鎘單一及與撲草凈復(fù)合污染對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)

曹茹冰, 鄭毅,2, 孫仕仙,* , 張坤, 鄧志華, 吳珂

1. 西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家高原濕地研究中心/濕地學(xué)院,昆明 650224

2. 云南開放大學(xué)鄉(xiāng)村振興教育學(xué)院,昆明 650223

3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,昆明 650201

4. 西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院/云南省山地農(nóng)村生態(tài)環(huán)境演變與污染治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650224

隨著我國(guó)城市化進(jìn)程的加速以及工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展,重金屬、農(nóng)藥等有害污染物滲入土壤。 而土壤污染具有隱蔽性、潛伏性和長(zhǎng)期性等特點(diǎn),容易被人忽視,其造成的嚴(yán)重后果可通過不同暴露途徑給動(dòng)物和人類健康帶來危害[1]。

2014年政府公布的土壤污染報(bào)告顯示,我國(guó)土壤被重金屬和農(nóng)藥污染總超標(biāo)率為16%,其中,鎘(cadmium, Cd)的點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)7.0%[2]。 而對(duì)于我國(guó)設(shè)施農(nóng)田土壤Cd 污染,南方重于北方,西南、中南地區(qū)土壤重金屬超標(biāo)范圍較大[3],特別是西南高鎘地質(zhì)背景區(qū)的農(nóng)田土壤,由于其酸性土壤、環(huán)境因素和設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展等原因使土壤弱酸提取態(tài)Cd占比高,從而增加其生物可利用性,導(dǎo)致作物中更容易富集Cd,大大增加了農(nóng)作物Cd 污染風(fēng)險(xiǎn),對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全構(gòu)成威脅[4-5]。 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,農(nóng)田雜草是引起農(nóng)作物減產(chǎn)的重要因素之一,除草劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的使用量呈上升趨勢(shì),而三嗪類除草劑用量更是位居前五[6]。 撲草凈(prometryne),是一種三嗪類、低毒、高選擇的內(nèi)吸性除草劑,具有殺草譜廣、藥效長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[7],被廣泛運(yùn)用于多種作物、蔬菜、中草藥、茶園和果樹等雜草防除,甚至用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[8]。 研究發(fā)現(xiàn),撲草凈在土壤中半衰期為1 ~3個(gè)月,其殘留長(zhǎng)達(dá)13個(gè)月[9],在土壤中還可通過微型生物的降解作用產(chǎn)生一系列具有潛在毒理效應(yīng)的代謝產(chǎn)物,這些物質(zhì)的存在都有可能通過食物鏈及食物網(wǎng)的傳遞對(duì)生態(tài)環(huán)境中的各級(jí)生物造成急性、慢性或遺傳毒性,從而破壞生態(tài)平衡[10],對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全、生態(tài)環(huán)境造成巨大影響[11]。

近年來,復(fù)合污染引起人類的廣泛關(guān)注,同時(shí)也成為環(huán)境科學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)[12-13]。 有研究表明,復(fù)合污染物會(huì)對(duì)諸如魚類[14]、蚯蚓[15]和哺乳類[16]等生物產(chǎn)生較為顯著的聯(lián)合毒性效應(yīng)[17]。 蚯蚓在土壤生態(tài)系統(tǒng)中較為常見,數(shù)量大、分布廣,在土壤中生存時(shí)與各類污染物均有密切接觸,并對(duì)污染物感知敏感[18]。 由于對(duì)外界環(huán)境因子敏感度較高,蚯蚓的生態(tài)毒性指標(biāo)又可反映化學(xué)污染物的毒性效應(yīng),因此成為土壤污染毒性效應(yīng)和土壤污染狀況的指示生物[19]。 當(dāng)蚯蚓遭到外源污染物脅迫后體內(nèi)會(huì)積累活性氧自由基(ROS),累積超過一定水平會(huì)造成機(jī)體氧化損傷,并且也會(huì)使蚯蚓機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶活性發(fā)生變化[20]。 Huang 等[21]通過微塑料和Cd共同暴露實(shí)驗(yàn)得出,隨著污染物含量的增加,28 d后微塑料(microplastics, MPs)和Cd 可顯著誘導(dǎo)蚯蚓產(chǎn)生更高的回避反應(yīng),蚯蚓體質(zhì)量減輕、繁殖減少。MPs 和 Cd 聯(lián)合抑制超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化物酶(peroxidase, POD)活性,同時(shí)提高谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;并且微塑料改變了Cd 的有效性而加劇Cd 對(duì)蚯蚓的毒性。 宋欣媛等[22]發(fā)現(xiàn)在相同時(shí)間條件下,草甘膦和撲草凈作用下蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì)為先升高后降低,同時(shí)撲草凈和草甘膦對(duì)蚯蚓體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase, AChE)酶活性有抑制作用。

