(bào)道相對(duì)較少。 研究表明,鹽度變化可改變Cd 在水體中的賦存形態(tài)和生物可利用性[17]。 Sun 等[18]發(fā)現(xiàn)在相同Cd 暴露濃度下,鹽度為13 psu 和34 psu時(shí)太平洋牡蠣(C. gigas)消化腺中Cd 含量分別為13.27 μg·g-1和 7.37 μg·g-1(干質(zhì)量),表明低鹽顯著提高牡蠣消化腺對(duì)Cd 的富集,進(jìn)而加劇Cd 的毒性效應(yīng)。 受潮汐周期、氣候變化以及淡水匯入等因素的影響,近岸海域的海水鹽度低于正常海水鹽度,而Cd 污染也常發(fā)生在這一區(qū)域,因此有必要深入研究低鹽對(duì)Cd 毒性效應(yīng)的影響。

生物標(biāo)志物是指生物體遭受環(huán)境脅迫時(shí)在組織、細(xì)胞和分子等不同生物學(xué)水平上表現(xiàn)出異常變化的信號(hào)指標(biāo),可對(duì)應(yīng)激傷害提供預(yù)警。 綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)(integrated biomarker response, IBR)法通過(guò)將各類(lèi)生物標(biāo)志物統(tǒng)一量化,可直觀地體現(xiàn)環(huán)境脅迫對(duì)生物體造成的影響,目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水生生物毒性效應(yīng)的研究[19]。 太平洋牡蠣(C. gigas)廣泛分布于我國(guó)北方近岸海域,部分牡蠣生活在河口等低鹽環(huán)境中,營(yíng)固著和濾食性生活方式,對(duì)污染物具有較強(qiáng)的富集能力,是一種理想的海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)生物[20]。 因此,本研究以太平洋牡蠣(C. gigas)為受試生物,在實(shí)驗(yàn)室模擬低鹽和Cd 脅迫條件,通過(guò)測(cè)定Cd 和必需金屬元素含量以及氧化應(yīng)激、能量代謝和滲透調(diào)節(jié)等相關(guān)生物指標(biāo),探究低鹽對(duì)Cd毒性效應(yīng)的影響,并運(yùn)用IBR 法評(píng)估Cd 和低鹽單一和復(fù)合脅迫的毒性差異,以期為近岸Cd 污染的研究及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 暴露實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用牡蠣采自崆峒島(中國(guó)煙臺(tái)),低溫快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,經(jīng)過(guò)濾海水洗凈后,挑選140個(gè)殼形完整且大小相近的個(gè)體(殼長(zhǎng):(5.7±0.7) cm,殼寬:(3.2±0.5) cm,殼厚:(1.5±0.3) cm),在正常鹽度(31.4 psu)海水中暫養(yǎng)3 d。 然后將牡蠣隨機(jī)分成2 組,其中一組在正常鹽度條件下馴化7 d;另一組以3.1 psu·d-1的速率將水體鹽度降至15.7 psu,之后在低鹽度(15.7 psu)海水中繼續(xù)馴化2 d,以使牡蠣適應(yīng)低鹽環(huán)境。 本研究中低鹽度(15.7 psu)參考前期調(diào)研的萊州灣主要河口的平均鹽度(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。 在2個(gè)鹽度條件下均設(shè)置對(duì)照組和Cd 暴露組(表1)。 利用水合氯化鎘(CdCl2·2.5H2O) (上海麥克林生化科技有限公司,純度99.99%)制備Cd 暴露液,暴露濃度設(shè)置為 5、20、80 和 240 μg·L-1,其中 5 μg·L-1和 20 μg·L-1為環(huán)境相關(guān)濃度[21]。 每組有 14 只牡蠣,養(yǎng)殖水體為20 L。 暫養(yǎng)、馴化和暴露期間,實(shí)驗(yàn)條件為溫度(17.1±1.6) ℃,溶解氧含量(7.6±1.2) mg·L-1,pH(8.0±0.1),自然光照 12 h·d-1,持續(xù)曝氣。 每日按牡蠣組織干質(zhì)量的2%喂食小球藻(Chlorella vulgaris),進(jìn)食2 h 后換水。 取樣前一日停止投喂餌料。 暴露7 d 后,將牡蠣置于冰上解剖,取鰓組織,用中性濾紙快速吸干組織表面水分,置于液氮中速凍后,存于-80 ℃冰箱。

