顧建鋒，邵寶林，方亦午，馬欣欣,3，李星月，鄭經(jīng)武

（1.寧波海關技術中心/寧波檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 寧波 315100；2.成都海關技術中心，四川 成都 610041；3.中盛產(chǎn)品檢測有限公司，浙江 寧波 315100；4.四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，四川 成都 610066；5.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院，浙江 杭州 310012）

0 引言

【研究意義】馬鈴薯是世界上第三大、我國第四大糧食作物，是集糧食、蔬菜、飼料和工業(yè)原料于一身的優(yōu)勢作物。中國是世界馬鈴薯生產(chǎn)種植大國，四川種植面積則居我國首位，約73 萬hm2。2012 年至今，四川省馬鈴薯種植面積和總產(chǎn)連續(xù)全國第一，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)已經(jīng)逐漸成為四川省農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、農(nóng)民增收的一大支柱產(chǎn)業(yè)。近年來，四川省將馬鈴薯產(chǎn)業(yè)列為四川省特色優(yōu)勢農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)，大力推進馬鈴薯主糧化開發(fā)戰(zhàn)略，依靠得天獨厚的地理優(yōu)勢和健全的良種繁育體系，極大地推動了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。但在加強育種和外來品種引進力度的同時，馬鈴薯孢囊線蟲的傳入擴散風險也在加大。馬鈴薯孢囊線蟲的監(jiān)測研究對馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義?！厩叭搜芯窟M展】馬鈴薯孢囊線蟲主要包括馬鈴薯金線蟲（Globodera rostochiensisSkarbilovich，1959）[1]和馬鈴薯白線蟲（Globodera pallidaBehrans,1975）[2]，是嚴重威脅馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的重要病原線蟲，危害非常嚴重，是國際公認的最重要檢疫性有害生物，也是我國重要的進境植物檢疫性有害生物，2020 年被列入農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名錄》。據(jù)國外報道，馬鈴薯金線蟲一般會造成馬鈴薯減產(chǎn)20%，在熱帶地區(qū)，危害嚴重時造成產(chǎn)量損失80%～90%，甚至絕收[3]。為防止其傳入，長期以來我國一直禁止馬鈴薯種薯的商業(yè)引進，目前尚未批準任何食用馬鈴薯的輸入?！颈狙芯壳腥朦c】2021 年6 月，筆者在四川省越西縣發(fā)現(xiàn)馬鈴薯田塊部分植株較矮，葉片黃化，長勢較差，挖取植株根部，發(fā)現(xiàn)根系上有淡黃色至金黃色的球形孢囊，疑似馬鈴薯孢囊線蟲侵染。目前我國尚未發(fā)現(xiàn)馬鈴薯孢囊線蟲，因此亟需對該病原進行鑒定?！緮M解決的關鍵問題】對馬鈴薯孢囊線蟲進行分離和形態(tài)學、分子生物學鑒定，以期明確病原線蟲種類，為進一步開展馬鈴薯孢囊線蟲的監(jiān)測、鑒定和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采自越西縣竹阿覺鎮(zhèn)古二鄉(xiāng)馬鈴薯種植田塊（102°41′37.3″E；28°25′46.8″N；海拔2 315.1 m），種植的馬鈴薯為青薯9 號種，采集時間為馬鈴薯花期。針對馬鈴薯生長不良、矮化的田塊，多點采集根圍土壤混合樣品各約500 g，同時將馬鈴薯苗連根拔起，觀察并采集少許根系。

1.2 線蟲分離

土壤中的二齡幼蟲采用改良漏斗法（寧波市鎮(zhèn)海百川生物科技有限公司）進行線蟲分離。稱取土壤100 g，用雙層紗布包裹，置于加有適量水的漏斗中（水量以剛蓋沒土壤為宜），25 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，用表面皿接取5～10 mL 線蟲分離液，在Zeiss Stemi 305 解剖鏡下觀察是否有線蟲。