目前,混合污染物對(duì)蚯蚓的毒性已有報(bào)道,這些研究主要集中在金屬化合物上[23],其中關(guān)于Cd 對(duì)蚯蚓毒理學(xué)研究較多[24],撲草凈的研究多集中于水生動(dòng)植物、浮游植物等方面[25],但沒有關(guān)于Cd-撲草凈復(fù)合污染方面的研究。 為探究Cd-撲草凈對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng),本研究采用濾紙接觸法、人工土壤法測(cè)定不同暴露時(shí)間和暴露濃度下蚯蚓的中毒狀況以及機(jī)體中抗氧化酶(SOD、CAT 和POD)活性、解毒酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性和MDA 含量等指標(biāo)的變化,旨在掌握Cd-撲草凈對(duì)蚯蚓抗氧化系統(tǒng)的劑量-效應(yīng)關(guān)系,為評(píng)價(jià)蚯蚓作為Cd-撲草凈復(fù)合污染的指示生物的指標(biāo)篩選提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為赤子愛勝蚓(Eisenia foetida),在山東棗莊蚯蚓養(yǎng)殖基地購(gòu)買。 蚯蚓放在溫度為(20±2)℃、光暗比為12 h∶12 h 的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 周,選擇生殖環(huán)帶健康、體質(zhì)量250 ~400 mg 的成年蚯蚓測(cè)定不同酶活性指標(biāo)。

1.1.2 供試土壤

由15%苔蘚泥炭細(xì)土、25%高嶺黏土(高嶺土＞50%)[26]、60%工業(yè)石英砂粒(含50%以上0.05 ~0.2 mm 細(xì)小顆粒)等物質(zhì)均勻混合為人工土壤,對(duì)蚯蚓進(jìn)行培養(yǎng)。 每一處理質(zhì)量為5 000 g,依次將各種成分加入到長(zhǎng)49 cm×寬14 cm×高21 cm 的長(zhǎng)方形塑料花盆中混勻,并在花盆底部打孔保持通風(fēng)。

1.1.3 藥品試劑及儀器

藥品試劑:供試藥品97%撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買于濟(jì)南仁諾化工有限公司;Cd 選用 98% CdCl2·2.5H2O,購(gòu)買于昆明盤龍華森有限公司。 SOD 試劑盒、POD 試劑盒、CAT 試劑盒、GST 試劑盒及MDA 試劑盒均由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司(中國(guó))提供。

主要儀器設(shè)備:萬分之一電子天平(ATX224,島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司,中國(guó));臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(3-15K,德國(guó)SIGMA 公司);酶標(biāo)儀(MD SpectraMax Plus 384,美谷分子儀器(上海)有限公司,中國(guó));智能人工氣候箱(RQX-400H,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司,中國(guó));樣品分樣、粉碎、篩分系統(tǒng)(MM400+AS200,德國(guó) RETSCH(萊馳)公司)。

1.2 染毒濃度及染毒方式

1.2.1 濾紙接觸法

將撲草凈溶于甲醇(分析純),并用甲醇由高濃度向低濃度逐級(jí)稀釋;Cd 溶于去離子水,用去離子水進(jìn)行逐級(jí)稀釋。 分別配成系列濃度梯度的溶液。單一污染物 Cd 濃度設(shè)定為 0、50、100、150、200 和250 mg·L-1;撲草凈濃度設(shè)定為 0、5、50、100、150 和200 mg·L-1。 每一處理組3個(gè)平行,每個(gè)平行分別加入15 條體質(zhì)量、大小相近的蚯蚓(約350 mg)。 在玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)鋪襯1 層濾紙,吸取1 mL 配制好的溶液分別均勻?yàn)⒃跒V紙上;其中撲草凈空白對(duì)照組將1 mL 甲醇均勻地灑在濾紙上,待甲醇揮發(fā)干后加入蒸餾水2 mL 潤(rùn)濕濾紙;同時(shí)將培養(yǎng)好的蚯蚓取出、洗凈,用新濾紙吸干蚯蚓體表水分,放入培養(yǎng)皿中,扎孔保鮮膜封口。 在試驗(yàn)開始后第24、48 小時(shí)進(jìn)行觀察,記錄蚯蚓死亡率、中毒癥狀,實(shí)驗(yàn)過程用鑷子觸碰蚯蚓頭部、尾部,無反應(yīng)視為已死亡。

