王 磊,支歡歡,馬永強(qiáng),姚 強(qiáng),陳紅雨,張 綱,郭青云
(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站,青海 西寧 810016;2.青海省海東市樂都區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,青海 海東 810600)
【研究意義】櫻桃(Cerasus pseudocerasus)是薔薇科(Rosaceae)櫻屬(Cerasus)落葉果樹,是我國(guó)北方果實(shí)成熟較早的樹種,素有“春果第一枝”的美譽(yù)[1]。櫻桃果實(shí)口感酸甜,富含多種維生素和礦物質(zhì)成分,能提高人體免疫力、抗衰老能力,極具醫(yī)療保健價(jià)值,故又被稱為“水果中的寶石”[2]。此外,櫻桃的根、果、核、枝、葉等皆可入藥,能對(duì)多種疾病起到預(yù)防和治療的作用,對(duì)人類的身體健康大有增益[3]。櫻桃果實(shí)經(jīng)濟(jì)價(jià)值高,市場(chǎng)前景廣,因此在我國(guó)各省市的種植面積逐年遞增,主要集中在陜西、遼寧、山東、四川、江蘇、甘肅等地區(qū)[4]。近年來,隨著青海省櫻桃產(chǎn)業(yè)規(guī)模的逐步擴(kuò)大,降雨量增多,在櫻桃上發(fā)生的病害種類和危害程度呈明顯上升趨勢(shì),常發(fā)病害有褐腐病、流膠病、炭疽病和褐斑病等[5-8],成為阻礙櫻桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一。本課題組在青海省海東市樂都區(qū)洪水鎮(zhèn)進(jìn)行櫻桃病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)葉斑病,其病害癥狀主要表現(xiàn)為葉片上產(chǎn)生水漬狀、近圓形的褐色斑點(diǎn),斑點(diǎn)周圍有紫紅色暈圈,嚴(yán)重時(shí)病斑相互連接成不規(guī)則狀,葉片失綠黃化,影響光合作用,導(dǎo)致葉片過早脫落,嚴(yán)重阻礙櫻桃來年樹勢(shì)的生長(zhǎng)。據(jù)調(diào)查,該病害最早發(fā)病時(shí)期為6 月上旬,發(fā)病初期形成水漬狀斑點(diǎn),由于7 月中旬至8 月下旬降雨增多,果園濕度增大,病害迅速爆發(fā),部分植株的葉片發(fā)病嚴(yán)重,發(fā)病率高達(dá)100%。【前人研究進(jìn)展】本課題組前期將櫻桃葉斑病病原菌鑒定為鏈格孢(Alternaria alternata)、細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)和楊柳炭疽菌(Colletotrichum salicis)[9]。楊柳炭疽菌屬于炭疽菌屬真菌的一種,目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于楊柳炭疽菌生物學(xué)特性以及高效防治藥劑的篩選等相關(guān)研究鮮有報(bào)道,而對(duì)炭疽菌屬真菌引起的病害防治主要依賴于化學(xué)藥劑。如劉一賢等[10]研究10 種殺菌劑對(duì)辣木果腐病病原菌蘭生炭疽菌(Colletotrichum chlorophyti)的防效,結(jié)果表明咪鮮胺和嘧菌酯的防效最好;李文等[11]對(duì)百日草炭疽病病原菌防治藥劑篩選結(jié)果表明氟啶胺和咪鮮胺的抑菌活性最強(qiáng);張琳等[12]研究表明多菌靈、抑霉唑和甲基硫菌靈對(duì)南瓜炭疽病菌(Colletotrichum brevisporum)具有良好的防治效果。【本研究的切入點(diǎn)】楊柳炭疽菌是引起櫻桃葉斑病的新病原菌,主要危害樹勢(shì)生長(zhǎng),嚴(yán)重影響櫻桃產(chǎn)量,該病原菌生物學(xué)特性及室內(nèi)毒力測(cè)定有待深入研究?!緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在明確楊柳炭疽菌的生物學(xué)特性,篩選出防治效果最佳的殺菌劑,以期為青海省櫻桃葉斑病的防治奠定理論基礎(chǔ)。
自然發(fā)病的櫻桃葉斑病樣本采自青海省海東市樂都區(qū)洪水鎮(zhèn)櫻桃園,供試菌株為經(jīng)櫻桃葉斑病樣品分離純化并經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確鑒定命名并保存的楊柳炭疽菌(C.salicis)。
參照邵慧慧等[13]、張秀偉等[14]和吳松等[15]選用PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)、MS 培養(yǎng)基、OA(燕麥片瓊脂培養(yǎng)基)、SA(淀粉瓊脂培養(yǎng)基)、CPA(葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基)、RB(孟加拉紅培養(yǎng)基)、MA(麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基)、YEA(酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基)以及Czapek(査氏培養(yǎng)基)共9 種供試培養(yǎng)基對(duì)楊柳炭疽菌(C.salicis)進(jìn)行培養(yǎng),以篩選最適該病原菌的培養(yǎng)基。
