陳先意 曲紹軒 駱昕 李輝平 林金盛 蔣寧 侯立娟 馬林 劉慧芹

摘要：為探究熒光假單胞菌MS82中GGDEF結(jié)構(gòu)域基因?qū)-di-GMP調(diào)控細菌生物被膜形成及運動能力的影響，通過抑菌圈法、小試管法、96微孔板法以及運動性平板分別檢測GGDEF缺失突變體MT5092、MT0189、MT19和MS82野生型菌株之間的相關(guān)生命活動能力的差異。結(jié)果顯示，GGDEF缺失突變型菌株MT5092、MT0189、MT19的抑菌活性、生物被膜形成能力、運動能力（游泳運動、集群運動及抽搐運動）皆低于突變前的MS82野生型菌株，且突變株與野生株的抑菌活性存在極顯著差異（P<0.01）;36 h的生物被膜形成能力存在極顯著差異;運動行為存在不一致的顯著（P<0.05）或極顯著差異。最終得出結(jié)論：缺失GGDEF結(jié)構(gòu)域基因會降低胞內(nèi)c-di-GMP濃度水平，進而影響MS82菌株的生物膜及運動行為。

關(guān)鍵詞：生防細菌MS82;GGDEF結(jié)構(gòu)域基因;生物被膜;運動性

中圖分類號：S942.3;S182 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2022）11-0104-04

收稿日期：2021-09-09

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金（編號：31901933）;天津市科技計劃（編號：20YDTPJC01330）;天津農(nóng)學院研究生科研創(chuàng)新項目（編號：2020XY005）;天津市高校中青年骨干創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃（編號：J01009030709）。

作者簡介：陳先意（1997—），女，上海人，碩士研究生，從事植物病理學研究。E-mail：1156561293@qq.com。

通信作者：劉慧芹，博士，教授，從事植物病害生防研究及生防菌劑研發(fā)，E-mail：wjxlhq@126.com;馬 林，博士，研究員，從事食用菌栽培和病蟲防控研究，E-mail：malin1590@sina.com。

環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）是一種廣泛存在于細菌中的保守第二信使，作為關(guān)鍵因素調(diào)控著菌落形態(tài)、細胞周期、細胞分化、生物被膜的形成與擴散、鞭毛與菌毛介導的細胞運動行為、細胞毒力、抗性分泌等重要生命活動。大量試驗證明，假單胞菌屬菌株胞內(nèi)c-di-GMP的濃度水平，受到DGCs（二鳥苷酸環(huán)化酶）的催化核心，同時也是DGCs與2分子GTP結(jié)合形成c-di-GMP的重要結(jié)合位點——GGDEF結(jié)構(gòu)域的調(diào)控。對c-di-GMP調(diào)控生物膜的研究中發(fā)現(xiàn)，高濃度的c-di-GMP會促進胞外多糖產(chǎn)生和生物膜形成量的增加，同時抑制細菌運動行為;而低水平的c-di-GMP有利于鞭毛介導的細菌運動卻不利于生物被膜的形成。在探索熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是否符合此結(jié)論時，選取的試驗對象 Pf0-1 菌株相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，缺失了含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的RapA基因后，細胞內(nèi) c-di-GMP 水平降低并對生物膜形成具有抑制作用，卻沒有發(fā)現(xiàn)影響胞外多糖產(chǎn)生或鞭毛介導的運動性的證據(jù)。

MS82菌株是一株從土壤中發(fā)現(xiàn)的熒光假單胞菌，對引起食用菌菌種菌料污染、繼而引發(fā)寄生性病害的綠色木霉（Trichoderma viride）具有良好的抑菌作用。突變體MT19是通過隨機突變方式獲得的一株GGDEF結(jié)構(gòu)域基因破壞菌株，并導致其抑菌活性完全喪失。然而，該基因的突變是否對生物被膜形成能力和運動性方面的具體調(diào)控造成影響尚不清楚。