表1 Cd 暴露實(shí)驗(yàn)設(shè)置Table 1 The treatments of Cd exposure

1.2 Cd 和必需金屬元素的含量測(cè)定

稱(chēng)取約100 mg 鰓組織樣品(n=6)置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司,DHG-9140A)中,80 ℃烘干至恒重并記錄。 每個(gè)樣品加入1 mL 二次純化濃硝酸(美國(guó)Thermo Scientific 公司,濃度70%,亞沸蒸餾純化),80 ℃水浴加熱至消解完全。 冷卻至室溫,超純水定容至10 mL,采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS) (美國(guó)PerkinElmer 公司,ELAN DRC-Ⅱ)測(cè)定分析Cd 和必需金屬元素如鈉(Na)、鎂(Mg)、鉀(K)、Mn、Zn、銅(Cu)和鐵(Fe)的含量。 組織內(nèi) Cd、Mn 和 Fe 含量以 μg·g-1(干質(zhì)量)表示,Na、Mg、K、Zn 和 Cu 含量以 mg·g-1(干質(zhì)量)表示。

1.3 酶活性及MDA 含量測(cè)定

稱(chēng)取約100 mg 鰓組織樣品(n=6)于勻漿管中,加入生理鹽水或試劑盒提供的提取液進(jìn)行勻漿。 使用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒,測(cè)定總蛋白濃度(BCA 法) 和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,以及 SOD (EC: 1.15.1.1)、CAT (EC:1.11.1.6)、GPx (EC: 1.11.1.9)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK) (EC: 2.7.1.40)、檸檬酸合酶(citrate synthase,CS)(EC:2.3.3.1)、NKA (EC:7.2.2.13)活性。 使用北京索萊寶科技有限公司提供的試劑盒,測(cè)定IDH (EC: 1.1.1.41)活性。 SOD、CAT、GPx、CS、IDH和NKA 活性的活力單位為U·mg-1,PK 活性的活力單位為U·g-1,其中1 U 代表單位質(zhì)量蛋白在單位時(shí)間內(nèi)吸光度的變化;MDA 含量的單位為nmol·mg-1;蛋白濃度的單位為 μg·mL-1。

1.4 綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)(IBR)分析

IBR 計(jì)算方法參考 Beliaeff 和 Burgeot 的方法[22],并稍做改進(jìn),具體計(jì)算過(guò)程簡(jiǎn)述如下:將各組的生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)(Ai)與正常鹽度條件下對(duì)照組的數(shù)據(jù)(A0)進(jìn)行比較,并取對(duì)數(shù)以減少方差;計(jì)算各處理組中Yi的平均值(m)和標(biāo)準(zhǔn)差(s),將Yi標(biāo)準(zhǔn)化;計(jì)算生物標(biāo)志物偏差指數(shù)(B),其中Zi為處理組,Z0為正常鹽度條件下對(duì)照組;對(duì)每種生物標(biāo)志物的B值進(jìn)行絕對(duì)值求和(n為所選用的生物標(biāo)志物的個(gè)數(shù)),計(jì)算出IBR 值。 IBR 值越大表明生物所受影響越大,其中正常鹽度條件下對(duì)照組的IBR 值為0。星圖中描繪出生物標(biāo)志物偏差指數(shù)(B),其中B值高于0(正常鹽度條件下對(duì)照組的B值)的區(qū)域表明生物標(biāo)志物被誘導(dǎo),低于0 的區(qū)域表明生物標(biāo)志物被抑制。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,并采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布(Shapiro-Wilk)檢驗(yàn)和方差齊性(Levene)檢驗(yàn),運(yùn)用雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)研究Cd 和低鹽對(duì)Cd 和必需金屬元素含量以及生物標(biāo)志物響應(yīng)的影響。 運(yùn)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)結(jié)合 Dunnett’s 檢驗(yàn)比較各暴露組與對(duì)照組間差異的顯著性,運(yùn)用t檢驗(yàn)分析比較低鹽度組與正常鹽度組間差異的顯著性以及低鹽度與正常鹽度條件下IBR 值差異的顯著性,若P＜0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 牡蠣鰓中Cd 和必需金屬元素的含量