1.2.2 人工土壤法

為進(jìn)一步探索Cd 和撲草凈對(duì)赤子愛勝蚓的氧化脅迫效應(yīng),采用人工土壤法進(jìn)行研究。 據(jù)文獻(xiàn)確定預(yù)期毒性中值,以該值為中間劑量組,以3 倍之差上、下各推一個(gè)劑量組做預(yù)試驗(yàn),找出Cd 和撲草凈的最大致死濃度(LC100) 以及最小致死濃度(MLC)[2,9,27]。 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果在 MLC 和 LC100區(qū)間內(nèi)設(shè)置各污染物溶液濃度:設(shè)置Cd 毒性濃度為0、30、60 和90 mg·kg-1;除草劑撲草凈的實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置成0 mg·kg-1和10 mg·kg-1。 毒性處理時(shí),每個(gè)處理組稱取5 000 g 土壤,其中撲草凈處理組先將甲醇與其中1 000 g 的土壤混合均勻,放入通風(fēng)廚將甲醇揮發(fā)后和剩余4 000 g 土壤混合均勻,同時(shí)將人工土壤含水率大致保持在40%,對(duì)照組同上述操作。 染毒濃度操作時(shí)從對(duì)照組開始,由低到高依次處理。 每一處理均設(shè)有3個(gè)平行組,以及CK 對(duì)照組。 復(fù)合污染物濃度依照單一污染物的土壤毒性而設(shè)定,設(shè)置對(duì)照組,分別在7、14、21 和28 d 各處理組中選擇蚯蚓20 條,放置在玻璃培養(yǎng)皿中用于酶活性測(cè)定。

蚯蚓酶液的制備:蚯蚓放置于墊有干凈濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中,將清腸后的蚯蚓用去離子水洗凈,將身體表面水漬用濾紙擦干,置入預(yù)冷的2 mL EP 管中,然后加入1 mL 勻漿緩沖液(250 mmol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris、1 mmol·L-1EDTA、1 mmol·L-1DTT,混合,定容至1 L,pH=7.5)[28],冰浴勻漿制成組織勻漿液。 將勻漿液放入2 mL 離心管,8 500 r·min-1、4 ℃離心 10 min,測(cè)定。

CAT 活性的測(cè)定采用徐鏡波等[29]的方法,每毫克組織蛋白每分鐘催化1 nmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活性單位。 SOD 活性測(cè)定采用氮蘭四唑比色法[30]。 POD 活性采用愈創(chuàng)木酚比色法[31]測(cè)定,以每分鐘吸光度變化值表示酶活性的大小。 GST 活性參照Habig 等[32]所用方法進(jìn)行測(cè)定,通過測(cè)定25℃、340 nm 條件下反應(yīng)液的吸光度值來確定GST活性的大小。 MDA 含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法[33]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行計(jì)算和分析,并利用單因素方差分析方法中的LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Cd、撲草凈單一暴露下赤子愛勝蚓中毒癥狀

單一重金屬污染對(duì)蚯蚓產(chǎn)生潛在的毒性效應(yīng)如圖 1 所示,在 0 mg·L-1和 5 mg·L-1Cd 暴露下,蚯蚓未出現(xiàn)斷裂或死亡;當(dāng)Cd 濃度達(dá)100 mg·L-1、暴露時(shí)間達(dá)12 h 時(shí),蚯蚓開始出現(xiàn)環(huán)帶腫大和自溶;Cd濃度增加到150 mg·L-1、暴露48 h 時(shí)蚯蚓便出現(xiàn)出血和尾部呈串珠狀現(xiàn)象。 在濃度達(dá)200 mg·L-1和250 mg·L-1時(shí),蚯蚓暴露 12 h 后出現(xiàn)死亡狀況,暴露時(shí)間到24 h 時(shí)250 mg·L-1Cd 處理組蚯蚓死亡率大幅度提高,但有蚯蚓存活,說明250 mg·L-1的Cd對(duì)蚯蚓機(jī)體損傷程度較200 mg·L-1嚴(yán)重。 蚯蚓的中毒癥狀可概括為:蚯蚓更加柔軟,易腐爛,有自溶現(xiàn)象;環(huán)帶腫漲,出血并滲出黃色體液,周圍濾紙有明顯紅色染跡;身體有斷裂現(xiàn)象,活動(dòng)能力減弱;有抱團(tuán)現(xiàn)象。 蚯蚓的死亡率隨染毒時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。

圖1 鎘暴露對(duì)蚯蚓(Eisenia foetida)形態(tài)學(xué)的影響注:(a) 空白對(duì)照組正常蚯蚓;(b) 黃色體液滲出;(c) 生殖環(huán)帶腫大;(d) 體色變黑;(e) 尾部串珠狀;(f) 身體腫大。Fig.1 The effect of cadmium on the morphology of Eisenia foetidaNote: (a) Normal healthy earthworms in control group; (b) Yellow fluid exudation; (c) Enlargement of the genital girdle;(d) The body color turns black; (e) Beaded tail; (f) The body became swollen.

