吳佳欣，樊芳蕾，趙若晴，王報貴

(濱州學院 生物與環(huán)境工程學院，山東 濱州 256600)

1 引言

檸檬(Citruslimon(L.) Burm. f.)，蕓香科柑橘屬植物，又稱檸果、洋檸檬等。果皮厚，通常粗糙，其性喜溫暖，耐陰，不耐寒，也怕熱。檸檬原產(chǎn)東南亞，美洲也有分布，在我國, 檸檬的主要種植區(qū)域為長江以南，四川、福建、臺灣省等地都有栽培,而以四川省安岳縣種植量最大[1]。檸檬果實汁多肉脆，有濃郁的芳香氣，富含維生素、檸檬酸、檸檬精油、檸檬黃酮、微量元素等成分,具有極高的藥用價值[2,3]。檸檬果皮富含芳香揮發(fā)成分，可以生津解暑，開胃醒脾，長期食用有益身體健康。檸檬用途廣泛，在烹飪、航空、醫(yī)藥、香料、美容等領域均有涉及，產(chǎn)生大量的檸檬皮成為必然，需要將這些廢棄物充分利用起來，這樣既不造成資源的浪費，同時也可以保護環(huán)境[4]。

黃酮是廣泛存在于自然界的某些植物和漿果中的天然酚類物質(zhì)，是一種具有強氧化作用的生理活性物質(zhì)，具有多方面的功效，可有效清除體內(nèi)的氧自由基，阻止細胞的退化衰老，能夠改善人體血液循環(huán)，也可降低膽固醇水平等，適量攝入對人體有一定益處[5,6]，因此加大對檸檬皮中黃酮類物質(zhì)的提取具有很大的現(xiàn)實意義?，F(xiàn)研究黃酮提取方法有熱水提取法、有機溶劑提取法、微波提取法、超聲波提取法、酶解提取法、超臨界流體萃取法、連續(xù)逆流提取法等[7～9]。超聲波在液體中具有空化作用加速植物有效成分的浸出提取，因此超聲波提取法提取黃酮類物質(zhì)被廣泛應用，是目前比較新的、提取得率相對較高的一種方法，具有設備簡單、操作方便、提取時間短、溶劑用量少、產(chǎn)率高等優(yōu)點[10,11]。

檸檬的皮、果肉、種子中含有豐富的黃酮類化合物，通常皮中含量較多，故黃酮類化合物廣泛存在于檸檬皮中[12]，從檸檬皮中提取到的黃酮化合物可應用到多個領域，具有很大的經(jīng)濟價值。本試驗旨在研究用超聲波輔助乙醇提取的工藝提取檸檬皮中的黃酮類物質(zhì)，通過改變乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度、超聲功率和液固比5個因素[13,14]，對最終黃酮得率進行比較，選出適合且高效的最佳提取方式，進而為檸檬皮中黃酮的提取提供一種切實可行的工藝，同時也可以作為其他天然物質(zhì)中黃酮提取的實驗依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

檸檬(四川檸盟)；無水乙醇(煙臺遠東精細化工有限公司)；蘆丁標品(合肥博美生物科技有限責任公司)；硝酸鋁(天津市福晨化學試劑廠)；亞硝酸鈉(天津市福晨化學試劑廠)；氫氧化鈉(天津市福晨化學試劑廠)。

2.2 儀器與設備

托盤，離心管(50 mL)，40目篩，移液槍(1000 μL)，燒杯(250 mL)，量筒(100 mL，50 mL)，容量瓶，剪刀，膠頭滴管，試管(25 mL)，移液管(5 mL，10 mL)。

組織搗碎機(上海左樂儀器有限公司)；電子天平(上海菁海儀器有限公司)；紅外干燥箱(上海景邁儀器設備有限公司)；冰箱(山東海信公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技中國有限公司)。