土壤中的孢囊采用簡易漂浮法分離。稱取風干土壤100 g，置于2 000 mL 的三角瓶中，加水至水深5 cm 左右后充分搖晃，隨后邊加水邊攪動，直至水面至瓶口處，靜置片刻。將瓶口的漂浮物通過20 目和100 目濾，將100 目篩上的收集物輕輕倒入有濾紙的漏斗中過濾。過濾完畢后取濾紙在解剖鏡下觀察孢囊并計數(shù)。

用解剖刀切破較新鮮的孢囊，可見其中有大量蟲卵。用移液器將適量蟲卵轉(zhuǎn)移到載玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕用手指按壓，部分蟲卵破碎，游離出來的線蟲即為孢囊線蟲二齡幼蟲（J2）。

1.3 形態(tài)學鑒定

1.3.1 孢囊陰門錐制作 將孢囊轉(zhuǎn)移到塑料培養(yǎng)皿上的水滴中，于解剖鏡下用解剖刀切下孢囊的后端（即頸部的對面一側）部分，用竹針或0 號狼毛筆輕輕剔除陰門錐內(nèi)的黏附物和卵，用解剖刀適當修整陰門錐的邊緣。然后取一片干凈的載玻片，在中間加一小滴甘油，在解剖鏡下用挑針將上述修整好的陰門錐移至甘油滴的中央，用挑針往下壓，使其外表面向上。在甘油滴兩邊對稱放置兩塊小蠟塊，加蓋玻片，于64 ℃的加熱板上加熱，待蠟塊融化后自然冷卻，用中性樹膠封片。

1.3.2 顯微鏡觀察攝影及測量 用Zeiss Imager Z1 顯微鏡和Axioscop MRm 數(shù)碼相機對J2、孢囊、陰門錐的整體形態(tài)和內(nèi)部特征進行觀察、攝影和測量。

1.4 根系內(nèi)部線蟲染色

馬鈴薯花期采集植株根系，采用幼苗根系次氯酸鈉——酸性品紅整體染色[4-5]。觀察根系內(nèi)部孢囊線蟲的侵染情況。

1.5 分子生物學鑒定

1.5.1 孢囊和幼蟲DNA 的提取 取分離得到的3 個孢囊和6 條二齡幼蟲，參照王江嶺等[6]的方法分別提取DNA，于-20 ℃保存待用。

1.5.2 種特異性PCR 鑒定 使用ITS5 和PITSr3 引物[7]對獲取的DNA 樣品進行PCR 擴增，反應同時設置一組陰性對照及一組空白對照，陰性對照的DNA 模板為大豆孢囊線蟲。反應體系（25 μL）：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL，25 mmol·L-1MgCl22 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mix 2 μL，10 μmol·L-1引物各0.5 μL，5 U·μL-1TaqDNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 補足。反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。進行PCR 擴增后將產(chǎn)物在添加Gelred 染料的1×TAE溶液制成1%的瓊脂糖凝膠電泳，以DL100 bp（TaKaRa）為Marker，用紫外凝膠成像儀觀察并照相，以確認擴增是否有效。擴增產(chǎn)物片段大小與Marker進行比較。剩余擴增產(chǎn)物送杭州擎科生物技術有限公司雙向測序。