如圖2 所示,撲草凈暴露下蚯蚓的中毒癥狀與Cd 相似,在 0 mg·L-1和 50 mg·L-1暴露組,蚯蚓未出現(xiàn)斷裂或死亡;當(dāng)濃度達(dá)50 mg·L-1、暴露時(shí)間達(dá)12 h 時(shí),蚯蚓開始出現(xiàn)環(huán)帶紅腫變大和黃色體液滲出;撲草凈濃度增加到100 mg·L-1、暴露48 h 時(shí)蚯蚓便出現(xiàn)出血和尾部串珠狀現(xiàn)象。 當(dāng)濃度達(dá)150 mg·L-1和200 mg·L-1時(shí),蚯蚓暴露12 h 后開始出現(xiàn)死亡狀況,24 h 時(shí)200 mg·L-1暴露組蚯蚓死亡率較高,而150 mg·L-1暴露組蚯蚓有存活跡象,說明200 mg·L-1的撲草凈對(duì)蚯蚓機(jī)體損傷程度較150 mg·L-1嚴(yán)重。 蚯蚓中毒癥狀表現(xiàn)為:身體松軟,外界觸碰下略有反應(yīng),置于陽光下反應(yīng)變慢,有黃色體液滲出,蚯蚓身體顏色發(fā)黑、濾紙有血色暈染痕跡,生殖環(huán)帶腫大,尾部有串珠現(xiàn)象,有斷尾現(xiàn)象。

圖2 撲草凈暴露對(duì)蚯蚓(Eisenia foetida)形態(tài)學(xué)的影響注:(a) 空白對(duì)照組正常蚯蚓;(b) 黃色體液滲出;(c) 生殖環(huán)帶腫大;(d) 體色變黑;(e) 尾部串珠狀;(f) 身體腫大并出血。Fig.2 The effect of prometryne on the morphology of Eisenia foetidaNote: (a) Normal healthy earthworms in control group;(b) Yellow fluid exudation; (c) Enlargement of the genital girdle;(d) The body color turns black; (e) Beaded tail; (f) The body became swollen and bled.

2.2 Cd、撲草凈暴露對(duì)赤子愛勝蚓的急性毒性效應(yīng)

如表1 所示,蚯蚓的死亡率與Cd 和撲草凈暴露濃度呈一定的線性關(guān)系。 染毒24 h 時(shí),Cd 24 h-LC50值為 163.821 mg·L-1,撲草凈 24 h-LC50值為46.469 mg·L-1。 染毒 48 h 時(shí),Cd 和撲草凈 48 h-LC50分別為 96.336 mg·L-1和 18.149 mg·L-1,毒性分別增強(qiáng)1.7 倍和2.6 倍。

表1 鎘、撲草凈暴露對(duì)蚯蚓的急性毒性效應(yīng)Table 1 The acute toxic effect of cadmium and prometryne on Eisenia foetida

2.3 Cd、撲草凈暴露對(duì)蚯蚓抗氧化酶活性的影響

2.3.1 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對(duì)蚯蚓SOD活性的影響

Cd 在不同暴露濃度和暴露時(shí)間對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性的影響如圖3 所示。 暴露7 d 時(shí),各濃度處理組SOD 活性較對(duì)照組低,各處理組與對(duì)照組無顯著性差異(P＞0.05);暴露14 d 時(shí),不同濃度組SOD活性激活,與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05),其中60 mg·kg-1組活性最大;在21 ~28 d 不同濃度處理組SOD活性存在不同程度的降低趨勢(shì)。 在7 ~28 d 蚯蚓體內(nèi)SOD 活性整體表現(xiàn)為抑制-激活-抑制,隨時(shí)間變化蚯蚓機(jī)體組織受到外界影響損傷增大,使蚯蚓體內(nèi)SOD 活性降低。 7 ~28 d 復(fù)合組蚯蚓SOD 活性表現(xiàn)為升高-降低走勢(shì)。 暴露 7 d 時(shí),(Cd 90 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組蚯蚓SOD 活性被激活并且活性高于對(duì)照組,復(fù)合組SOD 活性總體上與對(duì)照組、撲草凈單一組相比無顯著差異(P＞0.05);暴露14 d 時(shí),各復(fù)合處理組SOD 活性均被激活,其中(Cd 60 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組 SOD 活性達(dá)到最大值;21 d 時(shí),(Cd 30 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組蚯蚓SOD 活性達(dá)到最大,在28 d 其他各復(fù)合處理組活性均降低;撲草凈單一組在7 ~28 d 時(shí)SOD 活性均被激活。

圖3 鎘單一染毒(a)及鎘-撲草凈復(fù)合染毒(b)對(duì)蚯蚓超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響注:不同小寫字母表示處理間差異顯著(P＜0.05)。Fig.3 Effects of cadmium single exposure (a) and cadmium-prometryne compound exposure (b)on superoxide dismutase (SOD) activity of earthwormsNote: The different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P＜0.05).

