1,2,4-三唑酰胺類轉(zhuǎn)酮醇酶抑制劑的合成及除草活性研究

戴龍濤，魏汐宇，曾 榮，楊冬臣，王彥恩,，張金林

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院,河北 保定 071001）

自1941 年合成第一個(gè)除草劑2,4-D 以來(lái)，除草劑的使用在農(nóng)作物生產(chǎn)中發(fā)揮了重要的作用，從此，氯代苯氧乙酸類化合物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)開創(chuàng)了有機(jī)除草劑工業(yè)的新紀(jì)元。從20 世紀(jì)50 年代到90 年代，共發(fā)現(xiàn)約20 種現(xiàn)有商品化除草劑靶標(biāo)酶［1］，基于這些酶開發(fā)了眾多商品化除草劑。例如，PPO 抑制劑類除草劑［2］，AHAS 抑制劑類除草劑［3］，HPPD抑制劑類除草劑［4-5］等。但是，迄今為止，近30 年還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)真正意義的新作用靶標(biāo)除草劑［6］，目前新除草劑的生物合理設(shè)計(jì)主要還是基于現(xiàn)有已知的商品化除草劑靶標(biāo)酶，從而獲得具有除草活性的新化合物［7-8］。

由于長(zhǎng)期頻繁使用同一品種或相同靶標(biāo)的除草劑，雜草對(duì)現(xiàn)有除草劑產(chǎn)生了嚴(yán)重地抗性，導(dǎo)致藥效降低和使用劑量增大，并且造成惡性循環(huán)［9-10］，雖然基于現(xiàn)有已知的商品化除草劑靶標(biāo)酶，可以開發(fā)一些新的除草劑品種，但是由于其作用位點(diǎn)的局限性，勢(shì)必加劇雜草抗性的惡化；通過(guò)混用、減少使用頻率等措施僅能延緩這一過(guò)程，只有不斷發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)和以新靶標(biāo)開發(fā)結(jié)構(gòu)新穎的除草劑才是解決雜草抗性的有效途徑［11-12］。

轉(zhuǎn)酮醇酶是植物碳代謝和卡爾文循環(huán)中一個(gè)重要的酶［13］，是植物光合速率的最大限制因子，在植物的光合作用中發(fā)揮著重要作用。一旦轉(zhuǎn)酮醇酶活性受到抑制，則依賴于轉(zhuǎn)酮醇酶的底物和產(chǎn)物的卡爾文循環(huán)、淀粉和蔗糖的合成、莽草酸鹽途徑和苯丙素代謝都將受到抑制。Henkes 等研究表明轉(zhuǎn)酮醇酶可以作為除草劑靶標(biāo)開發(fā)新型除草劑［14］。Zhao 等明確了轉(zhuǎn)酮醇酶是一種新除草劑作用靶標(biāo)［15-16］，能夠以此酶為靶標(biāo)設(shè)計(jì)合成新型除草活性化合物。但是，目前具有良好除草活性的轉(zhuǎn)酮醇酶抑制劑還很少［17-19］，因此，以轉(zhuǎn)酮醇酶為靶標(biāo)開發(fā)更高活性、結(jié)構(gòu)新穎的新型除草劑具有重要的研究意義。

本課題組一直致力于開發(fā)以轉(zhuǎn)酮醇酶為靶標(biāo)的除草活性化合物的研究，最近，本課題組研究發(fā)現(xiàn)了一種具有高效除草活性的1,2,4-三唑席夫堿類轉(zhuǎn)酮醇酶抑制劑5aw［7］，熒光淬滅研究表明，化合物5aw 與轉(zhuǎn)酮醇酶之間形成了穩(wěn)定受體-配體絡(luò)合物，進(jìn)而導(dǎo)致化合物對(duì)轉(zhuǎn)酮醇酶具有更強(qiáng)的抑制作用［7,20］。

本研究采用骨架躍遷策略和活性亞結(jié)構(gòu)拼接方法對(duì)先導(dǎo)化合物5aw 進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，在保留5aw 核心骨架不變得情況下，通過(guò)酰胺鍵和硫醚鍵將1,2,4-三唑、噻吩、嘧啶、苯氧乙酸等活性基團(tuán)拼接，設(shè)計(jì)合成了系列1,2,4-三唑酰胺類除草活性化合物8(a-e)。以雙子葉雜草反枝莧和單子葉雜草馬唐為供試植物，采用小杯法測(cè)試目標(biāo)化合物的除草活性，然后利用熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究化合物對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)酮醇酶的抑制活性，以期篩選出更高活性和更高選擇性的轉(zhuǎn)酮醇酶抑制劑類除草活性化合物，為開發(fā)出新型除草劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