本試驗(yàn)供試殺菌劑均為市售農(nóng)藥,具體信息見表1。
表1 參試藥劑及其稀釋倍數(shù)Table 1 Dilutions of tested fungicides
將分離的菌株C.salicis轉(zhuǎn)接于PDA 上進(jìn)行純化,形成供試菌落備用。在不同培養(yǎng)條件下接種供試菌落培養(yǎng)7 d 后,采用十字交叉法測(cè)菌落直徑[16];培養(yǎng)10 d 后,從不同處理間培養(yǎng)皿的相同位置打取10 個(gè)直徑為5 mm 的菌餅,將菌餅加入10 mL 無菌水中并充分混合制成孢子懸浮液,再用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定產(chǎn)孢量[17]。
1.4.1 培養(yǎng)基對(duì)櫻桃楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 用滅菌的打孔器(5 mm)在供試菌落邊緣打取菌餅,接至上述9 種供試培養(yǎng)基的平板中央,每個(gè)平板放一塊菌餅,各處理重復(fù)3 次。
1.4.2 碳氮源對(duì)櫻桃楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 以PDA 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,將供試菌落的菌餅分別接至以葡萄糖、山梨醇、乳糖、甘油、蔗糖、果糖、肌醇、麥芽糖和可溶性淀粉作為不同碳源培養(yǎng)基的平板上[18],以硝酸鉀、硝酸銨、牛肉膏、硫酸銨、酵母膏、蛋白胨、尿素和谷氨酸鈉為不同氮源培養(yǎng)基的平板上[19],不外加碳、氮源的PDA 作為對(duì)照,各處理重復(fù)3 次。
1.4.3 溫度對(duì)櫻桃楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 將供試菌落的菌餅轉(zhuǎn)接至PDA 平板中央,分別置于5、10、15、20、25、30、35 和40 ℃[20]處理下培養(yǎng),各處理重復(fù)3 次。
1.4.4 pH 值對(duì)櫻桃楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 用0.1% NaOH 溶液(m/m)和0.1% HCl 溶液(V/V)將PDA 培養(yǎng)基的pH 值分別調(diào)節(jié)成4、5、6、7、8、9、10、11、12[21],將菌餅移入不同pH 的PDA 培養(yǎng)基中央,重復(fù)3 次。
1.4.5 光照周期對(duì)櫻桃楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 無菌條件下,將供試菌落邊緣的菌餅轉(zhuǎn)接于PDA 平板中央,分別置于24 h 持續(xù)黑暗、12 h 光照和12 h 黑暗交替、24 h 持續(xù)光照條件下培養(yǎng)[22],各處理重復(fù)3 次。
1.4.6 病原菌菌絲的致死溫度 將菌餅(5 mm)挑入裝有2 mL 無菌水的滅菌離心管中,置于35~70 ℃(梯度5 ℃)的恒溫水浴鍋中水浴10 min(先預(yù)熱1 min)后取出冷卻至室溫[23]。將處理過的菌塊置于PDA 培養(yǎng)基平板中央,重復(fù)3 次,以28 ℃為對(duì)照(CK),連續(xù)7 d 觀察其生長(zhǎng)狀況,確定致死溫度范圍。在該范圍內(nèi)設(shè)置1 ℃溫度梯度重復(fù)以上試驗(yàn),確定致死溫度。
采用生長(zhǎng)速率法,比較楊柳炭疽菌(C.salicis)對(duì)上述26 種殺菌劑的敏感性,參照李潤(rùn)根[24]、陳宏州[25]等的方法配制成含藥培養(yǎng)基(表1)。在供試菌落邊緣打取5 mm 菌餅,轉(zhuǎn)接至PDA 平板中央,以不含藥劑的PDA 為對(duì)照,重復(fù)5 次。在相同條件下培養(yǎng)7 d 后,測(cè)菌落直徑,計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率并將其換算成抑制幾率值,運(yùn)用最小二乘法直接建立“濃度對(duì)數(shù)-幾率值”線性方程。采用Excel 2010 和SPSS 26.0 等軟件計(jì)算各殺菌劑的抑制中濃度(EC50)。
2.1.1 培養(yǎng)基對(duì)楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響在不同培養(yǎng)基上,C.salicis的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢差異顯著(圖1)。在SA 和PDA 上菌絲生長(zhǎng)速度快,菌落直徑顯著高于其他處理;而在Czapek、OA、YEA 和CPA 上菌絲生長(zhǎng)較快,菌落直徑略低于SA 和PDA;在MA、MS 以及RB 上菌絲生長(zhǎng)較慢,菌落直徑顯著低于其他處理,且RB 不利于菌落生長(zhǎng),菌落直徑最小。病原菌產(chǎn)孢最多的培養(yǎng)基為PDA,產(chǎn)孢較少的培養(yǎng)基為OA、YEA、SA、CPA、MS 和RB 上,不產(chǎn)孢的培養(yǎng)基為MA 和Czapek。
圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Fig. 1 Effects of culture media on mycelial growth and sporulation of C.salicis
2.1.2 碳氮源對(duì)楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響C.salicis對(duì)供試碳源的利用存在較大的差異(圖2)。以肌醇的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最好,菌落直徑顯著大于對(duì)照;在含有山梨醇、葡萄糖、淀粉、麥芽糖和果糖的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)較快;而以乳糖、蔗糖、甘油為碳源的培養(yǎng)基上,菌落直徑與對(duì)照差異不顯著。該菌在不同碳源的培養(yǎng)基上均能產(chǎn)孢,且與對(duì)照相比差異顯著。以葡萄糖和肌醇的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多,在含有山梨醇、麥芽糖、乳糖和蔗糖的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢次之,而以甘油和淀粉為碳源的產(chǎn)孢較少。
圖2 不同碳源對(duì)楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Fig. 2 Effects of carbon sources on mycelial growth and sporulation of C.salicis
C.Salicis對(duì)供試氮源的利用也存在較大差異(圖3)。牛肉膏是適合菌絲生長(zhǎng)的最佳氮源,其次為硝酸鉀和谷氨酸鈉,菌落直徑均顯著高于對(duì)照;在含有尿素、硝酸銨、蛋白胨和酵母膏的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢,菌落直徑與對(duì)照差異不顯著;而以硫酸銨為氮源不利于菌絲生長(zhǎng)。病原菌在含有蛋白胨的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多,與硝酸銨、硝酸鉀、牛肉膏和谷氨酸鈉相比未達(dá)到顯著水平,但均顯著高于對(duì)照的產(chǎn)孢量;在以硫酸銨和尿素為氮源的培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量與對(duì)照差異不顯著;而在含有酵母膏的培養(yǎng)基上,產(chǎn)孢受到抑制。
圖3 不同碳源對(duì)楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Fig. 3 Effects of nitrogen source on mycelial growth and sporulation of C.salicis
2.1.3 不同溫度對(duì)楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 如圖4 所示,溫度對(duì)C.salicis的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量均有顯著影響,在20~35 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)良好,其中菌絲生長(zhǎng)最快的是25 ℃,菌落直徑最大,且顯著高于其他處理;15 ℃和40 ℃時(shí)菌落生長(zhǎng)較慢,而在5 ℃和10 ℃時(shí)菌落幾乎不生長(zhǎng)。病原菌在20~30 ℃下產(chǎn)孢較多,其中在25 ℃下產(chǎn)孢最多,且顯著高于其他處理;在10、15、35 和40 ℃下產(chǎn)孢較少,其中40 ℃下產(chǎn)孢最少;而在5 ℃時(shí)不產(chǎn)孢。
圖4 不同溫度對(duì)楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Fig. 4 Effects of temperature on mycelial growth and sporulation of C.salicis