2.3.2 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對(duì)CAT 活性的影響

Cd 在不同暴露濃度和暴露時(shí)間對(duì)蚯蚓體內(nèi)CAT 酶活性的影響如圖4 所示。 蚯蚓在Cd 單一染毒后,不同濃度處理組CAT 活性有不同趨勢(shì)。 對(duì)照組CAT 活性比較穩(wěn)定,波動(dòng)較小。 暴露7 d 時(shí),不同處理組CAT 活性均被抑制,說明在染毒初期不同濃度Cd 對(duì)蚯蚓機(jī)體造成氧化損傷,阻礙CAT 發(fā)揮作用,使得蚯蚓體內(nèi)CAT 活性降低;暴露14 d 時(shí),除高濃度處理組外,其他組CAT 活性均被誘導(dǎo)上升,這可能是蚯蚓機(jī)體為應(yīng)對(duì)氧化脅迫所產(chǎn)生過量的H2O2,進(jìn)而激活CAT 活性,而高濃度處理組中蚯蚓受到較大的氧化脅迫影響,使CAT 受到抑制;暴露21 d 時(shí),60 mg·kg-1處理組 CAT 活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);暴露 28 d 時(shí),60 mg·kg-1和 90 mg·kg-1處理組與對(duì)照組相比無顯著差異(P＞0.05)。

圖4 鎘單一染毒(a)及鎘-撲草凈復(fù)合染毒(b)對(duì)蚯蚓過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig.4 Effects of cadmium single exposure (a) and cadmium-prometryne compound exposure (b)on catalase (CAT) activity of earthworms

在暴露7 ~28 d 時(shí),不同濃度組CAT 活性隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)和暴露濃度增大呈升高趨勢(shì),且活性高于Cd 單一作用組;單一撲草凈暴露組CAT 活性在試驗(yàn)期內(nèi)隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)。 暴露7 d時(shí),各復(fù)合處理組CAT 活性未被激活;在14 ~28 d時(shí),各組CAT 活性有所激活,其中(Cd 60 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組CAT 活性在第28 天達(dá)到最大值。

2.3.3 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對(duì)蚯蚓POD活性的影響

Cd 在不同暴露濃度和暴露時(shí)間對(duì)蚯蚓體內(nèi)POD 酶活性的影響如圖5 所示。 暴露第7 ~14 天時(shí),各處理組POD 活性被激活呈上升趨勢(shì);90 mg·kg-1處理組POD 在第14 天達(dá)到最大值;暴露21 ~28 d 時(shí),各處理組POD 活性降低受到抑制,在染毒第28 天,各處理組POD 活性仍被抑制,活性降至最低。 總體來看蚯蚓POD 活性表現(xiàn)為先升高后降低。

圖5 鎘單一染毒(a)及鎘-撲草凈復(fù)合染毒(b)對(duì)蚯蚓過氧化物酶(POD)活性的影響Fig.5 Effects of cadmium single exposure (a) and cadmium-prometryne compound exposure (b)on peroxidase (POD) activity of earthworms

第7 ~28 天時(shí),復(fù)合處理組蚯蚓體內(nèi)POD 的活性先升高后降低,在7 ~21 d 高于撲草凈單一組;撲草凈單一作用組POD 活性隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低。 在暴露14 d 時(shí),(Cd 60 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組POD 活性升高并達(dá)到最大值;暴露28 d 時(shí),各處理組POD 活性受到抑制并降到最低。

2.4 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對(duì)蚯蚓GST 活性的影響

Cd 在不同暴露濃度和暴露時(shí)間對(duì)蚯蚓體內(nèi)GST 酶活性的影響如圖6 所示。 暴露7 d 時(shí),各處理組GST 活性處于激活狀態(tài);第14 天活性下降,在21 d 各處理組 GST 活性上升、28 d 下降。 在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)各處理組隨暴露濃度增加和暴露時(shí)間延長(zhǎng)GST 活性呈升高-降低-升高-降低的趨勢(shì)。