BRUKER AC-P400(400 MHz）核磁共振波譜儀（CDCl3 或DMSO-d6 為溶劑，TMS 為內(nèi)標(biāo)）；FTICR-MS (Ionspec 7.0T)型質(zhì)譜儀，ESI 離子源；北京瑞利公司生產(chǎn)WQF510/520A 傅立葉變換紅外光譜儀；深圳環(huán)宇測(cè)技術(shù)有限公司 X-4 精密顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀，上海黎鑫科學(xué)儀器有限公司；RF-5301PC 熒光分光光度計(jì)，試驗(yàn)過(guò)程中所用其他化學(xué)試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

供試雜草：反枝莧（Amaranthus retroflexus）和馬唐（Digitaria sanguinalis）均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥系提供。

1.2 目標(biāo)化合物的合成

將噻吩-3-甲酸甲脂1 與水合肼發(fā)生酰胺化反應(yīng)生成噻吩-3-酰肼2，在氫氧化鉀的乙醇溶液中與CS2反應(yīng)，粗產(chǎn)物繼續(xù)與水合肼發(fā)生反應(yīng)，得到4-氨基-5-巰基化合物3。將3 與2-氯-嘧啶4 發(fā)生親核取代反應(yīng)，粗產(chǎn)物通過(guò)柱層析法分離純化得到化合物5。然后中間體5 與酰氯化合物7 發(fā)生酰胺化反應(yīng)，通過(guò)柱純化得到目標(biāo)化合物8(a-e)。具體合成步驟如下（見(jiàn)圖1）：

圖1 1,2,4-三唑酰胺類除草活性化合物8(a-e)的合成路線Fig. 1 Synthesis route of 1,2, 4-triazolamides herbicidal active compound 8(a-e)

1.2.1 噻吩-3-酰肼2 的合成 3-噻吩甲酸甲酯1（0.5 mL，0.004 1 mol）與0.60 mL 的 80%水合肼在回流狀態(tài)下發(fā)生反應(yīng)， TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)約5 h 后，停止反應(yīng)，冷卻至室溫，減壓旋蒸除去剩余水合肼，干燥，得到粗產(chǎn)品即為噻吩-3-酰肼2，收率100%。

1.2.2 4-氨基-5-巰基化合物3 的合成 在（0.46 g，0.008 2 mol）KOH 的無(wú)水乙醇溶液中，加入0.004 1 mol 芳（雜）環(huán)酰肼2，在冰浴條件下，向上述溶液中逐滴滴入（0.74 mL，0.012 3 mol）CS2溶液，加熱升溫至回流，TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)結(jié)束后，減壓旋蒸溶劑，粗產(chǎn)品為芳（雜）環(huán)-3-惡二唑巰基的鉀鹽，將此鉀鹽在3 mL 80%水合肼溶液中回流，反應(yīng)約4 h， 然后，將反應(yīng)液倒入200 mL 冰水中溶解，使用10% HCl 調(diào)節(jié)溶液pH≈5，生成黃色沉淀，減壓抽濾，所得固體在真空干燥箱干燥，得到4-氨基-5-巰基-1, 2, 4-三唑類化合物3，收率82%。

1.2.3 中間體5 的合成 取干燥的燒瓶，依次加入適量的乙二醇甲醚溶劑，（634 mg，0.003 2 mol）化合物3，（0.366 4 g，0.003 2 mol）2-氯嘧啶和（0.89 mL，0.006 4 mol）三乙胺，加熱至回流反應(yīng)，TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)至結(jié)束，加入100 mL 的二氯甲烷溶解，使用飽和食鹽水洗滌，萃取分離，無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)層，減壓抽濾，減壓旋蒸溶劑，粗產(chǎn)品用柱層析法純化，得到目標(biāo)產(chǎn)物5，洗脫劑配比為二氯甲烷∶乙酸乙酯=30 ∶1，收率70%。