2.1.4 不同pH 值對(duì)楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 在不同pH 的培養(yǎng)基上,C.salicis的菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量如圖5 所示。該菌株在pH 值為4~12 范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)和產(chǎn)孢,pH 值為6~9 時(shí)菌株的生長(zhǎng)狀況和產(chǎn)孢較好,其中pH 值為7 時(shí)生長(zhǎng)狀況和產(chǎn)孢最佳;在pH 值為4~5 和10~12 時(shí)菌株的生長(zhǎng)狀況和產(chǎn)孢較差。
圖5 不同pH 對(duì)楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Fig. 5 Effects of pH on mycelial growth and sporulation of C.salicis
2.1.5 不同光照周期對(duì)楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響C.salicis在不同光周期培養(yǎng)下的菌落直徑和產(chǎn)孢量具有較大差異(圖6)。12 h/12 h(光/暗)交替培養(yǎng)有利于病原菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢,且顯著高于其他兩種光周期;在24 h 持續(xù)光照或黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)較慢,產(chǎn)孢量較少,且兩者差異不明顯。注:0 h,全黑暗;12 h,12 h 光照+12 h 黑暗;24 h,全光照 。
圖6 不同光照周期對(duì)楊柳炭疽菌的菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Fig. 6 Effects of photoperiod on mycelial growth and sporulation of C.salicis
Note:0 h,24 h in the dark;12 h,12 h light+12 h dark;24 h,all day under light exposure
2.1.6 病原菌的菌絲致死溫度測(cè)定C.salicis在35~55 ℃范圍內(nèi)水浴10 min,菌絲能夠生長(zhǎng)且產(chǎn)生菌落,但在60 ℃及以上條件下菌絲不生長(zhǎng),因此在55~60 ℃間將溫度梯度縮小為1 ℃進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn),結(jié)果在58 ℃水浴10 min 后菌絲不能正常生長(zhǎng),說明該菌的致死溫度為58 ℃水浴10 min。
室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明,26 種藥劑對(duì)C.salicis的生長(zhǎng)狀況均具有一定的抑制作用,隨著藥劑濃度的增加抑制作用增強(qiáng),且不同藥劑之間的抑制效果差異較大(圖7)。由表2 結(jié)果可知,在前20 種化學(xué)殺菌劑中,抑制效果最好的是10%苯醚甲環(huán)唑WG,EC50為0.60 mg·L-1;其次是325 g·L-1苯甲·嘧菌酯SC、430 g·L-1戊唑醇SC、60%唑醚·代森聯(lián)WG和75%肟菌·戊唑醇WG,EC50分別為3.652、4.418、6.347 和8.69 mg·L-1;46%氫氧化銅WG、25 g·L-1咯菌腈FS、30%吡唑醚菌酯SC、250 g·L-1嘧菌酯SC、40%腈菌唑SC、50%啶酰菌胺WG 和75%百菌清WP,EC50分別是22.615、30.451、30.846、44.844、48.978、55.106 和73.097 mg·L-1,70%甲基硫菌靈WP、15%三唑酮WP、250 g·L-1丙環(huán)唑EC、80%多菌靈WP、80%丙森鋅WP 和300 g·L-1苯甲·丙環(huán)唑EC,EC50分別為102.96、105.487、173.021、175.55、177.664和206.871 mg·L-1;抑菌效果較差的為80%代森錳鋅WP 和500 g·L-1異菌脲SC,其EC50高 達(dá)679.36 和1 012.521 mg·L-1。在后6 種生物殺菌劑中,0.3%丁子香酚SL 的抑制效果最好,EC50為1.151 mg·L-1;其次是3%中生菌素WP 和8%寧南霉素WA,其EC50分別是16.236 和90.615 mg·L-1;再次是6%春雷霉素WA 和6%寡糖·鏈蛋白WP,EC50分別是157.389 和187.284 mg·L-1;而抑菌效果較差的為20%乙蒜素EC,其EC50高達(dá)301.439 mg·L-1。
表2 26 種殺菌劑對(duì)病原菌的毒力測(cè)定Table 2 Toxicity of 26 individual fungicides on C.salicis
圖7 殺菌劑對(duì)楊柳炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)的抑制效果Fig. 7 Inhibitory effect of fungicides on C.salicis