1.5.3 線蟲核糖體基因擴增和測序分析 分別取單個孢囊和2 條二齡幼蟲的DNA 模板，采用核糖體rDNA 部分18S 基因擴增引物：988（5′-CTCAAAGA TTAAGCCATGC-3′）和 1912（5′-TTTACGGTCAG AACTAGGG-3′）；1813（5′-CTGCGTGAGAGGTG AAAT-3′）和2646（5′-GCTACCTTGTTACGACTTT T-3′）[8]，核糖體rDNA 28S 基因D2～D3 區(qū)擴增引物391A（5′-AGCGGAGGAAAAGAAACTAA -3′）和501（5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′）[9]，核糖體rDNAITS區(qū)擴增引物TW81（5′-GTTTC CGTAGGTGAACCTGC-3′）和AB28（5′-ATATGC TTAAGTTCAGCGGGT-3′）[10]，進行上述基因PCR擴增。上述引物由上海英駿生物技術有限公司合成，PCR 擴增程序參照各引物所在文獻[8-10]。進行PCR擴增后將產(chǎn)物在添加Gelred 染料的1×TAE 溶液制成1%的瓊脂糖凝膠電泳，以DL100 bp（TaKaRa）為Marker，用紫外凝膠成像儀觀察并照相，以確認擴增是否有效。18S 基因和28S 基因D2～D3 區(qū)擴增產(chǎn)物由杭州擎科生物科技有限公司進行雙向測序，ITS序列直接測序不能獲得有效序列，由上述公司進行克隆測序。

使用ChormasPro 軟件對測序得到的雙向峰圖文件進行拼接，剔除測序結果兩端多余堿基后，得到用于后續(xù)比對和系統(tǒng)進化分析的序列。登陸NCBI 網(wǎng)站中的BLAST（Basic local alignment search tool）頁面（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對。在GenBank 中下載已登錄的各近似種（球孢囊線蟲屬）的部分序列，在Clustal[11]的默認設置下進行序列比對，并在MEGA 軟件下使用p-distance 設置對所得序列及其近似類群進行兩兩序列相似度計算（Pairwise Distance）。

通過jModeltest 軟件[12]，以甜菜孢囊線蟲（Heterodera schachtiiMW834323）和大豆孢囊線蟲（Heterodera glycinesEF611124）為外群，對得到的序列比對文件在赤池信息量準則（Akaike information criterion，AIC）標準下進行核苷酸替換模型的評估，得到相應的支持模型。使用MrBayes 3.2.3 軟件[13]對得到的序列比對文件進行貝葉斯法系統(tǒng)進化樹的構建，根據(jù)所獲得的核苷酸替換模型，參照Ronquist等[13]的說明對程序做出設定。在4 條馬爾科夫鏈（Markov Chain）下獨立進行3 條熱鏈和1 條冷鏈的5× 107次運行，每1 000 次運行進行一次抽樣，剔除前25%可能未處于穩(wěn)態(tài)時的系統(tǒng)進化樹。采用多數(shù)一致（50%）原則，用MCMC（Markov Chain Monte Carlo）方法評估所獲得貝葉斯系統(tǒng)進化樹的后驗概率值[14]，在TreeGraph 2 軟件中對系統(tǒng)進化樹進行查看和編輯[15]。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀

采樣田塊馬鈴薯植株較矮，葉片黃化，長勢較差。拔起植株可看到部分根系上有淡黃色至金黃色的球形顆粒，為球孢囊屬線蟲的雌蟲或孢囊（圖1）。其數(shù)量較大，肉眼可見，多的有數(shù)百粒以上。

圖1 四川越西馬鈴薯金線蟲根部雌蟲和孢囊Fig. 1 Cyst and female adult of G.rostochiensis on potato roots from Yuexi,Sichuan

2.2 形態(tài)特征描述

100 g 風干土壤用漂浮法分離獲得孢囊100 多個，用改良漏斗法分離獲得大量孢囊線蟲二齡幼蟲，但未發(fā)現(xiàn)雄蟲。

雌蟲：蟲體近球形，具突出的頸部。白色至淡黃色。頭部具有融合的唇和1 或2 個明顯的唇片。頸部環(huán)紋不規(guī)則，大多數(shù)體壁變成網(wǎng)紋型脊，頭骨架發(fā)育弱?？卺樺F部約占口針長的50%，與桿部區(qū)別明顯，口針基部球向后傾斜，口針從頭架延伸到口針長約75%處。中食道球大，幾乎球形，瓣門呈新月形。排泄孔明顯，位于頸基部。雙卵巢充滿整個體腔。陰門橫裂，周圍角質(zhì)層輕微環(huán)形凹陷，形成陰門膜孔。陰門位于兩個細的唇突狀新月形區(qū)域之間。肛門與陰門膜孔間角質(zhì)層約有12 個平行的脊，少數(shù)交叉相連。

