徐敏，王艷偉，楊光參

(溫州大學(xué) 數(shù)理學(xué)院，浙江 溫州 325035)

圖1 DMSO的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The molecular structure of DMSO

DNA是由核苷酸組成的長聚合物，其對遺傳信息進(jìn)行編碼，在許多生物過程中發(fā)揮著重要作用。DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制是維持生命延續(xù)的兩個(gè)核心且重要的過程，涉及到DNA分子的動態(tài)變化，研究DNA變性是了解這兩個(gè)過程的有效途徑。DNA變性是指當(dāng)DNA配對堿基之間的氫鍵發(fā)生斷裂時(shí)，DNA雙鏈分離成兩個(gè)單鏈，DNA的二級結(jié)構(gòu)遭到破壞。使DNA發(fā)生變性的方法主要有酸和堿[1- 2]、離子[3-4]、有機(jī)試劑[5-6]、高溫[7-8]等,一般來說，DNA可以通過加熱、化學(xué)處理(如某些有機(jī)溶劑)或其組合來變性，化學(xué)處理更便于DNA變性研究。有機(jī)溶劑二甲基亞砜(DMSO)最早于1867年由二甲硫醚氧化合成[9]，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示，DMSO分子含有硫、氧和碳原子，具有與金字塔形狀類似的結(jié)構(gòu)，硫原子在中心，而兩個(gè)甲基和氧原子則位于角落，具有一個(gè)親水亞砜基團(tuán)和兩個(gè)疏水甲基基團(tuán)，這種結(jié)構(gòu)使其同時(shí)具有親水性和疏水性。DMSO在分子生物學(xué)中具有廣泛應(yīng)用，也是DNA變性的常用化學(xué)試劑。先前有實(shí)驗(yàn)表明，至少需要體積分?jǐn)?shù)為10%的DMSO溶液才能獲得在室溫下檢測到DNA變性[10-11]。然而，近年來利用更完善的實(shí)驗(yàn)及模擬手段研究DMSO對生物大分子影響的結(jié)果表明，即使在低濃度下，DMSO也能夠?qū)σ恍┥锎蠓肿赢a(chǎn)生顯著影響[12-14]，模擬發(fā)現(xiàn)DNA甚至能在特定條件下形成Z-DNA[15]。因此，研究DMSO對DNA的影響，特別是在低濃度范圍內(nèi)的影響，有助于更好地理解DNA的變性過程。傳統(tǒng)檢測DNA變性的方法缺點(diǎn)是會隱藏DNA變性的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變過程。單分子技術(shù)如原子力顯微鏡、磁鑷、光鑷等已被廣泛應(yīng)用于研究DNA的個(gè)體分子行為[16-18]、DNA與其他金屬離子或蛋白質(zhì)等的相互作用[19-21]以及DNA的力學(xué)性質(zhì)[22]等，但有關(guān)DNA變性的研究鮮有報(bào)道，因此，利用單分子手段對DNA的變性行為進(jìn)行研究能為DNA局部變性過程以及DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在DNA代謝過程中的生理作用提供新的視角。為研究低體積分?jǐn)?shù)DMSO對DNA變性的影響，本文結(jié)合單分子原子力顯微鏡(AFM)技術(shù)與傳統(tǒng)動態(tài)光散射方法，研究了不同體積分?jǐn)?shù)DMSO致質(zhì)粒及線性DNA變性過程中的形貌及粒徑變化。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

NanoWizard Ⅲ原子力顯微鏡(德國 JPK instrument AG 公司)，NCHR-50原子力探針(瑞士Nano World 公司)，Zetasizer nano ZS90 動態(tài)光散射裝置(英國 Malvern公司)，實(shí)驗(yàn)清洗儀器和Milli-Q 純水機(jī)(美國Millipore公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

pBR322 DNA(4 361 bp)及5 000 bp DNA購自美國Thermo Fisher Scientific公司，λ-phage DNA (48 502 bp)、Tris(hydroxymethyl) aminomethane (TRIS)、(3-amino-propyl) Triethoxysilane (APTES, 純度≥99 %)及DMSO(純度≥99.8%)購自美國sigma公司，實(shí)驗(yàn)用的緩沖液為1 mmol/L TRIS-HCl(pH=7.5)緩沖液。