經(jīng)Cd 暴露的牡蠣鰓中Cd 和必需金屬元素的含量如圖1 所示。 在正常鹽度和低鹽度條件下,牡蠣鰓中Cd 含量均隨Cd 暴露濃度的升高而升高(圖1(a)),且在 80 μg·L-1和 240 μg·L-1Cd 暴露組中均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。 此外,在低鹽度條件下,對(duì)照組和Cd 暴露組樣品中Cd 含量與正常鹽度條件下相比無(wú)明顯差異。

經(jīng)Cd 暴露的牡蠣鰓中必需金屬元素Na、Mg、K、Mn、Zn、Cu 和 Fe 的含量也發(fā)生改變。 雙因素方差分析結(jié)果顯示,Cd 和低鹽對(duì)樣品中K 含量變化存在顯著交互作用(P＜0.05),對(duì)Zn 含量變化的交互作用接近顯著(P=0.051),而對(duì) Na、Mg、Mn、Cu 和 Fe含量變化的交互作用不顯著;Cd 和低鹽均顯著(P＜0.05)影響樣品中 Na 和 Mg 含量,低鹽還顯著(P＜0.05)影響 K、Fe 和 Cu 含量(表 2)。

表2 雙因素方差分析:Cd 和低鹽對(duì)太平洋牡蠣鰓中Cd 及必需金屬元素含量的影響Table 2 Two-way ANOVA: Effects of Cd and low salinity on the concentrations of Cd and essential metal elements in gills of C. gigas

正常鹽度條件下,最高濃度Cd 暴露組(240 μg·L-1)樣品中Na 和Mg 含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)(圖 1(b)~(c));而 Cd 暴露后 K、Mn、Zn、Cu 和 Fe 含量與對(duì)照組相比均無(wú)顯著變化(圖1(d)~(h))。 低鹽度條件下,除5 μg·L-1Cd 暴露組外,其余3個(gè) Cd暴露組樣品中K 含量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);Mn 含量呈倒 U 型曲線,80 μg·L-1Cd 暴露組樣品中Mn 含量最高,顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);最高濃度 Cd 暴露組(240 μg·L-1)樣品中 Zn 含量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);而Cd 暴露后Cu 和Fe 含量與對(duì)照

組相比均無(wú)顯著變化。 此外,與正常鹽度條件下相比,在低鹽度條件下,對(duì)照組和Cd 暴露組樣品中Na和 Mg 含量均顯著降低(P＜0.05);除20 μg·L-1Cd 暴露組外,對(duì)照組和其余3個(gè)Cd 暴露組樣品中K 含量均顯著降低(P＜0.05);最高濃度Cd 暴露組(240 μg·L-1)樣品中 Zn 含量顯著降低(P＜0.05),而 Fe 含量顯著升高(P＜0.05);對(duì)照組和最高濃度Cd 暴露組(240 μg·L-1)樣品中 Cu 含量顯著降低(P＜0.05)。