孢囊（圖2）：孢囊球形或近球形，頸部突出，尾部圓滑，無任何突起的圓錐體狀結構。其色澤金黃或黑褐色。表皮層具有“Z”字形的脊狀紋。陰門錐為單環(huán)膜孔型，無陰門橋、下橋和其他內(nèi)腺突，無泡狀突。卵存在于孢囊中，不形成卵囊。新鮮孢囊的陰門區(qū)完整，但較老的孢囊標本部分或全部陰門膜孔丟失。肛門明顯，不形成膜孔，有時可見“V”形結構。

圖2 四川越西馬鈴薯金線蟲孢囊及陰門錐Fig. 2 Cyst and cyst vulval basin of G.rostochiensis from Yuexi,Sichuan

二齡幼蟲（圖3）：分離得到各種線蟲的混合物。根據(jù)口針強壯、長約20 μm、基部球顯著膨大且為幼蟲的特點，容易將孢囊屬線蟲與其他各種線蟲區(qū)分。共計分離到孢囊屬線蟲二齡幼蟲約500 條，蠕蟲形，角質(zhì)層環(huán)紋規(guī)則，側區(qū)4 條側線。熱殺死后蟲體通常略腹彎，體長405～444 μm。頭部圓形，輕微縊縮，4～6 個環(huán)紋。口針強壯，長19.4～21.9 μm，口針基部球近圓形，略向后傾斜，前面較平，口針錐部約占口針長的50%。食道腺向后延伸至約35%體長處。排泄孔位于近尾部約20%體長處。半月體明顯，2 個體環(huán)長，位于排泄孔前1 個體環(huán)處。尾部漸變細，末端細圓，透明尾約占尾長的1/2。

圖3 四川越西馬鈴薯金線蟲卵和二齡幼蟲Fig. 3 Eggs and J2s of G.rostochiensis from Yuexi population

2.3 二齡幼蟲（J2）和孢囊形態(tài)測量值

對四川越西群體20 條J2 和15 個孢囊進行測計，并與國外馬鈴薯金線蟲參考文獻的資料進行比較，結果見表1。

表1 四川越西群體孢囊線蟲樣品與國外馬鈴薯金線蟲測計值比較Table 1 Morphometrics of cyst and J2 of Yuexi and foreign G.rostochiensis

四川越西群體的孢囊呈球形、金黃色，陰門膜孔之間角質(zhì)層脊數(shù)15～24 個，Granek 比值為2.7～4.7，二齡幼蟲口針長度19.4～21.9 μm，口針基部球近圓形、略向后傾斜、前面較平，DGO 距離3.0～5.2 μm，透明尾長17.7～25.0 μm。上述特征或測計值均與馬鈴薯金線蟲相符。

2.4 根系內(nèi)部線蟲染色結果

經(jīng)根系透明染色后，可觀察到根內(nèi)有大量線蟲寄生，呈粉紅色（圖4），其體長約400 μm，體寬略短于20 μm，和表2 中的測計值相符。進一步形態(tài)特征觀察表明其與上述孢囊線蟲二齡幼蟲一致，因此該種線蟲能入侵馬鈴薯根系內(nèi)部。

圖4 馬鈴薯根系內(nèi)染色后的二齡幼蟲Fig. 4 Stained J2s on potato roots

2.5 線蟲的分子生物學鑒定

2.5.1 特異性引物擴增 特異性引物擴增后，所測試的3 個孢囊和4 條二齡幼蟲均得到了430 bp 左右的明亮條帶（圖5），和預期的434 bp 馬鈴薯金線蟲種特異條帶大小相一致。進一步測序后得到的序列長度均為434 bp，blast 比對分析發(fā)現(xiàn)，和Genbank 數(shù)據(jù)庫中的馬鈴薯金線蟲序列相似度為100%。