為探索GGDEF結(jié)構(gòu)域基因在MS82菌株中對 c-di-GMP 調(diào)控生物被膜及運動行為的影響，本研究對熒光假單胞菌MS82菌株中3個與c-di-GMP代謝相關(guān)的GGDEF結(jié)構(gòu)域基因進行研究，檢測MS82野生株與3株不同GGDEF結(jié)構(gòu)域突變株（MT5092、MT0189：基因重組菌株、MT19：隨機突變菌株）之間的抑菌活性、生物被膜形成量、運動行為等表型差異，進一步探究熒光假單胞菌中c-di-GMP調(diào)控生物被膜及運動性之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和供試菌株

生防菌：MS82野生型菌株（P. fluorescens），突變型菌株MT5092、MT0189、MT19;病原菌：綠色木霉。所有菌株均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所提供。試驗于2020年10月至2021年8月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所食用菌研究課題組研究室內(nèi)開展。

1.1.2 相關(guān)培養(yǎng)基制備

LB培養(yǎng)基（1 L）：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl;

LB固體培養(yǎng)基（1 L）：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl、15 g瓊脂;

氨芐液體培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基成分中加入0.1% 50 μg/mL 氨芐青霉素（Amp）;

氨芐固體培養(yǎng)基：在LB固體培養(yǎng)基成分中加入0.1% 50 μg/mL Amp;

游泳運動（swimming motility）培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基成分中加入0.3 %瓊脂粉;

集群運動（swaming motility）培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基成分中加入0.7%瓊脂粉、0.5%葡萄糖;

抽搐運動（twitching motility）培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基成分中加入3%瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備

MS82、MT5092、MT0189、MT19菌株在氨芐固體培養(yǎng)基上活化，28℃倒置培養(yǎng) 16 h。選擇單菌落重新劃線，28℃倒置培養(yǎng)16 h。將各菌株單菌落接入5 mL LB培養(yǎng)基中，28℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h，4℃、4 000 r/min離心 3 min，棄上清，用無菌水將菌體重懸并稀釋至吸光度D=0.05，備用。

1.2.2 突變體抑菌能力測定

采用抑菌圈法測定：分別取10 μL制備好的菌液置于LB固體培養(yǎng)基中心，待菌液晾干后，用小噴壺噴適量用無菌水稀釋的綠色木霉孢子懸浮液（孢子濃度2億CFU/mL），28℃倒置培養(yǎng)2 d，測量各菌株抑菌圈直徑。

1.2.3 c-di-GMP相關(guān)基因生物膜形成測定

采用小試管法與96微孔板法測定c-di-GMP對生物膜形成的影響。

（1）小試管法：分別在含有 5 mL LB培養(yǎng)基的滅菌試管中加入5 μL各菌株菌液，28℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)16 h后，靜置36 h。1%結(jié)晶紫染色后，觀察管內(nèi)形成染色環(huán)狀物的顏色深淺。

（2）96微孔板法：96孔板中每孔加入100 μL的LB培養(yǎng)基及各菌株備用菌液10 μL，28℃靜置孵育，分別于12、24、36 h取出。1%結(jié)晶紫染色后，加入 100 μL 33%乙酸溶解30 min。以LB培養(yǎng)基為參比，用紫外分光光度計在熒光假單胞菌最大吸光波長590 nm處測定菌液吸光度D。

1.2.4 c-di-GMP相關(guān)基因運動能力測定

本研究運動能力檢測方法對謝杰鵬等的方法進行改進。

（1）游泳運動能力測定：各菌株分別取10.0、2.5 μL 菌液，接種在泳動培養(yǎng)基表面正中間，28℃培養(yǎng) 24 h 后，觀察以接種中心蔓延的云霧狀區(qū)域，測量該區(qū)域的直徑。

（2）集群運動能力測定：分別吸取10.0、2.5 μL 菌液接種在集群運動培養(yǎng)基表面中心，28℃恒溫培養(yǎng) 24 h 后，觀察以接種中心生長蔓延的區(qū)域，測量該區(qū)域的直徑。