1.2.4 目標(biāo)化合物8(a-e)的合成 在冰浴條件下，將一定體積的氯化亞砜，逐滴滴入苯氧乙酸6(a-e)的無(wú)水乙腈溶液中，然后，加熱至回流反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，生成苯氧乙酰氯，旋蒸除去溶劑；然后，在冰浴條件下，將苯氧酰氯7(a-e)的無(wú)水二氯甲烷溶液，逐滴滴入到三乙胺和DMAP 的無(wú)水二氯甲烷溶液中，室溫條件下，TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)液加入約100 mL 的二氯甲烷溶劑，使用飽和食鹽水洗滌（75 mL×3），萃取分離，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓抽濾，減壓旋蒸溶劑，粗產(chǎn)品進(jìn)一步柱層析，提純得到目標(biāo)化合物8(a-e)，洗脫劑配比為石油醚∶乙酸乙酯=5∶1 ～3∶1。

1.3 采用小杯法測(cè)試化合物的除草活性

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法［7,18］，采用小杯法測(cè)試化合物的生物活性，馬唐和反枝莧為供試植株。以DMF為溶劑，分別將目標(biāo)化合物8(a-e) 和丙炔氟草胺（陽(yáng)性對(duì)照）配成濃度為20 g/L 的供試物儲(chǔ)備液。取0.01 mL 的供試物儲(chǔ)備液用滅菌水稀釋至1 mL，配成濃度為200 mg/L 的待測(cè)溶液，空白對(duì)照是不含藥劑的空白溶液。

將供試植物反枝莧和馬唐種子清水浸泡24 h，置于25 ℃培養(yǎng)箱中催芽至露白，選取大小一致的種子10 顆置于小燒杯中。移取1 mL 供試物溶液或空白對(duì)照溶液緩緩加入到小燒杯中，用保濕膜覆蓋小燒杯并在保濕膜上隨機(jī)扎孔，以保證透氣性。將小燒杯置于24 ～ 26 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7 d 后測(cè)定供試植株的根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)，評(píng)價(jià)目標(biāo)化合物對(duì)馬唐和反枝莧的抑制活性。

1.4 熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)

為了研究這些目標(biāo)化合物對(duì)TK 酶的抑制活性，在0.01 mol/L DMF/磷酸鹽緩沖液(PBS)中進(jìn)行化合 物(c= 0 ～ 20 mg/L) 與At TKL (0.35 mg/mL) 的熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)，并在F-4500 熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行。在比色皿中加入轉(zhuǎn)酮醇酶蛋白 2 mL，逐滴向比色皿中加入 2 μL 事先配置好的一定濃度的化合物溶液，混合均勻，并于恒溫水浴中恒溫 2 min，然后迅速進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)的測(cè)量，轉(zhuǎn)酮醇酶的熒光猝滅實(shí)驗(yàn)于250 nm 激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)，最大發(fā)射波長(zhǎng)為336 nm，記錄 250 ～450 nm 波長(zhǎng)范圍的熒光光譜，激發(fā)與發(fā)射狹縫均為 5 nm。試驗(yàn)前，所有反應(yīng)組分在30 ℃下預(yù)平衡20 min；最后使用 Origin 軟件擬合求熒光結(jié)合常數(shù) Ka 值。根據(jù)Ka 值大小和熒光強(qiáng)度或峰位移變化，初步分析化合物與轉(zhuǎn)酮醇酶的相互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)表征

本試驗(yàn)基于除草劑新靶標(biāo)轉(zhuǎn)酮醇酶，根據(jù)農(nóng)藥分子合理設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)合成5 個(gè)1,2,4-三唑酰胺類化合物8(a-e)，所有化合物均經(jīng)IR、MS 和1H NMR 分析驗(yàn)證，其理化數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)表征如下（見(jiàn)表1）：

表1 1,2,4-三唑酰胺類除草活性化合物8(a-e)結(jié)構(gòu)Table 1 Structure of 1,2, 4-triazolamide herbicidal active compounds 8(a-e)

化合物8a，淡黃色固體，產(chǎn)率26.6%, m.p. :199.1 ～200.0 ℃;1H NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 8.53 -8.52 (m, 1H), 7.69 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.54 (dd,J = 4.2 Hz, 2H), 7.02-6.92 (m, 7H), 4.76 (s, 2H); IR(KBr) ν: 3381 (N-H), 1638 (C ＝O) cm-1; MS (ESI)m/z 429.06 ([M+H]+)。