圖5 四川越西馬鈴薯金線蟲樣品特異PCR 電泳圖Fig. 5 Specific PCR electrophoresis of G.rostochiensis from Yuexi population

2.5.2 核糖體基因DNA 序列分析 對該四川越西分離得到的線蟲群體進行核糖體rDNA 18S 區(qū)基因擴增測序，3 個模板獲得的片段大小均為1 740 bp，GenBank登錄號為MZ613180。該四川越西群體和其他國家和地區(qū)所報道的馬鈴薯金線蟲群體18S 基因序列相似度為 99.41%（AY593877 1 696/1 701 bp）～ 99.94%（KJ636271 1 700/1 701 bp），和其他馬鈴薯白線蟲的序列相似度為99.53%（Globodera pallidastrain GlobPal10 KJ636269）～99.77%（Globodera pallidaisolate GlobPal3 AY284620），和其他球孢囊屬線蟲的序列相似度為99.12%（Globodera achilleaestrain GlobAch2 KJ636274）～100%（Globodera tabacumisolate 1094 FJ040401 1 701/1 701 bp）。因此，核糖體rDNA 18S 區(qū)基因無法準確區(qū)分球孢囊屬具體種類，但能明確該群體屬于球孢囊屬。

該群體的核糖體28S 區(qū)基因擴增測序所得片段大小均為953 bp，GenBank 登錄號為MZ613167。該類群和其他國家和地區(qū)所報道的馬鈴薯金線蟲群體28S 基因序列相似度為 99.06%（AY592987 947/956 bp）～ 100%（MK311333 953/953 bp），和馬鈴薯白線蟲（G.pallida）的28S 序列相似度為97.59%（EU855119 932/955 bp）至 98.89%（LT159821 711/719 bp）；和艾草球孢囊線蟲（G.artemisiae）的28S 序列相似度為98.01%（EU855121 937/956 bp）～98.19%（MT233316 702/720 bp）；和煙草球孢囊線蟲（G.tabacum）的28S序列相似度為99.40%（GQ294492）。同樣，核糖體rDNA 28S 區(qū)基因無法準確區(qū)分球孢囊屬一些種類，但能明確該四川越西群體屬于球孢囊屬。

該群體的核糖體ITS區(qū)基因擴增產(chǎn)物直接測序失敗，經(jīng)克隆測序后，得到2 條序列，長度分別為1 040 bp 和1 041 bp，GenBank 登錄號為MZ613152 和MZ613153，兩序列相似度為99.33%（1 035/1 041 bp）。該四川越西群體和其他國家和地區(qū)所報道的馬鈴薯金線蟲群體ITS基因序列相似度最高，為 97.90%（JF907553 981/1 002 bp）～ 99.90%（GQ294513 1 040/1 041 bp），同時和其系統(tǒng)發(fā)育關系中的煙草球孢囊線蟲的序列相似度為 97.26%（FJ667945 924/950 bp）～ 97.90 %（GQ294525 1 024/1 045 bp），和 馬鈴薯白線蟲的序列相似度最高為 96.5%（LT159833）。從系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）上可以看出，該四川越西群體和其他國家和地區(qū)所報道的馬鈴薯金線蟲群體（源于NCBI 網(wǎng)站）聚類在了具高置信度（后驗證概率=100）同一分支，表明該四川越西群體確為馬鈴薯金線蟲。

圖6 基于四川越西馬鈴薯金線蟲與近似種ITS 區(qū)DNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 ITS phylogenetic tree of G.rostochiensis from Yuexi population and similar Globodera species