2.2 牡蠣鰓中抗氧化相關(guān)酶的活性及MDA 含量

雙因素方差分析結(jié)果顯示,Cd 和低鹽對(duì)牡蠣鰓中MDA 含量變化存在顯著交互作用(P＜0.05),而對(duì)SOD、CAT 和GPx 活性變化的交互作用不顯著;Cd和低鹽均顯著(P＜0.05)影響樣品中CAT 和 GPx 活性以及MDA 含量,未顯著影響SOD 活性(表3)。

表3 雙因素方差分析:Cd 和低鹽對(duì)太平洋牡蠣鰓中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響Table 3 Two-way ANOVA: Effects of Cd and low salinity on endpoints related to oxidative stress in gills of C. gigas

牡蠣鰓中抗氧化相關(guān)酶活性及MDA 含量如圖2 所示。 正常鹽度條件下,與對(duì)照組相比,5 μg·L-1和240 μg·L-1Cd 暴露組樣品中 GPx 活性顯著降低(P＜0.05) (圖2(c));MDA 含量隨著 Cd 暴露濃度升高而升高,在高于20 μg·L-1Cd 的暴露組中均顯著升高(P＜0.05) (圖 2(d));而 Cd 暴露后 SOD 和 CAT 活性無(wú)顯著變化(圖2(a) ~(b))。 低鹽度條件下,與對(duì)照組相比,240 μg·L-1Cd 暴露組樣品中 CAT 活性顯著降低(P＜0.05);各Cd 暴露組樣品中GPx 活性均顯著降低(P＜0.05);而Cd 暴露后SOD 活性和 MDA含量均無(wú)顯著變化。 此外,與正常鹽度條件下相比,在低鹽度條件下,80 μg·L-1和 240 μg·L-1Cd 暴露組樣品中 CAT 活性顯著降低(P＜0.05);20 μg·L-1Cd暴露組樣品中GPx 活性顯著降低(P＜0.05);對(duì)照組和20 μg·L-1Cd 暴露組樣品中MDA 含量顯著升高(P＜0.05);而對(duì)照組和Cd 暴露組樣品中SOD 活性無(wú)顯著變化。

2.3 牡蠣鰓中能量代謝和滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)酶的活性

雙因素方差分析結(jié)果顯示,Cd 和低鹽對(duì)牡蠣鰓中IDH 活性變化存在顯著交互作用(P＜0.05),而對(duì)CS、PK 和NKA 活性變化的交互作用不顯著;Cd 和低鹽均顯著(P＜0.05)影響 CS 和 PK 活性,僅低鹽對(duì)NKA 活性接近顯著影響(P=0.063) (表4)。

表4 雙因素方差分析:Cd 和低鹽對(duì)太平洋牡蠣鰓中能量代謝和滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)指標(biāo)的影響Table 4 Two-way ANOVA: Effects of Cd and low salinity exposure on endpoints related to energy metabolism and osmotic regulation in gills of C. gigas

牡蠣鰓中能量代謝和滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)酶的活性如圖3 所示。 在正常鹽度和低鹽度條件下,牡蠣鰓中CS 活性均隨Cd 暴露濃度升高呈倒U 型曲線(圖3(a)),且均以 80 μg·L-1Cd 暴露組樣品中 CS 活性最高,顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。 而不同鹽度條件下樣品中IDH、PK 和NKA 活性的變化趨勢(shì)不同(圖3(b)~(d))。 正常鹽度條件下,240 μg·L-1Cd 暴露組樣品中IDH 活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),而NKA活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);PK 活性呈U 型曲線,80 μg·L-1Cd 暴露組樣品中 PK 活性最低,顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。 低鹽度條件下,Cd 暴露后樣品中IDH、PK 和NKA 活性與對(duì)照組相比均無(wú)顯著變化。 此外,與正常鹽度條件下相比,在低鹽度條件下,240 μg·L-1Cd 暴露組樣品中 IDH 活性顯著降低(P＜0.05),而 NKA 活性顯著升高(P＜0.05)。

2.4 綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)(IBR)