圖6 鎘單一染毒(a)及鎘-撲草凈復(fù)合染毒(b)對(duì)蚯蚓谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的影響Fig.6 Effects of cadmium single exposure (a) and cadmium-prometryne compound exposure (b)on glutathione S-transferase (GST) activity of earthworms

除(Cd 30 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)、(Cd 60 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)復(fù)合處理組蚯蚓體內(nèi)GST 活性在7 ~14 d 未被激活外,其他處理組GST 活性呈現(xiàn)激活狀態(tài)。 暴露7 d 時(shí),相較于對(duì)照組,(Cd 30 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)、(Cd 60 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組GST 活性明顯低于對(duì)照組(P＜0.05);在暴露21 d,(Cd 90 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組 GST 活性升高,顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。 撲草凈單一組在整個(gè)試驗(yàn)周期一直處于被激活狀態(tài)。

2.5 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對(duì)蚯蚓MDA 含量的影響

Cd 不同暴露濃度和暴露時(shí)間對(duì)蚯蚓體內(nèi)MDA含量的影響如圖7 所示。 在整個(gè)暴露期各組蚯蚓體內(nèi)MDA 含量變化和空白對(duì)照組相比變化趨勢(shì)較小,低濃度處理組MDA 含量在第14 天被激活且達(dá)到最大值;高濃度處理組MDA 含量在試驗(yàn)周期內(nèi)呈升高-降低-升高趨勢(shì),在第28 天達(dá)到最大值。 總體來說,蚯蚓體內(nèi)MDA 含量為升高后降低至對(duì)照水平的走勢(shì)。

圖7 鎘單一染毒(a)及鎘-撲草凈復(fù)合染毒(b)對(duì)蚯蚓丙二醛(MDA)含量的影響Fig.7 Effects of cadmium single exposure (a) and cadmium-prometryne compound exposure (b)on malondialdehyde (MDA) content of earthworms

在暴露7 ~28 d,復(fù)合處理組MDA 含量隨染毒濃度的增加和時(shí)間延長(zhǎng)含量升高。 暴露14 d 時(shí),(Cd 60 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組 MDA 含量升高且達(dá)到最大值;高濃度復(fù)合組在整個(gè)周期內(nèi)呈現(xiàn)升高-降低趨勢(shì),隨時(shí)間延長(zhǎng)恢復(fù)至對(duì)照組水平,與對(duì)照組無顯著性差異(P＞0.05)。 在第28 天,各復(fù)合處理組MDA 含量逐漸降低并達(dá)到最低值。 撲草凈單一作用組MDA 含量隨時(shí)間延長(zhǎng)整體呈升高-降低-升高趨勢(shì)。

3 討論(Discussion)

本研究以不同濃度的Cd 和撲草凈對(duì)蚯蚓進(jìn)行急性毒性染毒試驗(yàn),觀測(cè)2 種污染物脅迫下蚯蚓中毒癥狀。 濾紙接觸法試驗(yàn)結(jié)果表明,污染物濃度與蚯蚓死亡率之間存在劑量-效應(yīng)關(guān)系,濃度越高死亡率隨之上升;撲草凈對(duì)蚯蚓毒性大于Cd;重金屬的水溶性較強(qiáng),有機(jī)污染物脂溶性較強(qiáng),污染物在進(jìn)入蚯蚓體內(nèi)后,毒性存在差異[34-36],造成蚯蚓中毒癥狀、個(gè)體形態(tài)不同(如在撲草凈染毒狀態(tài)下蚯蚓體色發(fā)黑、生殖環(huán)帶明顯紅腫變大)。

急性毒性試驗(yàn)在生態(tài)毒理學(xué)研究中占據(jù)重要地位,濾紙接觸法具有便捷快速、易操作等特點(diǎn),并通過接觸生物皮膚獲取污染物對(duì)其產(chǎn)生的毒性信息[37-38]。 不過此方法存在一定弊端,現(xiàn)實(shí)生態(tài)環(huán)境與濾紙接觸法所處環(huán)境有較大差異,生態(tài)環(huán)境中污染物對(duì)生物產(chǎn)生的毒性一方面取決于污染物本身毒性,另一方面受污染物所處環(huán)境(土壤、水等)的影響[39]。 因此,使用濾紙接觸法評(píng)估污染物對(duì)生物及生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的影響具有一定的局限性。 而人工土壤法可通過模擬蚯蚓生存環(huán)境反映污染物在生態(tài)環(huán)境中造成的影響[38-40],因此采用人工土壤法測(cè)定蚯蚓酶活性相關(guān)指標(biāo)。