化合物8b，淡黃色固體，產(chǎn)率12.0%, m.p.:204.9 ～205.5 ℃;1H NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 8.52 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 7.54(dd, J = 3.2 Hz, 2H), 7.45-6.95 (m, 3H), 4.76 (s, 2H);IR (KBr) ν: 3385 (N-H), 1636 (C ＝O) cm-1; MS(ESI) m/z 478.96 ([M+H]+)。

化合物8c，淡黃色固體，產(chǎn)率21.9%, m.p. :204.9 ～205.3 ℃;1H NMR ((CD3)2SO, 400 MHz):δ 8.43-8.42 (m, 2H), 7.71-7.69 (m, 2H), 7.62-7.61(m, 2H), 7.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.82-6.76 (m, 2H),5.74 (s, 2H), 1.23 (s, 9H); IR (KBr) ν: 3384 (N-H),1639 (C ＝O) cm-1; MS (ESI) m/z 467.57 ([M+H]+)。

化合物8d，淡黃色固體，產(chǎn)率24.8%, m.p. :194.3 ～195.1 ℃;1H NMR ((CD3)2SO, 400 MHz):δ 8.43 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 7.70-7.61 (m, 5H), 7.29(d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.82 (s,2H); IR (KBr) ν : 3385 (N-H), 1636 (C ＝O) cm-1;MS (ESI) m/z 468.06 (［M+Na］+)。

化合物8e，淡黃色固體，產(chǎn)率44.4%, m.p. :187.6 ～189.0 ℃;1H NMR ((CD3)2SO, 400 MHz):δ 8.44-8.43 (m, 1H), 7.69-7.61 (m, 8H), 7.29 (t, J =8.0 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.82 (s, 2H); IR(KBr) ν: 3383 (N-H), 1637 (C ＝O) cm-1; MS (ESI)m/z: 433.10 ([M+Na]+)。

2.2 小杯法測(cè)定目標(biāo)化合物的除草活性

采用小杯法測(cè)試了化合物8(a-e)對(duì)雙子葉雜草反枝莧和單子葉雜草馬唐的除草活性，以商品化除草劑丙炔氟草胺為陽(yáng)性對(duì)照。如表2 所示，在濃度為200 mg/L 時(shí)，化合物8(a-e)對(duì)反枝莧和馬唐的根莖抑制率都大于80%，表明它們對(duì)反枝莧和馬唐具有良好的除草活性，其中，化合物8b 和8d 具有最好的除草活性，對(duì)反枝莧和馬唐的根莖抑制率達(dá)到90%以上，具有比丙炔氟草胺更優(yōu)異的除草活性，尤其是8b 對(duì)馬唐和反枝莧的根莖抑制率達(dá)到了95%以上，在所有化合物中具有最高的除草活性。根據(jù)除草活性測(cè)試結(jié)果，對(duì)目標(biāo)化合物的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明R1和R2取代基對(duì)化合物的除草活性具有很明顯的影響，不同取代基化合物的除草活性順序如下：2,4-Cl＞4-Cl＞4-F＞4-(CH3)3＞H。所設(shè)計(jì)的目標(biāo)化合物具有良好的除草活性，1,2,4-三唑酰胺分子骨架適用于除草活性分子設(shè)計(jì)，氯原子取代基更有利于提高化合物的除草活性。

表2 目標(biāo)化合物8 (a-e)的除草活性(小杯法，抑制率/%)Table 2 Structure and herbicidal activity of compounds 8(a-e) at 200 mg/L(small cup method,inhibition rate%)

2.3 熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)

為了研究目標(biāo)化合物對(duì)轉(zhuǎn)酮醇酶的抑制活性，在0.01 mol/L DMF/PBS 混合溶液中測(cè)試了擬南芥轉(zhuǎn)酮醇酶與化合物8b，8d 和8e 的熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)，其中擬南芥轉(zhuǎn)酮醇酶的濃度固定為 0.35 g/L, 隨后逐漸增大目標(biāo)化合物的濃度(c = 0 ～20 mg/L)。如圖2所示，在加入目標(biāo)化合物之前，擬南芥轉(zhuǎn)酮醇酶呈現(xiàn)了較強(qiáng)的熒光，當(dāng)在上述溶液中分別加入化合物8b，8d 和8e 后，體系的熒光強(qiáng)度會(huì)發(fā)生不同程度的降低，隨著溶液中化合物的濃度逐漸增大，熒光強(qiáng)度降低更加顯著。