IBR 星圖顯示了牡蠣鰓中8 種生物標(biāo)志物(SOD、CAT、GPx、MDA、CS、IDH、PK 和 NKA)的響應(yīng)(圖4(a)~(b))。 IBR 值分析結(jié)果顯示,正常鹽度條件下,IBR 值隨著Cd 暴露濃度升高而逐漸增大;正常鹽度和低鹽度條件下IBR 值差異接近顯著(P=0.056)。

圖4 Cd 和低鹽單一及復(fù)合脅迫后太平洋牡蠣鰓中生物標(biāo)志物星狀圖和綜合生物標(biāo)記物響應(yīng)(IBR)注:(a) Cd 單一脅迫后生物標(biāo)志物星狀圖;(b) Cd 和低鹽復(fù)合脅迫后生物標(biāo)志物星狀圖;(c) 綜合生物標(biāo)記物響應(yīng)(IBR)。Fig.4 Biomarker star plots and integrated biomarker response (IBR) of C. gigas gills after the exposures to Cd, low salinity and their combinationNote: (a) Biomarker star plots after the exposures to Cd; (b) Biomarker star plots after the exposures to Cd and low salinity; (c) Integrated biomarker response (IBR).

3 討論(Discussion)

3.1 Cd 對(duì)牡蠣鰓的毒性效應(yīng)

海洋雙殼貝類(lèi)的鰓與水環(huán)境直接接觸,是富集Cd 的主要組織[23]。 本研究發(fā)現(xiàn),牡蠣鰓中 Cd 富集量隨Cd 暴露濃度升高呈線性增長(zhǎng),而Cd 對(duì)機(jī)體氧化損傷、離子平衡和能量代謝等過(guò)程的影響表現(xiàn)出多樣化的劑量依賴(lài)效應(yīng)。

生物體為了滿足對(duì)不同金屬離子的需要,通過(guò)多種機(jī)制從胞外環(huán)境攝取離子并維持動(dòng)態(tài)平衡。 本研究發(fā)現(xiàn),Cd 脅迫導(dǎo)致牡蠣鰓中Mg 和Na 含量顯著升高。 Mg2+參與激活多種代謝途徑[29],因此推測(cè)Mg 含量升高與Cd 脅迫后機(jī)體能量和蛋白質(zhì)合成的需求增加有關(guān)。 本研究還發(fā)現(xiàn),牡蠣鰓中NKA活性隨Cd 暴露濃度升高而降低,與Na 含量變化趨勢(shì)相反。 因此,推測(cè)Cd 可能通過(guò)抑制NKA 活性引起Na 含量升高。 此外,Cd 脅迫還導(dǎo)致線粒體酸中毒[30],機(jī)體為了應(yīng)對(duì)酸中毒,會(huì)激活Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)體和Na+/HCO3-共轉(zhuǎn)運(yùn)體,造成 Na+積累[31]。

PK 是糖酵解的限速酶,CS 和 IDH 是 TCA 循環(huán)的限速酶。 本研究發(fā)現(xiàn),牡蠣鰓中 IDH 活性隨Cd 暴露濃度的升高而升高,表明機(jī)體在氧化損傷修復(fù)和維持離子動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中消耗了大量的能量。此外,隨Cd 暴露濃度升高,牡蠣鰓中PK 和CS 活性分別呈U 型和倒U 型曲線,表現(xiàn)出毒物興奮效應(yīng)。毒物興奮效應(yīng)表現(xiàn)為毒物在低劑量水平下刺激、高劑量水平下抑制,是一種過(guò)度補(bǔ)償或應(yīng)激適應(yīng)性響應(yīng)[32]。 Cd 誘導(dǎo)的能量代謝過(guò)程的毒物興奮效應(yīng)在其他海洋貝類(lèi)體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn),如Cd 脅迫后菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)體內(nèi)TCA 循環(huán)和糖酵解等關(guān)鍵代謝途徑均表現(xiàn)出毒物興奮效應(yīng)[1]。