2 實(shí)驗(yàn)原理與方法

2.1 原子力顯微鏡

原子力顯微鏡是掃描探針顯微鏡中的一種，廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，圖2是原子力顯微鏡的工作原理圖，原子力顯微鏡使用一根具有彈性的探針來測量針尖與樣品間的相互作用力。實(shí)驗(yàn)中我們用到的是輕敲模式，輕敲模式具有相對接觸模式側(cè)向力更小、對樣品影響更小等優(yōu)點(diǎn)，所以非常適合對生物大分子、聚合物等軟物質(zhì)樣品的成像。原子力探針在320 kHz的共振頻率下驅(qū)動，成像過程中，云母表面以1.0 Hz的速率掃描。硅烷化云母片的主要優(yōu)點(diǎn)是在待測溶液pH高達(dá)10的大范圍內(nèi)仍保持質(zhì)子化(帶正電)，且不帶二價(jià)陽離子，極大地提高了使用的靈活性，對樣品產(chǎn)生的影響也非常小，其次硅烷化處理的云母片制備的樣品能夠在幾個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定。

圖2 原子力顯微鏡的工作原理圖Fig.2 The fundamental diagram of atomic force microscopy

2.2 動態(tài)光散射

圖3 動態(tài)光散射系統(tǒng)Fig.3 Dynamic light scattering system

測量納米粒子直徑的技術(shù)中，動態(tài)光散射具有快速、準(zhǔn)確、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是最受歡迎的技術(shù)之一，本實(shí)驗(yàn)用到的動態(tài)光散射系統(tǒng)如圖3所示。測量的基本原理是粒子在溶液中的布朗運(yùn)動會引起光強(qiáng)的波動，且布朗運(yùn)動的速度受粒子的大小和溶液黏度的影響，因此測量光強(qiáng)的波動隨時(shí)間的變化，然后利用斯托克斯-愛因斯坦關(guān)系，由擴(kuò)散系數(shù)d計(jì)算出粒徑及其分布。

(1)

其中，kB是玻爾茲曼常數(shù)，T是溫度，η是溶液的黏度，D是分子在溶液中的粒徑。

2.3 樣品制備

2.3.1 原子力顯微鏡樣品制備

硅烷化云母片的主要優(yōu)點(diǎn)是在待測溶液pH高達(dá)10的大范圍內(nèi)仍保持質(zhì)子化(帶正電)，且不帶二價(jià)陽離子，極大地提高了使用的靈活性，對樣品產(chǎn)生的影響也非常小，其次硅烷化處理的云母片制備的樣品能夠在幾個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定，因此用經(jīng)3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)改性的云母作為基底制備原子力顯微鏡成像樣品。樣品的制備過程如下(圖4)：將云母切成約1 cm2的方形片并貼在載玻片上；在通風(fēng)柜中通過蒸發(fā)體積分?jǐn)?shù)4%的APTES溶液4 h，對新解離的云母表面進(jìn)行APTES修飾；將處理過的云母片放入烘干箱中，在120 ℃下鈍化云母表面30 min；使用Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)配置不同體積分?jǐn)?shù)的DMSO溶液，使用時(shí)取200 μL，加入DNA，最終待測溶液的DNA質(zhì)量濃度為1 ng/μL，室溫下在微型旋轉(zhuǎn)儀上旋轉(zhuǎn)30 min，使DNA與DMSO的反應(yīng)充分且均勻；40 μL待測溶液沉積在經(jīng)APTES處理的云母上，室溫孵育3 min后除去多余溶液，目的是使DNA能夠很好地固定在云母片上以保持形態(tài)不再發(fā)生變化，并避免其余步驟對成像結(jié)果的影響；最后，用約200 μL的去離子水沖洗樣品，并用氮?dú)獯蹈?。為保證成像結(jié)果的準(zhǔn)確性，每組實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行了3次成像。

圖4 原子力顯微鏡樣品制備步驟示意圖Fig.4 Sample preparation procedure for atomic force microscope

2.3.2 動態(tài)光散射樣品制備

使用的待測液制備方法與原子力顯微鏡相同，25 ℃條件下進(jìn)行待測液的測量，每次樣品池中滴入40 μL的待測液，同一濃度的樣品至少測量3次，每次3組以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 原子力顯微鏡實(shí)驗(yàn)

通過原子力顯微鏡能夠直接觀察到DNA等生物大分子，因此為研究不同DMSO體積分?jǐn)?shù)對DNA變性的形態(tài)及結(jié)構(gòu)影響，首先利用原子力顯微鏡觀察了不同DMSO體積分?jǐn)?shù)對3種不同類型DNA的影響。