2.6 鑒定結論

孢囊屬線蟲屬于孢囊線蟲亞科，該科常見的有球孢囊線蟲屬線蟲Globodera、刻點孢囊線蟲屬線蟲Punctodera、仙人掌孢囊線蟲屬線蟲Cactodera、孢囊線蟲屬線蟲Heterodera[19]。刻點孢囊線蟲屬孢囊呈卵形、肛門區(qū)域形成膜孔；仙人掌孢囊線蟲屬孢囊呈檸檬形、有簡化的陰門錐；孢囊屬線蟲呈檸檬形、有突出的陰門錐；而球孢囊屬線蟲孢囊呈球形、無陰門錐、肛門區(qū)不形成膜孔，可與近似屬明顯區(qū)分。該四川越西線蟲群體孢囊呈球形、無陰門錐、肛門區(qū)不形成膜孔，明顯為球孢囊屬線蟲。

據(jù)Subbotin 等[19]報道，球孢囊屬線蟲包括10 種線蟲。此后，2012 年美國Idaho 州發(fā)現(xiàn)艾靈頓氏球孢囊線蟲G.ellingtonae[20]，2013 年，南非雜草上發(fā)現(xiàn)西開普敦球孢囊線蟲G.capensi[21]，2017 年南非發(fā)現(xiàn)厄加勒斯球孢囊線蟲G.agulhasensis[22]，在南非雜草上又發(fā)現(xiàn)桑德維爾德球孢囊線蟲G.sandveldensis[23]。因此，目前已經(jīng)報道的球孢囊屬線蟲共計14 種[23,24]。據(jù)Subbotin 等[19]的檢索表，G.mali孢囊角質(zhì)層薄、透明；G.zelandica二齡幼蟲口針平均長度≥27 μm；G.leptonepia二齡幼蟲口針平均長度＜19 μm；G.bravoae二齡幼蟲透明尾長＞31 μm 。G.capensis、G.millefolii、G.artemisiae、G.agulhasensis、G.sandveldensis等5 種線蟲大多寄生于菊科植物，Granek 比值平均值≤2。因此待測樣品很容易與上述9 種線蟲區(qū)分。四川越西群體與煙草孢囊線蟲G.tabacum的區(qū)別是肛門和陰門膜孔之間角質(zhì)層脊數(shù)[18（15～24）個vs 7（5～15）個]；和G.ellingtonae的區(qū)別是肛門和陰門膜孔之間角質(zhì)層脊數(shù)[18（15～24）個 vs 13（10～18）個]；與墨西哥孢囊線蟲G.mexicana的區(qū)別是Granek 比值：平均3.7 vs 2.8。

根據(jù)寄主和形態(tài)特征，四川越西孢囊線蟲群體容易與其他線蟲進行區(qū)分，最相似的為馬鈴薯白線蟲。與馬鈴薯白線蟲的區(qū)別是雌蟲和孢囊顏色（雌蟲白色逐漸變黃，變成金黃或褐色的孢囊vs 雌蟲白色，變成褐色的孢囊），J2 體長略短（405.0～443.5 μm vs 440～525 μm），J2 口針長略短[20.2（19.4～21.9）μm vs 23.6（21～26）μm]，J2 尾長略短[46.8（40.0～51.0）μm vs 51.9（46～52）μm]，J2 口針基部球形態(tài)（近圓形、略向后傾斜、前面較平vs 前表面向前突起），肛門和陰門膜孔之間角質(zhì)層脊數(shù)[18（15～24）個vs 12.2（8～20）個]，肛門至膜孔距離（43～76 μm vs 88～102 μm），Granek比值[3.7（2.7～4.7）vs 2.2（1.2～3.6）][3,25]。

該四川越西線蟲群體與馬鈴薯金線蟲形態(tài)學基本一致。特異PCR 方法、核糖體DNA 序列分析，尤其是其ITS基因序列與已經(jīng)登錄的馬鈴薯金線蟲十分近似，相似度高達99.9%，且與馬鈴薯白線蟲的相似度最高只有96.5%。因此，形態(tài)學和分子生物學方法均支持該線蟲為馬鈴薯金線蟲。