2.3 實驗方法

2.3.1 樣品預處理

將新鮮檸檬洗凈去皮，用剪刀將檸檬皮剪成小條狀，平鋪在潔凈且干燥的托盤上，溫度維持在45 ℃于紅外干燥箱中烘干直至恒重，然后取出用組織搗碎機進行粉碎處理，之后過40目篩，將篩出粉末裝入密封袋放入冰箱冷凍室中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 繪制蘆丁標準曲線

用電子天平準確稱取20.00 mg蘆丁標準樣品，于45 ℃恒溫水浴下使用無水乙醇溶解，在室溫下定容于燒杯(50 mL)中、震蕩搖勻，備用。準備6個25 mL具塞試管，將蘆丁標準母液用移液管(5 mL)分別吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL至25 mL具塞試管中，同時做空白試驗。首先向各試管加入1.5 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，震蕩搖勻，靜置6 min，之后加入等量10%的硝酸鋁溶液，重復上述操作，最后加入7.5 mL 4%的氫氧化鈉溶液，再用相同濃度的乙醇定容至25 mL，震蕩搖勻，靜置15 min[15]。以空白對照組為參照，在紫外分光光度計的510 nm處測定各試管樣品的吸光值，每組樣品做3個平行試驗，結(jié)果取平均值，以各組樣品計算得到的蘆丁標準母液濃度為橫坐標(x)，OD值為縱坐標(y)繪制蘆丁標準曲線。

2.3.3 黃酮提取

準確稱取1.000 g檸檬皮粉末于50 mL離心管中，向其中加入不同濃度或體積的乙醇浸取液，震蕩搖勻，在不同的超聲功率或超聲溫度下提取相應時間的黃酮。之后再放入高速冷凍離心機，于4200 r/min離心20 min后取上清液，靜置備用。

2.3.4 黃酮含量測定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH光度法檢測樣品總黃酮含量[16]。用移液槍(1000 L)分別吸取2 mL備用樣品液于50 mL離心管中，并依次添加NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液和NaOH溶液各0.8 mL，靜置時間分別為6 min、6 min和15 min，每次添加后均需將混合液搖勻。最后于510 nm處測定其OD值，依照上步繪制的蘆丁標準曲線得出各樣品的對應濃度，按照公式(1)計算出總黃酮總量：

(1)

式(1)中：c為由蘆丁標準曲線得出待測樣液中對應的總黃酮濃度，mg/mL；n為稀釋倍數(shù)；v樣液的總體積，mL；m為檸檬皮粉末質(zhì)量，mg；w為總黃酮含量。

2.3.5 單因素試驗

準確稱取檸檬皮粉末1.000 g，按照不同的乙醇濃度與液固比分別添加乙醇浸取液(均呈等差遞增)，在不同的超聲功率和超聲溫度下浸取不同的時間，在高速冷凍離心機中于4200 r/min離心20 min，之后吸取上清液測其510 nm處的OD值，利用蘆丁標曲得出對應濃度，進而求得總黃酮提取率。單因素各水平詳見表1。

2.3.6 正交試驗

單因素試驗后，對各因素的吸光值進行比較分析，選出其中4個影響較大的因素進行后續(xù)正交試驗，通過對總黃酮得率的分析得出最優(yōu)的提取工藝。正交因素各水平詳見表2。

表1 單因素試驗水平選擇

表2 正交試驗因素水平

2.3.7 數(shù)據(jù)處理

繪制蘆丁標準曲線，查閱相關資料確定單因素試驗條件選取范圍，記錄單因素實驗數(shù)據(jù)，制定單因素水平表，利用Excel繪制標曲并用Prism軟件繪制折線圖觀察趨勢；依據(jù)單因素試驗結(jié)果確定正交試驗因素并制定因素水平表、正交表；通過對正交表的分析進而得到總黃酮得率最高的黃酮提取最佳組合，由此確定最佳的黃酮提取工藝。