圖5顯示了云母表面環(huán)狀質(zhì)粒pBR322 DNA的原子力顯微鏡圖像，作為對照組，我們首先在與DMSO相同的緩沖條件下單獨(dú)成像DNA，圖5(a)顯示了DMSO體積分?jǐn)?shù)為0時(shí)DNA的典型環(huán)狀構(gòu)象；圖5(b)顯示了DMSO體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí)的圖像，DNA形態(tài)發(fā)生明顯改變，首先，DNA雙鏈更加柔軟，其次，可以觀察到由于變性產(chǎn)生的單鏈DNA坍塌而導(dǎo)致的局部小泡或扭結(jié)，此外，部分DNA形成超螺旋結(jié)構(gòu)；當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加至10%時(shí)，如圖5(c)所示，可以觀察到DNA分子產(chǎn)生了緊密的超螺旋結(jié)構(gòu)。

圖5 pBR322 DNA在不同DMSO體積分?jǐn)?shù)下掃描的原子力顯微鏡圖像Fig.5 AFM images of pBR322 plasmids at different volume fractions of DMSO

圖6顯示了5 000 bp線性DNA的原子力顯微鏡圖像，其長度與質(zhì)粒DNA相近。圖6(a)顯示了在DMSO體積分?jǐn)?shù)為0時(shí)，可以觀察到自然舒展的線狀DNA形態(tài)；當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)增加至1%時(shí)，如圖6(b)所示，DNA鏈交叉及重疊，形成小環(huán)及扭結(jié)；當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加至10%時(shí)，如圖6(c)所示，DNA分子結(jié)構(gòu)更加緊湊，無法清晰地觀察出其線狀結(jié)構(gòu)。

圖6 5 000 bp DNA在不同DMSO體積分?jǐn)?shù)下掃描的原子力顯微鏡圖像Fig.6 AFM images of 5 000 bp DNA at different volume fractions of DMSO

圖7顯示了λ-DNA的原子力顯微鏡圖像，圖7(a)顯示了DMSO體積分?jǐn)?shù)0時(shí)DNA自由松散的形態(tài)；圖7(b)顯示了加入DMSO體積分?jǐn)?shù)1%時(shí)，與5 000 bp線性DNA相似，DNA出現(xiàn)部分小環(huán)及扭結(jié)；當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加至10%時(shí)，如圖7(c)所示，DNA扭結(jié)更加明顯，由于DNA較長，因此仍可觀察出其線狀結(jié)構(gòu)。

圖7 λ-DNA在不同DMSO體積分?jǐn)?shù)下掃描的原子力顯微鏡圖像Fig.7 AFM images of λ-DNA at different volume fractions of DMSO

3.2 動態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)

由3.1節(jié)可見，DMSO還會使DNA的聚攏程度發(fā)生明顯變化，而粒徑大小能夠更加準(zhǔn)確且定量地反映DNA的聚攏程度，因此為驗(yàn)證并定量分析這一現(xiàn)象，使用動態(tài)光散射測量了不同DMSO濃度下三種類型DNA粒徑的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8和圖9所示。圖8為DNA的粒徑分布圖，從圖8中可以看出，隨DMSO體積分?jǐn)?shù)的增加，粒徑的峰值逐漸左移；圖9為DNA的平均粒徑隨DMSO體積分?jǐn)?shù)的變化曲線，pBR322 DNA的平均粒徑從未添加DMSO時(shí)的(474±10) nm變化至添加DMSO體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)的(257±8) nm，5 000 bp DNA的粒徑從(554±11) nm變化至(282±18) nm，λ-DNA的粒徑從(871±17) nm變化至(449±21) nm。根據(jù)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，三種類型DNA的粒徑都隨DMSO體積分?jǐn)?shù)的增加而減小，這與原子力顯微鏡觀察到的結(jié)果對應(yīng)，兩種實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論有較好的一致性；三種類型DNA平均粒徑的變化趨勢大致相同，而由于λ-DNA的長度遠(yuǎn)大于pBR322 DNA及5 000 bp DNA長度，因此粒徑也較大；pBR322 DNA與5 000 bp DNA長度相似，但環(huán)狀DNA受到連接數(shù)的限制，更易收縮并形成超螺旋結(jié)構(gòu)，因此粒徑較5 000 bp DNA偏小。

圖8 不同DMSO體積分?jǐn)?shù)下三種類型DNA的粒徑分布Fig.8 The size distribution of DNA at different DMSO volume fractions