（3）抽搐運動能力測定：用無菌牙簽蘸取各菌株菌液，接種在抽搐運動培養(yǎng)基底部，28℃恒溫培養(yǎng) 48 h 后，輕輕揭去培養(yǎng)基，用0.9%生理鹽水沖洗培養(yǎng)皿底部未黏附的細菌，1%結(jié)晶紫溶液染色后，觀察以細菌接種點為中心形成的區(qū)域，測量該區(qū)域的直徑。

1.2.5 統(tǒng)計學方法

每組處理設(shè)置3個重復，測量數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)軟件進行單因素方差分析計（ANOVA），采用LSD-Tamhane's T2 進行兩兩比較。數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均數(shù)±標準差（x±s）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌能力分析

抑菌圈法產(chǎn)生的透明抑菌圈直徑越大，則表明該菌株的抑菌活性越強，反之越弱。MS82野生型菌株和3個GGDEF結(jié)構(gòu)域基因突變體菌株對綠色木霉的抑菌活性如圖1所示，可以看出，3個突變體菌株的抑菌活性均有不同程度的降低。其中MT19完全喪失抑菌能力，無抑菌圈產(chǎn)生;MT5092與M0189產(chǎn)生的抑菌圈均極顯著小于MS82野生型（P<0.01）。4個菌株的抑菌活性依次為MS82>MT0189>MT5092>MT19。

2.2 生物被膜形成能力差異分析

MS82菌株中3個含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的基因分別被突變后，生物被膜的形成能力表現(xiàn)出了明顯的變化。從小試管法的試驗結(jié)果（圖2）可以看出，MS82菌株的菌體生物膜經(jīng)過染色后顏色比3個突變菌株深，且環(huán)狀完整，表明生成的細菌數(shù)量多，生物被膜形成量多，生物被膜形成能力強。96微孔板法試驗結(jié)果（圖3）與圖2一致，即3個基因突變后的生物被膜形成能力明顯變?nèi)?，且隨著時間的延長，差異逐漸增大;同時3個突變菌株的生物被膜形成能力隨時間延長，逐漸趨于一致。

2.3 運動性能力差異分析

2.3.1 游泳運動

具有鞭毛的細菌在液體中借助鞭毛的旋轉(zhuǎn)，使菌體能定向泳動，在培養(yǎng)基表面表現(xiàn)為類圓形云霧狀擴散。圖4試驗結(jié)果表明，點樣10.0 μL時各菌株的游泳圈直徑大于點樣2.5 μL時，3株缺失GGDEF結(jié)構(gòu)域基因的突變型菌株擴散直徑小于野生型，表現(xiàn)出游泳運動缺陷。不同點樣量下，MS82野生型菌株與3株突變型菌株之間均表現(xiàn)為極顯著差異。MS82、MT5092、MT0189、MT19 這4個菌株的泳動能力強弱呈現(xiàn)依次下降的趨勢。

2.3.2 集群運動

細菌在高密度下會發(fā)生集群運動，在相應培養(yǎng)基上出現(xiàn)以接種點為中心向外蔓延的生長區(qū)域，生長區(qū)域直徑越大，表明細菌的集群運動能力越強。對比數(shù)據(jù)（圖5）發(fā)現(xiàn)，點樣10.0、2.5 μL 時各菌株之間的差異性一致。野生型MS82菌株的生長區(qū)域直徑顯著或極顯著大于基因突變后的3個突變菌株。說明含有GGDEF結(jié)構(gòu)域基因的缺失影響了MS82菌株的集群運動能力。

2.3.3 抽搐運動

通過刺傷試驗檢測細菌的抽搐運動能力時，會在培養(yǎng)基與底部培養(yǎng)皿之間形成淺白色的位移區(qū)域。觀察試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于突變型菌株，野生型菌株MS82向四周發(fā)生的位移距離更大，且位移邊緣不平整，表明有繼續(xù)向外發(fā)生位移的趨勢，而突變型菌株發(fā)生的位移距離小，邊緣光滑呈類圓形。進一步分析數(shù)據(jù)（圖6）可知，突變株MT0189位移距離雖然變小但與野生株之間無顯著性差異;突變株MT5092位移區(qū)域顯著減小，約為野生株的1/2;突變株MT19位移區(qū)域極顯著減小，幾乎不發(fā)生位移。