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標準曲線的繪制

由圖1可以得出，蘆丁標準曲線回歸方程為y=11.486x+0.0003，R2=0.9997，線性關系較好，可用于下面實驗。

圖1 蘆丁標準曲線

3.2 單因素試驗結(jié)果

3.2.1 超聲溫度對總黃酮得率的影響

在相同前提下改變超聲提取的溫度，得到不同超聲溫度與總黃酮得率的關系如圖2所示。在20～40 ℃時黃酮提取率與提取時的溫度成正比，超聲溫度越高，總黃酮得率越大。這種情況的出現(xiàn)可能是因為隨著溫度的升高，檸檬皮粉末中的分子運動速度加快，使得黃酮更易于從細胞中向溶液中轉(zhuǎn)移。在超聲溫度達到40 ℃時總黃酮提取率為0.652%，溫度高于40 ℃則隨著超聲溫度的升高黃酮得率迅速降低，這可能是由于溫度過高加快了乙醇的揮發(fā)程度，同時破壞了檸檬皮粉末中的部分黃酮類物質(zhì)，導致提取率降低。綜合考慮后確定40 ℃為最佳的提取溫度，并以此作為后續(xù)試驗的固定條件之一。

圖2 超聲溫度對總黃酮得率的影響

3.2.2 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

在相同前提下改變乙醇體積濃度，得到不同乙醇濃度與總黃酮得率的關系如圖3所示。通過圖3得知：在40%乙醇濃度時黃酮提取率為0.622%，在乙醇濃度為40%～70%時隨著濃度的升高總黃酮得率呈增大的趨勢，這可能是由于黃酮類物質(zhì)在乙醇濃度過低時難以浸出完全，當乙醇濃度為70%時提取率達到了0.763%，原因可能是檸檬皮中黃酮類物質(zhì)的極性與濃度為70%的乙醇溶液極性相似，當乙醇濃度超過70%時黃酮得率出現(xiàn)下降的趨勢，超過80%則降低幅度增大，可能是隨著乙醇濃度的升高，檸檬皮粉末中溶出的脂溶性物質(zhì)增多從而影響了黃酮的相對浸出量，且乙醇濃度過高導致溶液中滲透壓過大，降低了黃酮的提取率。因此可以確定:提取黃酮最佳的乙醇濃度為70%，并以此作為后續(xù)試驗的固定條件之一。

圖3 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

3.2.3 液固比對總黃酮得率的影響

在相同前提下改變乙醇的用量，得到不同液固比與總黃酮得率的關系如圖4所示。通過圖4可以了解到，從整體上看，當液固比為15∶1時黃酮提取率最低為1.226%，液固比為30∶1時總黃酮得率達到1.318%，液固比大于30∶1時總黃酮得率開始降低。這是因為溶劑過少時黃酮無法充分浸出，隨著溶劑倍數(shù)的增大使得溶劑與檸檬皮粉末的接觸面積增多，促進了黃酮化合物的提取，而溶劑過多時由于雜質(zhì)的浸出量增多以及溶液的稀釋效應而導致提取率下降。在固液比為20∶1時出現(xiàn)了一個小高峰，之后出現(xiàn)短暫下降又升高的現(xiàn)象，難以得出液固比顯著的最佳條件，因此將固液比舍去，不進行后續(xù)實驗。

3.2.4 超聲功率對總黃酮得率的影響

在相同前提下改變超聲提取的功率，得到不同超聲功率與總黃酮得率的關系如圖5所示。通過圖5可以了解到，超聲功率在500 W時黃酮得率達到1.175%，低于500 W時黃酮得率隨超聲功率的升高而增加，這是因為超聲功率產(chǎn)生的空化效應得到了增強，加快了黃酮從細胞中向溶液中滲透的速度，所以得率逐漸增大，在500～700 W的超聲功率范圍內(nèi)黃酮得率逐漸降低，在700 W時為1.127%，可能是由于較大的超聲功率破壞了黃酮化合物的穩(wěn)定性從而使提取量降低，而當超聲功率大于700 W時，黃酮總得率又隨著超聲功率的增大而增加，這種情況的出現(xiàn)可能是由于超聲功率過大使得提取溫度明顯升高，導致黃酮提取率隨之增加。綜合考慮后確定500 W為最佳黃酮提取功率，并以此作為后續(xù)試驗的固定條件之一。