圖9 pBR322 DNA、5 000 bp DNA及λ-DNA在不同DMSO體積分?jǐn)?shù)下的平均粒徑Fig.9 The average particle size of pBR322 DNA, 5 000 bp DNA, and λ-DNA at different volume fractions of DMSO

4 討論與結(jié)論

4.1 結(jié)果討論

利用原子力顯微鏡和動態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)，首次觀測到低體積分?jǐn)?shù)DMSO對DNA的顯著影響。首先，通過直接觀察原子力顯微鏡圖像可知低體積分?jǐn)?shù)DMSO(1%)也能使DNA發(fā)生變性，且DMSO的變性能力會隨體積分?jǐn)?shù)增加而增強(qiáng)。DMSO的變性能力可以歸因于DMSO亞砜官能團(tuán)的強(qiáng)氫鍵接受性質(zhì)和甲基的疏水性質(zhì)：DMSO與鳥嘌呤堿基的胺基通過DMSO的氧基團(tuán)與NH2的氫原子之間的氫鍵相互作用，破壞了DNA堿基配對的穩(wěn)定性，使更多單鏈區(qū)域產(chǎn)生。

其次，觀察到隨DMSO體積分?jǐn)?shù)的增加，DNA的構(gòu)象發(fā)生顯著變化，即逐漸產(chǎn)生超螺旋或扭結(jié)結(jié)構(gòu)。這些現(xiàn)象可以根據(jù)以下原因得到合理地解釋：一方面由于變性的單鏈會發(fā)生卷曲，使DNA看上去更加柔軟；另一方面根據(jù)C?lug?reanu-White-Fuller定理[23-24]：

Lk=Wr+Tw。

(2)

對于一個(gè)封閉的環(huán)狀DNA分子，兩條螺旋鏈連接在一起的次數(shù)，即DNA的連接數(shù)(Lk)是一個(gè)常數(shù)，只有通過破壞DNA骨架才能改變它。Wr為纏繞數(shù)或超螺旋數(shù)，是衡量DNA軸纏繞程度的指標(biāo)，而Tw是扭轉(zhuǎn)數(shù)，反映了DNA鏈相互之間的螺旋纏繞。因此，DMSO變性DNA產(chǎn)生的單鏈導(dǎo)致了DNA扭轉(zhuǎn)數(shù)的減少，為保持連接數(shù)不變，DNA產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)應(yīng)力增強(qiáng)了超螺旋的形成，即增加了螺旋數(shù)，形成超螺旋結(jié)構(gòu)。隨著DMSO體積分?jǐn)?shù)的增加，變性區(qū)域逐漸增多，DNA扭轉(zhuǎn)數(shù)不斷減小，螺旋數(shù)不斷增加，因此使質(zhì)粒DNA形成越來越緊密的超螺旋結(jié)構(gòu)。而對于線性DNA，鏈的兩端不能被認(rèn)為是完全自由的，因此會產(chǎn)生小環(huán)及扭結(jié)結(jié)構(gòu)。

最后，通過原子力顯微鏡的圖像觀察和動態(tài)光散射的測量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)DNA的聚攏程度也隨DMSO體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，這是由于質(zhì)粒及線性DNA超螺旋及扭結(jié)結(jié)構(gòu)的逐步形成，以及DNA單鏈區(qū)域的逐漸增加，且單鏈DNA的持久長度遠(yuǎn)小于雙鏈DNA的持久長度，會使DNA的聚攏程度發(fā)生變化。

4.2 結(jié)論

本文通過單分子技術(shù)原子力顯微鏡和傳統(tǒng)動態(tài)光散射結(jié)合，觀測了低體積分?jǐn)?shù)的DMSO致DNA變性引起的形貌結(jié)構(gòu)及粒徑的變化，較為系統(tǒng)地研究了低體積分?jǐn)?shù)的DMSO致DNA變性的過程。結(jié)果表明即使DMSO體積分?jǐn)?shù)1%也能誘導(dǎo)DNA發(fā)生局部變性；由于連接數(shù)的限制，DNA會形成DNA超螺旋及扭結(jié)結(jié)構(gòu)；同時(shí)，由于超螺旋結(jié)構(gòu)及單鏈的產(chǎn)生，DNA的聚攏程度會隨DMSO體積分?jǐn)?shù)的增加而增加。本研究可以為DNA變性的過程、DNA超螺旋結(jié)構(gòu)在DNA代謝過程中的生理作用以及低體積分?jǐn)?shù)的DMSO對DNA的影響等方面的研究提供新的視角及理論指導(dǎo)。