3 討論

c-di-GMP作為細菌內(nèi)調(diào)節(jié)多細胞行為的調(diào)節(jié)因子，胞內(nèi)濃度水平由該系統(tǒng)的上下游信號分別調(diào)節(jié)，并影響細菌不同的生命活動。濃度低時，上游合成信號DGCs與2分子GTP在GGDEF結(jié)構(gòu)域的活性部位結(jié)合形成c-di-GMP，提高胞內(nèi)c-di-GMP濃度水平，促進生物被膜的形成;濃度高時，多余的c-di-GMP會與GGDEF結(jié)構(gòu)域的抑制位點相結(jié)合，或被特異性磷酸二酯酶（PDEs）感知并分解，抑制生物被膜的形成。同時，細胞的運動行為的表達在生物被膜形成過程中是相互聯(lián)系、共同參與的。c-di-GMP在高水平下限制細胞的運動行為，進而有利于形成生物被膜;相反c-di-GMP在低水平下，有利于鞭毛介導的運動行為，不利于生物被膜的形成。

c-di-GMP信號系統(tǒng)接收到環(huán)境信號會使熒光假單胞菌產(chǎn)生包括2，4-二乙酰基間苯三酚、藤黃綠膿菌素、硝吡咯菌素、氫氰酸等多種能夠防治病原微生物的抑菌物質(zhì)。此前在對熒光假單胞菌喪失GGDEF結(jié)構(gòu)域的突變體MT19進行抑菌活性測定時，MT19表現(xiàn)出明顯的抑菌活性缺陷。本試驗在此基礎(chǔ)上進一步探究對比同源重組突變株MT5092、MT0189的抑菌活性，試驗結(jié)果顯示，抑菌活性同樣有所降低，符合此前得到的結(jié)論，說明缺失GGDEF結(jié)構(gòu)域會降低c-di-GMP濃度，進而抑制抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。與此同時，發(fā)現(xiàn)2株同源重組菌株的抑菌活性比MT19強，推測可能是不同突變方式及位點導致的基因型存在內(nèi)在差異，因此在抑菌活性表型上也存在一定的差異。

另外，通過誘變熒光假單胞菌F113獲得缺失GGDEF結(jié)構(gòu)域的WspR蛋白突變體，該突變體的運動能力強于野生型菌株，生物膜形成能力受到抑制。但在本次試驗中，同源重組突變菌株MT5092、MT0189以及隨機突變株MT19的游泳運動、集群運動、抽搐運動等運動行為及生物被膜形成能力都有所下降，與其他菌株如鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）ATCC17978、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）ATCC4356、普城沙雷氏菌（Serratia puccinia）G3、天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）等菌株相關(guān)試驗中所得到的結(jié)果相符，卻與F113菌株的試驗結(jié)論略有不同。同時，發(fā)現(xiàn)2株同源重組菌株的運動能力比隨機突變株MT19強，且兩者同源重組菌株MT5092與MT0189之間也存在一定差異，推測同樣可能是基因位點不同導致的表達存在差異。

本試驗主要通過對比3個缺失GGDEF結(jié)構(gòu)域基因的突變株MT5092、MT0189、MT19與MS82野生型菌株對綠色木霉的抑菌能力、生物被膜形成能力、運動行為能力，發(fā)現(xiàn)缺失GGDEF結(jié)構(gòu)域?qū)-di-GMP信號系統(tǒng)調(diào)控細菌抑菌物質(zhì)合成、生物被膜形成及運動能力存在抑制作用。為更深入地探索GGDEF結(jié)構(gòu)域?qū)-di-GMP調(diào)控生物被膜與運動性能力之間的關(guān)系，下一步將通過基因互補試驗驗證突變菌株的抑菌活性、生物被膜形成及運動能力的變化驗證其基因功能。

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