3.2 低鹽對(duì)Cd 毒性效應(yīng)的影響

本研究中,低鹽并未顯著改變牡蠣鰓對(duì)Cd 的富集,但顯著提高消化腺中Cd 含量(數(shù)據(jù)未發(fā)表),推測(cè)可能與鰓和消化腺的功能差異有關(guān)。 牡蠣鰓參與呼吸和過(guò)濾,而消化腺在代謝、解毒過(guò)程中發(fā)揮重要作用[33]。 水體中的Cd 經(jīng)由鰓攝入生物體后,主要儲(chǔ)存在消化腺中,因此,在低鹽度條件下Cd 的生物可利用性得到提高,從而提高了Cd 在消化腺中的生物積累水平。 Burke 等[34]也發(fā)現(xiàn),低鹽度條件下濱蟹(Carcinus maenas)體內(nèi)起呼吸功能的前鰓中Cd 含量沒(méi)有顯著變化。 此外,鰓在離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)過(guò)程中也發(fā)揮了重要的作用。 本研究發(fā)現(xiàn),低鹽顯著降低了牡蠣鰓中 Na、Mg 和 K 含量。 Na+、Mg2+和 K+是海水中主要的陽(yáng)離子,低鹽度條件下牡蠣鰓中這3 種離子含量顯著降低,其主要原因是低鹽養(yǎng)殖海水中這3 種離子濃度顯著降低,表明機(jī)體通過(guò)減少必需金屬元素Na、Mg 和K 的吸收維持滲透壓平衡。

本研究發(fā)現(xiàn),低鹽顯著影響了Cd 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。 Wu 等[35]發(fā)現(xiàn),低鹽顯著抑制菲律賓蛤仔(R.philippinarum)鰓中GPx 活性,對(duì)CAT 活性的抑制作用接近顯著。 本研究中,低鹽顯著抑制了CAT 和GPx 活性,且造成MDA 含量顯著升高,表明低鹽誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。 在抗氧化系統(tǒng)中,CAT 和 GPx 催化 H2O2為 H2O,降低了過(guò)量ROS 對(duì)細(xì)胞造成的傷害,但細(xì)胞內(nèi)H2O2在Fe2+存在下可通過(guò)芬頓(Fenton)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的·OH[36]。 本研究未直接測(cè)定牡蠣鰓中Fe2+濃度,但有研究表明,低鹽顯著上調(diào)悉尼巖牡蠣(Saccostrea glomerata)體內(nèi)Fe2+運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)[37],這與本研究中低鹽顯著提高牡蠣鰓中Fe 含量的現(xiàn)象相符。 因此,牡蠣在低鹽度條件下提高Fe2+吸收可能增加抗氧化系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)。 尤其在Cd 和低鹽復(fù)合脅迫時(shí),低鹽引起機(jī)體氧化還原平衡的改變可能進(jìn)一步加劇Cd 誘發(fā)的氧化脅迫。

Cd 和低鹽復(fù)合脅迫的牡蠣鰓中出現(xiàn)了離子平衡失調(diào)。 隨Cd 暴露濃度升高,低鹽度條件下K 含量表現(xiàn)為先升高、后基本保持不變,而NKA 活性無(wú)顯著變化,表明Cd 和低鹽復(fù)合脅迫條件下牡蠣鰓中K 含量變化可能與NKA 活性無(wú)關(guān)。 此外,Cd2+與K+通道中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基結(jié)合,可以有效阻止 K+通過(guò) K+通道[38-39]。 因此,推測(cè) K 含量變化可能與非選擇性陽(yáng)離子通道(nonselective cation channels, NSCCs)有關(guān)。 NSCCs 是生物膜上能同時(shí)允許不同價(jià)態(tài)陽(yáng)離子通過(guò)的多種通道蛋白的集合體,能夠快速轉(zhuǎn)運(yùn)K+等細(xì)胞代謝必需元素。 研究表明,NSCCs 的激活作用受Cd2+濃度和鹽度調(diào)控[38],結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè),低鹽和高濃度Cd 脅迫增強(qiáng)了細(xì)胞質(zhì)膜的NSCCs 活性。 本研究還發(fā)現(xiàn),低鹽度條件下最高濃度Cd 暴露組(240 μg·L-1)樣品中 Zn含量顯著降低。 有研究表明,低鹽能夠下調(diào)悉尼巖牡蠣(Saccostrea glomerata)Zn2+內(nèi)流通路的基因表達(dá)[37],結(jié)合本研究結(jié)果可知,當(dāng)Cd 暴露濃度達(dá)到一定程度,低鹽可能通過(guò)干擾Zn2+吸收或外排等生物學(xué)通路的基因表達(dá)導(dǎo)致Zn 含量降低。