3 討論與結論

馬鈴薯金線蟲為害隱蔽，潛伏期長，侵染早期植株沒有明顯的癥狀，僅通過田間觀察很難確認是否有該線蟲為害。嚴重危害時，能導致寄主黃化、壞死、萎蔫、矮化甚至死亡，但上述癥狀與缺水缺肥等癥狀很難區(qū)分，常常需要采集土壤和根系樣品，在實驗室進行孢囊或幼蟲的分離鑒定。鏡檢觀察孢囊呈球形、無陰門錐、肛門區(qū)不形成膜孔，可判斷該線蟲屬于球孢囊屬；再根據(jù)二齡幼蟲口針基部球近圓形，向后傾斜；口針平均長＜23 μm；Granek比值≥3，可判斷為馬鈴薯金線蟲。

線蟲體型微小，鑒定特征十分細微，形態(tài)學鑒定需要豐富的經(jīng)驗。因此，分子生物學方法是線蟲鑒定的重要輔助手段。根據(jù)EPPO[25]的方法，本研究采用Bulman &Marshall[7]報道的馬鈴薯金線蟲特異性引物ITS5 和PITSr3 對線蟲孢囊或二齡幼蟲進行PCR 擴增，電泳和測序結果表明，擴增產(chǎn)物為434 bp，與報道的馬鈴薯金線蟲特征片段完全一致。同時，本研究對四川越西群體核糖體rDNA 18S、rDNA 28S 和ITS基因進行克隆、測序和分析發(fā)現(xiàn)，該群體18S 和28S 序列與馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的序列相似度均較高，但難以區(qū)分具體種類，僅可以確定該線蟲屬于球孢囊屬線蟲。核糖體ITS基因序列分析表明，該種線蟲和國外報道的馬鈴薯金線蟲群體ITS基因序列相似度最高，系統(tǒng)發(fā)育樹結果也表明該群體和其他國家和地區(qū)所報道的馬鈴薯金線蟲群體聚類在了具高置信度（后驗證概率=100）同一分支，證實四川越西群體確為馬鈴薯金線蟲。因此，ITS基因作為分子靶標在球孢囊線蟲的種類鑒定中較為有效，推薦用特異性PCR 方法或ITS基因?qū)︸R鈴薯金線蟲進行分子鑒定。

隨著經(jīng)濟全球化和國際貿(mào)易的日趨頻繁，馬鈴薯金線蟲已經(jīng)隨馬鈴薯種質(zhì)資源等的私人攜帶、交換或其他根系材料的引種而傳入我國。李建中等[26]用生態(tài)位模型GARP 和MaxEnt 對馬鈴薯金線蟲和白線蟲在我國的適生區(qū)進行了分析，結果表明，云南東北部、貴州、重慶、四川東部、湖南、湖北南部、山東南部、河南、安徽和江蘇等省市為馬鈴薯金線蟲中高風險區(qū)。由于該線蟲在我國具有適生區(qū)域廣、防控難度大、潛在危害損失高和社會影響巨大等特點，一旦傳入和定殖擴散，根除十分困難。在沒有寄主作物的情況下，其孢囊能在土壤中存活20 年以上[27]。因此建議在疫情發(fā)生區(qū)域采取嚴格的應急控制措施，力爭消滅，同時在疫情周圍及高風險區(qū)域設立監(jiān)測點，嚴控疫情點的馬鈴薯和其他根莖類材料的跨區(qū)域調(diào)運，嚴防疫情擴散。鑒于馬鈴薯金線蟲的為害經(jīng)濟重要性，需盡快完善馬鈴薯孢囊線蟲疫情監(jiān)測及防控技術體系，加強馬鈴薯種薯的檢疫監(jiān)督管理，開展馬鈴薯金線蟲全國普查，增加馬鈴薯金線蟲防控技術的研發(fā)投入，為我國馬鈴薯主糧化產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展保駕護航。