3.1 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對(duì)蚯蚓抗氧化酶系的影響

SOD 是在生物體內(nèi)廣泛存在的金屬酶類[41],可消除氧化過程產(chǎn)生的超氧陰離子自由基[42],并將其生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2),維持生物體內(nèi)自由基動(dòng)態(tài)平衡,是生物體重要的抗氧化酶之一[43]。 細(xì)胞SOD 活性的變化反映了生物細(xì)胞中氧化應(yīng)激的變化,通常這種變化被認(rèn)為是環(huán)境污染的早期生物標(biāo)志[44]。 在Cd 單一暴露時(shí),蚯蚓SOD 活性表現(xiàn)為抑制-激活,在第14 天蚯蚓體內(nèi)SOD 活性較空白對(duì)照組增強(qiáng),Cd 脅迫使蚯蚓機(jī)體受損,ROS積累較多,破壞蚯蚓體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡。 在Cd與撲草凈復(fù)合作用時(shí),SOD 在前、中期被誘導(dǎo)上升,后期降低。 初期階段,單一組及復(fù)合組SOD 活性較對(duì)照組有所降低,因?yàn)?在受到外界污染物脅迫時(shí)蚯蚓機(jī)體進(jìn)行自我保護(hù),當(dāng)蚯蚓體內(nèi)原有的SOD 被消耗殆盡時(shí),活性降低。 蚯蚓在接觸有毒物質(zhì)一段時(shí)間后,對(duì)當(dāng)下環(huán)境有所適應(yīng),SOD 也隨之被激活。而在有毒物質(zhì)的長(zhǎng)期影響下,蚯蚓機(jī)體受損無法對(duì)抗積累過多的ROS,因此復(fù)合組SOD 活性與對(duì)照組相比有所降低,受到抑制。 王艷等[39]在研究鄰苯二甲酸酯類(PAEs)對(duì)蚯蚓體內(nèi)SOD 活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),蚯蚓遭受逆境影響時(shí)SOD 活性被誘導(dǎo),隨著暴露濃度升高和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)生物體內(nèi)細(xì)胞膜受損氧化,酶活性降低。 劉嫦娥等[45]研究丁草胺和乙草胺對(duì)蚯蚓SOD 活性的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)酶活性表現(xiàn)為誘導(dǎo)-抑制。 Cd 與撲草凈復(fù)合組SOD 活性較Cd單一組活性高,原因可能是土壤具有一定的吸附能力并帶有負(fù)電荷,Cd 離子帶正電荷,Cd 離子被吸附,在一定程度上使SOD 活性升高[42,46]。

CAT 在抗氧化機(jī)制中發(fā)揮著重要作用,清除機(jī)體H2O2,避免細(xì)胞受到 H2O2的侵害[47]。 Cd 單一染毒時(shí),蚯蚓CAT 活性總體表現(xiàn)為上升-下降。 染毒初期CAT 活性未被激活;在中期時(shí)CAT 被激活,抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮作用;染毒后期,隨Cd 濃度升高、時(shí)間延長(zhǎng),CAT 活性降低,可能是受到長(zhǎng)時(shí)間Cd暴露,體內(nèi)污染物大量富集使得機(jī)體細(xì)胞受損嚴(yán)重,無法處理過量H2O2,最終CAT 活性降低。 與平令文等[48]的研究結(jié)果相似,其研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓在受鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)暴露的前期、后期CAT 活性受到抑制,與對(duì)照組無顯著差異,而在受DEP 暴露的中期蚯蚓機(jī)體為對(duì)抗過量的H2O2,體內(nèi)CAT 酶活性發(fā)揮作用由此被激活而升高。 Cd 與撲草凈復(fù)合暴露時(shí),CAT 活性為逐漸升高趨勢(shì),且活性較Cd、撲草凈單一作用時(shí)有所上升。 在第7 天復(fù)合組蚯蚓體內(nèi)CAT 活性低于Cd 單一處理組,也低于空白對(duì)照組,在復(fù)合作用下其毒性大于單一Cd 污染毒性,使蚯蚓體內(nèi)ROS 含量升高。 伴隨染毒時(shí)間的延長(zhǎng)蚯蚓受到氧化脅迫影響,同時(shí)在SOD 共同作用下蚯蚓體內(nèi)CAT 活性升高;蔡文貴等[49]研究鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對(duì)翡翠貽貝(Perna viridis)內(nèi)臟中的酶活性影響時(shí),也發(fā)現(xiàn)CAT 有相同的變化現(xiàn)象。