低鹽脅迫增加了機(jī)體維持正常機(jī)能的成本,以滿足滲透調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激和損傷修復(fù)的能量需求,從而對(duì)機(jī)體的能量代謝產(chǎn)生負(fù)面影響[13]。 在本研究中,低鹽顯著抑制牡蠣鰓中PK 活性,顯著提高了CS 活性,表明低鹽干擾了牡蠣鰓的能量動(dòng)態(tài)平衡。PK 和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)會(huì)競(jìng)爭(zhēng)底物磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP),PK 通過(guò)形成丙酮酸引導(dǎo)PEP 進(jìn)行有氧氧化,而PEPCK 將PEP 轉(zhuǎn)化為草酰乙酸,最終通過(guò)延胡索酸還原酶生成厭氧產(chǎn)物[40]。 因此,PK 活性降低有利于碳水化合物的厭氧代謝[41]。 Noor 等[41]也發(fā)現(xiàn)低鹽脅迫誘導(dǎo)紫貽貝(Mytilus edulis)中PK 活性顯著降低,表明機(jī)體可能采取無(wú)氧代謝來(lái)滿足低鹽脅迫導(dǎo)致的能量需求增加。然而,低鹽誘導(dǎo)PEP 參與無(wú)氧代謝可能影響機(jī)體在Cd 脅迫過(guò)程中的有氧代謝能力。 本研究發(fā)現(xiàn),Cd 脅迫后機(jī)體通過(guò)提高IDH 活性為解毒、氧化應(yīng)激和損傷修復(fù)過(guò)程增加能量供給。 然而,相較于Cd 單一脅迫,Cd 和低鹽復(fù)合脅迫誘導(dǎo)牡蠣鰓中IDH 活性降低,表明機(jī)體的有氧代謝受阻,推測(cè)低鹽可能通過(guò)厭氧代謝途徑干擾Cd 誘導(dǎo)的能量動(dòng)態(tài)平衡紊亂。

綜上所述,Cd 誘導(dǎo)了牡蠣鰓氧化應(yīng)激、離子平衡失調(diào)和能量代謝紊亂;同時(shí),牡蠣通過(guò)增加機(jī)體能量和蛋白質(zhì)合成,以修復(fù)氧化損傷和維持離子動(dòng)態(tài)平衡。 低鹽未改變牡蠣鰓對(duì)Cd 的富集,但顯著影響了部分必需金屬元素的動(dòng)態(tài)平衡;Cd 和低鹽復(fù)合脅迫對(duì)能量代謝和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響存在顯著交互作用。 IBR 分析結(jié)果顯示,Cd 和低鹽復(fù)合脅迫對(duì)牡蠣產(chǎn)生的壓力高于Cd 單一脅迫,表明低鹽加劇了Cd 對(duì)牡蠣的毒性效應(yīng)。 因此,在Cd 污染嚴(yán)重的濕地、河口等低鹽區(qū)域,應(yīng)充分考慮低鹽對(duì)Cd 毒性效應(yīng)及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的影響。