圖2 擬南芥轉(zhuǎn)酮醇酶（0.35 mg/mL）與不同濃度化合物結(jié)合的熒光光譜變化（λex = 250 nm, λem = 336 nm）Fig. 2 Fluorescence spectra change of At TK (0.35 mg/mL) with different concentrations of compound (λex = 250 nm, λem = 336 nm)

當(dāng)在體系中分別加入相同量的化合物8b，8d 時(shí)，轉(zhuǎn)酮醇酶的熒光強(qiáng)度會(huì)發(fā)生顯著的降低，這表明化合物8b，8d 與擬南芥轉(zhuǎn)酮醇酶具有更強(qiáng)的親和力，這可能是由于它們分別與轉(zhuǎn)酮醇酶形成了更穩(wěn)定的絡(luò)合物，所以能夠更強(qiáng)結(jié)合轉(zhuǎn)酮醇酶。但是，當(dāng)在體系中加入相同量化合物8e 時(shí)，轉(zhuǎn)酮醇酶的熒光強(qiáng)度降低程度較小，表明化合物8e 與轉(zhuǎn)酮醇酶親和力較弱，與此酶發(fā)生了弱結(jié)合?；衔?b，8d 與轉(zhuǎn)酮醇酶形成了更穩(wěn)定絡(luò)合物，進(jìn)一步導(dǎo)致它們對(duì)此酶產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制活性和更強(qiáng)的結(jié)合親和力［7,20］，并且化合物8b，8d 對(duì)測(cè)試雜草具有最高的除草活性，因此，化合物8b 和8d 有潛力作為新型轉(zhuǎn)酮醇酶抑制劑類除草活性先導(dǎo)化合物，可以繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

3 討論與結(jié)論

雜環(huán)類化合物具有毒性低、活性高、用量少、選擇性好等特點(diǎn)［12,21］，被廣泛應(yīng)用于新農(nóng)藥創(chuàng)制,其中噻吩、1,2,4-三唑、嘧啶都是非常重要的雜環(huán)，例如，壬基氯是一種含有噻吩部分的除草劑，能夠有效防除水稻、大豆和其他作物農(nóng)田的多種雜草［23］。酰胺和硫醚是具有良好生物活性的官能團(tuán)［7,17］，因此，本研究基于除草劑新靶標(biāo)轉(zhuǎn)酮醇酶，根據(jù)農(nóng)藥分子合理設(shè)計(jì)原理對(duì)前期發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)酮醇酶抑制劑5aw 進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化，通過(guò)酰胺鍵和硫醚鍵將噻吩、嘧啶、苯氧乙酸等活性亞結(jié)構(gòu)拼接，設(shè)計(jì)合成了5個(gè)1,2,4-三唑酰胺類化合物8(a-e)。在化合物的合成過(guò)程中，酰氯中間體化學(xué)性質(zhì)極為活潑，與含有質(zhì)子氫的物質(zhì)接觸就會(huì)立即發(fā)生反應(yīng)，因此，中間體酰氯與胺類化合物必須在無(wú)水二氯甲烷或乙腈等非質(zhì)子性溶劑中發(fā)生反應(yīng)，才能合成得到目標(biāo)化合物1,2,4-三唑酰胺類化合物8(a-e)。

為了兼顧田間危害情況和生物學(xué)分類，本試驗(yàn)選取禾本科雜草馬唐和闊葉雜草反枝莧為供試植株［7］，活性測(cè)試結(jié)果表明，8b 和8d 對(duì)馬唐和反枝莧的根莖抑制率達(dá)到90%以上，除草活性明顯優(yōu)于對(duì)照藥劑丙炔氟草胺，因此，1,2,4-三唑酰胺是具有良好除草活性的分子骨架，氯原子取代基有利于提高化合物的除草活性。熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，化合物8b，8d 與擬南芥轉(zhuǎn)酮醇酶親和力更高，這可能是由于它們分別與轉(zhuǎn)酮醇酶形成了更穩(wěn)定的絡(luò)合物，從而導(dǎo)致它們對(duì)此酶產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制活性和結(jié)合親和力［7,20］，因此，化合物8b 和8d 有潛力作為轉(zhuǎn)酮醇酶抑制劑類除草活性先導(dǎo)化合物，值得進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化。