炭疽菌屬真菌是重要的植物病原菌之一,能侵染多種植物不同部位,可引起世界范圍內(nèi)的多種病害[26-27],如小長(zhǎng)春花葉斑病[28]、擬南芥炭疽病[29]、草莓炭疽病[30]、柳樹炭疽病[31]和三色堇葉斑病[32]等,嚴(yán)重影響全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)展。葉斑病是青海櫻桃生產(chǎn)中常見的高發(fā)性真菌病害之一,嚴(yán)重影響櫻桃的產(chǎn)量和品質(zhì),造成較大經(jīng)濟(jì)損失。
本課題組通過對(duì)楊柳炭疽菌生物學(xué)特性的研究,發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)條件均能影響楊柳炭疽菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。試驗(yàn)表明,菌株在供試培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng),在除MA 和Czapek 外的培養(yǎng)基上均可產(chǎn)孢,且在PDA 和SA 上的菌絲生長(zhǎng)較快,在PDA 和OA上的產(chǎn)孢最多。在不同碳、氮源培養(yǎng)條件下,菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適碳源分別為肌醇和葡萄糖;最適氮源分別為牛肉膏和蛋白胨。此病原菌對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較廣,在5~40 ℃內(nèi)均能生長(zhǎng),其中最適溫度為25 ℃,但在溫度為5 ℃時(shí),菌落幾乎不生長(zhǎng),這與孫潔等[33]和楊佳文等[34]的研究結(jié)果相似。病原菌對(duì)培養(yǎng)基酸堿度有較強(qiáng)的適應(yīng)能力,在pH 為4~12 范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)和產(chǎn)孢,最適pH 值為7,但過酸過堿均不利于菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢,這與劉一賢等[10]對(duì)蘭生炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的生物學(xué)特性研究結(jié)果一致。該菌在3 種光周期下均可正常生長(zhǎng)與產(chǎn)孢,但最佳培養(yǎng)條件為光暗交替(12 h/12 h),說明該菌對(duì)光照的要求不高,這與秦健等[35]的研究結(jié)果相同。病原菌的致死溫度為58 ℃,水浴處理10 min。
本研究通過對(duì)櫻桃葉斑病楊柳炭疽菌的室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)26 種藥劑對(duì)C.salicis的生長(zhǎng)狀況均具有一定的抑制作用,隨著藥劑濃度的增加抑制作用增強(qiáng)。試驗(yàn)表明,在供試殺菌劑中,10%苯醚甲環(huán)唑的抑制效果最好,EC50為0.6 mg·L-1,說明三唑類殺菌劑對(duì)C.salicis的抑制效果較強(qiáng),這與馮思琪[36]對(duì)水稻胡麻葉斑病菌(Bipolaris oryzae)藥劑篩選的研究結(jié)果相同;0.3%丁子香酚作為一種綠色環(huán)保型植物源殺菌劑對(duì)楊柳炭疽菌引起的櫻桃葉斑病的防治效果明顯,EC50為1.151 mg·L-1。此外,325 g·L-1苯甲·嘧菌酯、430 g·L-1戊唑醇、60 %唑醚·代森聯(lián)和75 %肟菌·戊唑醇的原藥對(duì)櫻桃葉斑病菌毒力較強(qiáng),EC50分別為3.652、4.418、6.347 和8.69 mg·L-1,均小于10 mg·L-1;這與姜蘇月等[37]研究同屬的羽扇豆炭疽菌(Colletotrichum lupini)對(duì)殺菌劑敏感性中唑醚代森聯(lián)敏感性較高和鄧潔等[38]研究同屬的鉤藤博寧炭疽菌(Colletotrichum boninense)對(duì)殺菌劑的毒力測(cè)定中肟菌·戊唑醇具有較強(qiáng)的防效的結(jié)果基本相同。但本試驗(yàn)使用的藥劑中80%代森錳鋅、20%乙蒜素和500 g·L-1異菌脲防治效果不佳,這與孟珂等[39]研究同屬的薄殼山核桃炭疽菌(Colletotrichumspp.)對(duì)代森錳鋅的敏感性較差的結(jié)果一致。
本研究對(duì)青海省櫻桃葉斑病菌(C.salicis)的生物學(xué)特性進(jìn)行分析并選用26 種殺菌劑對(duì)其進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定,該試驗(yàn)結(jié)果可為青海櫻桃葉斑病的綜合防治提供參考。但由于藥劑試驗(yàn)是在室內(nèi)進(jìn)行,田間防治效果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。