圖4 液固比對總黃酮得率的影響

圖5 超聲功率對總黃酮得率的影響

3.2.5 超聲時間對總黃酮得率的影響

在相同前提下改變超聲提取的時間，得到不同超聲時間與總黃酮得率的關系如圖6所示。通過圖6可以了解到，超聲時間為10 min時黃酮提取率為1.034%，在超聲時間為10～50 min范圍內(nèi)總黃酮得率隨著超聲時間的延長而增加，在50 min提取率達到1.178%，這可能是由于在黃酮提取初期隨著超聲時間的增加，檸檬皮粉末受到的氣蝕作用促使細胞破裂徹底，進而使得更多的黃酮化合物溶于乙醇溶劑中，從而提高了黃酮得率，當超聲提取時間超過50 min后，總黃酮得率開始降低，原因可能是超聲時間過長使得更多的雜質(zhì)浸出細胞而影響了黃酮的浸出量，且時間過長會破壞細胞中黃酮物質(zhì)的活性也會使黃酮得率降低。因此可以確定黃酮提取的最佳超聲時間為50 min，并以此作為后續(xù)試驗的固定條件之一。

圖6 超聲時間對總黃酮得率的影響

3.3 正交試驗結(jié)果

通過對單因素試驗的數(shù)據(jù)分析，選取對檸檬皮中黃酮提取影響較顯著的4個因素進行后續(xù)正交試驗，分別為超聲溫度、乙醇濃度、超聲功率和超聲時間，以此來優(yōu)化黃酮提取工藝，得出最優(yōu)提取條件。由于液固比對黃酮提取率的影響趨勢不明確，綜合考慮后選擇總黃酮得率最高的30∶1為固定液固比，得到正交試驗結(jié)果見表3。

正交試驗數(shù)據(jù)結(jié)果表明，提取檸檬皮粉末中黃酮的最優(yōu)組合為A3B3C3D1，總黃酮得率達到了1.300%。通過R值可以看出，超聲功率對黃酮提取的影響最為顯著，其余依次為超聲時間、乙醇濃度，超聲溫度的影響最弱，因此得出最佳的提取條件為超聲溫度45 ℃；乙醇濃度75%；超聲功率600 W；超聲時間45 min；液固比30∶1 (mL/g)。

4 結(jié)論和討論

4.1 結(jié)論

本試驗利用單因素試驗和四因素三水平正交試驗提取檸檬皮中的黃酮類物質(zhì)，通過對試驗結(jié)果的研究分析，最終確定了超聲波輔助提取檸檬皮中總黃酮的最佳提取工藝為超聲溫度45 ℃；乙醇濃度75%；超聲功率600 W；超聲時間45 min；液固比30∶1 (mL/g)，此時總黃酮得率最高，為1.300%。該研究具有一定的實用意義，既證明了檸檬皮中具有豐富的黃酮化合物，也為之后天然產(chǎn)物中提取黃酮提供了參考價值。

表3 正交試驗結(jié)果

4.2 討論

研究表明，光照、溫度、水分、營養(yǎng)等環(huán)境因素會影響植物中黃酮類化合物的合成[17]，檸檬適宜于在冬無嚴寒、夏無酷熱的地方種植，以土層深厚、含有機質(zhì)豐富、保濕保肥力強的緩坡地為最佳，要求雨水分布均勻，氣溫平穩(wěn)，光照充足[18]，這些可能是使得檸檬中黃酮含量較多的原因。檸檬皮粉末應儲存在冰箱中以保持低溫干燥的狀態(tài)，確保黃酮的損失降低到最小程度，由于檸檬中總黃酮含量會隨著儲存時間的延長而降低[19]，所以備用的檸檬皮粉末不宜放置過長時間，應盡快進行試驗。

由于實驗條件的關系，本文未對檸檬皮中黃酮類物質(zhì)進行進一步的分析與研究，之后有機會將深入研究黃酮類物質(zhì)的生理特性與理化性質(zhì)，以挖掘黃酮化合物更多的使用價值。