POD 也屬于氧化還原酶,且是抗氧化酶系統(tǒng)中不可缺少的成員,對(duì)生物體代謝起一定的防御作用[47]。 在Cd 單一及與撲草凈復(fù)合暴露時(shí),蚯蚓體內(nèi)POD 活性的變化趨勢(shì)是上升-下降并與對(duì)照組無較大差異。 在復(fù)合暴露初期,Cd 與撲草凈復(fù)合作用對(duì)蚯蚓產(chǎn)生的氧化脅迫使得POD 被激活,H2O2有一定程度消除;在復(fù)合暴露28 d 時(shí),污染物的毒性增強(qiáng)使蚯蚓機(jī)體受損,因而各濃度組POD 活性降低,與對(duì)照組無顯著性差異。 Cd 與撲草凈復(fù)合污染時(shí),POD 活性較Cd 單一作用時(shí)高,復(fù)合污染使蚯蚓機(jī)體對(duì)外界環(huán)境產(chǎn)生更大反應(yīng),由此生成較多的POD。 王飛菲等[38]在研究草甘膦對(duì)蚯蚓的氧化脅迫時(shí)發(fā)現(xiàn)低濃度草甘膦的暴露下,CAT 在清除H2O2時(shí)起首要作用,當(dāng) H2O2過量時(shí) POD 協(xié)同發(fā)揮作用。

3.2 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對(duì)蚯蚓GST 活性的影響

GST 在生物體遭遇環(huán)境污染等逆境脅迫時(shí)可有效排除入侵機(jī)體的有毒污染物、細(xì)胞毒素和基因毒素等,維持生物體動(dòng)態(tài)平衡[50]。 本實(shí)驗(yàn)中,在Cd單一作用下隨著GST 活性升高有毒物質(zhì)有所清除,后期GST 活性降低。 在復(fù)合暴露期間,撲草凈的影響作用下,蚯蚓機(jī)體中GST 的活性單一Cd 污染組,說明生物體有一定的自我修復(fù)能力,但由于長(zhǎng)時(shí)間受逆環(huán)境脅迫GST 活性下降與對(duì)照組無顯著差異。三氯卡班和Cd 的復(fù)合作用對(duì)蚯蚓GST 活性影響的試驗(yàn)結(jié)果顯示,復(fù)合組在長(zhǎng)時(shí)間污染暴露下機(jī)體有毒物質(zhì)積累過量,GST 合成受到影響,導(dǎo)致GST 活性下降[51]。 這與本試驗(yàn)中經(jīng)過Cd 和撲草凈處理后,蚯蚓體內(nèi)GST 活性變化趨勢(shì)相一致。 在整個(gè)復(fù)合作用期間GST 活性高于Cd 單一作用的GST 活性,同時(shí)在此期間SOD 和CAT 活性被激活,說明蚯蚓體內(nèi)GST 起到排除有毒物質(zhì)的作用。

3.3 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對(duì)蚯蚓MDA 含量的影響

MDA 是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物并且會(huì)造成膜的損傷加劇、細(xì)胞的代謝功能無法正常發(fā)揮作用,學(xué)者采用MDA 含量來判斷細(xì)胞代謝以及其他功能損傷狀況[52]。 不論Cd 單一作用還是與撲草凈復(fù)合污染時(shí),蚯蚓體內(nèi)MDA 含量可歸納為先升高后降低。 暴露初期蚯蚓在污染環(huán)境的脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)未能及時(shí)發(fā)揮作用,ROS 增多細(xì)胞代謝功能減弱,蚯蚓體腔細(xì)胞受到損傷,MDA 含量升高。 鐘碧瑾等[53]發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥隨著時(shí)間與濃度的增加沼水蛙蝌蚪(Hylarana guentheritadpole)機(jī)體 MDA 含量也增加。 在暴露后期,抗氧化酶活性系統(tǒng)有所恢復(fù)并發(fā)揮作用,同時(shí)土壤也具有一定的吸附能力,能吸收一部分有毒污染物含量,使MDA 含量有所降低。

通過人工土壤法對(duì)蚯蚓進(jìn)行染毒研究,結(jié)果表明Cd 單一及與撲草凈復(fù)合暴露均能引起蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶活性變化,機(jī)體內(nèi)自由基累積最終造成過氧化損傷。 實(shí)驗(yàn)中所設(shè)定的污染物濃度較高,污染物在低劑量水平下對(duì)蚯蚓所造成的生態(tài)毒理效應(yīng)在本研究中沒有深入研究,因此有待進(jìn)一步結(jié)合細(xì)胞、組織和基因表達(dá)來探索復(fù)合污染對(duì)蚯蚓所造成的生態(tài)毒性效應(yīng),為土壤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及早期預(yù)警提供理論依據(jù)。